人泌尿系统病原菌感染临床诊断的免疫荧光诊断试剂及其制备和应用方法
【专利摘要】本发明公开了一种人泌尿系统病原菌感染临床诊断的免疫荧光诊断试剂及其制备和应用方法，属于带有荧光标记的免疫化学试剂。其是以泌尿系统感染的致病原菌株，制备单克隆抗体或多克隆抗体，然后将抗体与荧光纳米量子点材料经酰胺脱水缩合，连接为荧光纳米量子点抗体复合物，可直接用于对载体材料上已包被了未知抗原如待测患者标本样品检测，或预先包被在载体材料上对抗原检测，这样设计的本发明，具有对不同病原菌感染泌尿系统疾病检测特异性强、性质稳定；操作使用便捷，检测快速、准确、检测时间短等特点。有效的指导临床医生准确用药，减少抗生素滥用，降低患者的诊断检测及治疗费用。从而产生良好的经济效益和社会效益。
【专利说明】人泌尿系统病原菌感染临床诊断的免疫荧光诊断试剂及其制备和应用方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及带有荧光标记的免疫化学试剂。具体是人泌尿系统病原菌感染临床诊断的免疫荧光诊断试剂及其制备和应用方法。
【背景技术】
[0002]泌尿系感染是由致病原，包括致病细菌、霉菌、真菌、病毒、病原虫等，而以致病菌感染为主要感染源。可引发肾盂肾炎、膀胱炎、尿道炎等病的总称。近年来，随着环境条件、免疫抑制剂使用、激素及介入技术等医疗手段的广泛应用，导致泌尿系感染的发病率日益上升，据报道，泌尿系感染发病率仅次于呼吸道感染。病原菌常由于患者免疫功能下降而侵入泌尿系统引起原发和继发性尿路感染。其典型的临床表现为发热，尿频、尿急、尿痛、排尿困难等膀胱刺激症状和耻骨上压痛等，严重者可发生菌血症和急、慢性肾功能不全甚至威胁患者生命。所以一旦病人发生了泌尿系感染，就有必要尽可能快速和准确地确定该致病菌的种类、性质和药敏检测结果，以便临床医师选择最有效的治疗方案进行治疗。
[0003]病原微生物检测技术诞生已愈百年，但至今临床上的主流检测方法仍是基于细菌培养的菌种鉴定，这种传统方法虽具有灵敏度好，准确度高的优点，但是缺点也很明显，就是存在方法步骤多，检测所需时间长等问题。一般的大肠杆菌培养结果需要3天时间才能有明确的结果。但是临床上有很多感染患者迫切者需要快速、明确其致病菌的种类，以便临床医师尽快地选用敏感的抗生素进行对症治疗。尤其是那些因某些较为罕见的高耐药性病原菌所引发的凶险感染，正是由于无法迅速的明确致病菌，从而导致医师仅能使用一些广谱的抗生素进行治疗，这种疗效往往不尽如人意。所以，研制致病原快速、高效、准确的检测方法，具有广泛的重要意义。
[0004]近些年以来，由于生命科学的迅猛发展，各种各样的检测方法层出不穷。如基因探针检测法，聚合酶链反应法，电阻电导检测法，微量热法，免疫磁性微球法等一系列理化和免疫学方法。但是，在实际检测中也还存在着不少问题使这些方法都未得到临床的大规模应用，主要问题有:操作复杂、对仪器要求高、测试时间相对较长、费用较高等等。因此，开发新型的快速、高效、准确的检测方法的意义就不言而喻了。
【发明内容】
[0005]本发明就是为了解决现有技术中，操作复杂、对仪器要求高、测试时间相对较长、费用较高等问题，而提供一种人泌尿系统病原菌感染临床诊断的免疫荧光诊断试剂及其制备和应用方法。
[0006]一种人泌尿系统病原菌感染临床诊断的免疫荧光诊断试剂，其是以引发人泌尿系统感染的致病菌为抗原，制备单克隆抗体或多克隆抗体，该抗体与粒径0.1- 1.0微米的荧光纳米材料经缩合连接连接为荧光纳米量子点抗体复合物，直接用于对未知抗原的检测，或包被在载体材料上，荧光纳米量子点材料激发光波长为200nm - 700nm。
[0007]—种人泌尿系统病原菌感染临床诊断的免疫荧光诊断试剂的制备方法，其步骤为:
①.制备抗体
取人泌尿系统感染患者病样标本，分离病原菌抗原标准株，确定其菌属性；
扩大病原菌的培养，制备可溶性抗原；并以该抗原为致敏源，免疫动物，制备特异性多克隆抗体，或利用体外培养细胞融合技术制备特异性单克隆抗体；
②荧光纳米材料和抗体的酰胺脱水缩合
a.将粒径0.1- 1.0微米的荧光纳米量子点材料Img溶于无离子水500ul内，制成荧光纳米量子点溶液；
b.另将1-3-二甲氨基丙基-3-乙基碳二亚胺(EDC)与无离子水按lmg/lml浓度比的溶液200ul与上述荧光纳米量子点溶液混合后，于4°C摇床反应15-20分钟，再加入N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)与0.5mg NHS/Iml无离子水浓度比的溶液200ul反应30分钟；
c.然后按lmg/ml的浓度比加入纯化后的上述抗体100-150ul反应,置于4°C摇床过夜，即得到酰胺脱水缩合后的荧光纳米量子点抗体复合物溶液，直接用于对未知抗原的检测，或包被于载体材料。
[0008]一种人泌尿系统病原菌感染临床诊断的免疫荧光诊断试剂的应用方法，
a.过滤包被:用2ml注射器吸取Iml待测尿液样品，经直径Icm且内置0.22微米滤膜的组装式滤器过滤，取出滤膜，置载玻片上，风干30分钟，使菌体固定在膜片上；
b.在膜片上滴加200ul荧光纳米量子点抗体复合物溶液，37°C，孵育Ih；
c.洗涤:每次用2mlPBS洗涤，洗3次，洗去未结合多余抗体；
d.观察:将膜片置于荧光显微镜下，或荧光检测仪，或激发不同波长的便携式激发光源仪器，如紫外显示器，以相关波长观察荧光发光的留存结果。
[0009]这样设计的本发明，具有对不同病原菌感染泌尿系统疾病检测特异性强、性质稳定；操作使用便捷，检测快速、准确、检测时间短等特点。有效的指导临床医生准确用药，减少抗生素滥用，降低患者的诊断检测及治疗费用。从而产生良好的经济效益和社会效益。
【专利附图】
【附图说明】
[0010]图1是假生殖道棒杆菌菌株16S rDNA的系统发育树不意图；
图2是临床标本假生殖道棒杆菌免疫荧光诊断检测图；
图3是金黄葡萄球菌菌株16S rDNA的系统发育树示意图；
图4是临床标本金黄葡萄球菌菌免疫荧光诊断检测图。
【具体实施方式】
[0011]下面结合附图及实施例对本发明进行详细的说明。
[0012]实施例一:假生殖道棒杆菌免疫荧光诊断试剂的制备
I)菌株分离:为检验科经泌尿系感染患者尿液中采集病原菌标本。经细菌血培养基平板划线培养24h获得标准菌株。经检验科细菌检测仪检测初步证实为致病菌株。(原初始检测为大肠杆菌)2)菌株鉴定:形态学及生理生化指标鉴定，主要测定项目包括:细胞形态，芽孢，革兰氏染色，触酶，运动性，M.R.，脲酶，丙二酸利用，碳源利用(木糖，蔗糖，甘露醇，山梨醇，海藻糖)，葡萄糖产酸产气等。测定结果见表1:
表1假生殖道棒杆菌菌株的形态学及生理生化特征
【权利要求】
1.一种人泌尿系统病原菌感染临床诊断的免疫荧光诊断试剂，其特征在于:以引发人泌尿系统感染的致病菌为抗原，制备单克隆抗体或多克隆抗体，该抗体与粒径0.1- 1.0微米的荧光纳米量子点材料经缩合连接为荧光纳米量子点抗体复合物，直接用于对未知抗原的检测，或包被在载体材料上，荧光纳米量子点材料激发光波长为200nm - 700nm。
2.根据权利要求1所述人泌尿系统病原菌感染临床诊断的免疫荧光诊断试剂，其特征在于:所述的载体材料是高分子材料制备的微孔滤膜材，或片材，或棒材；或PVC材料制备的24孔板，或96孔板，或平皿，或反应碟。
3.根据权利要求2所述人泌尿系统病原菌感染临床诊断的免疫荧光诊断试剂，其特征在于:所述高分子材料制备的微孔滤膜材孔径0.22 - 0.45微米。
4.如权利要求1所述一种人泌尿系统病原菌感染临床诊断的免疫荧光诊断试剂的制备方法，其特征在于: ①.制备抗体 取人泌尿系统感染患者病样标本，分离病原菌抗原标准株，确定其菌属性； 扩大病原菌的培养，制备可溶性抗原；并以该抗原为致敏源，免疫动物，制备特异性多克隆抗体，或利用体外培养细胞融合技术制备特异性单克隆抗体； ②荧光纳米量子点材料和抗体的酰胺脱水缩合 a.将粒径0.1- 1.0微米的荧光纳米量子点材料Img溶于无离子水500ul内，制成荧光纳米量子点溶液； b.另将ImgEDC /Iml无离子水浓度的EDC溶液200ul与上述荧光纳米量子点溶液混合后，于4°C摇床反应15-20分钟，再加入0.5mg NHS/Iml无离子水浓度的NHS溶液200ul反应30分钟； c.然后按lmg/ml的浓度加入纯化后的上述①抗体100-150ul反应,置于4°C摇床过夜，即得到酰胺脱水缩合后的荧光纳米量子点抗体复合物溶液，直接用于对未知抗原的检测，或包被于载体材料。
5.根据权利要求4所述人泌尿系统病原菌感染临床诊断的免疫荧光诊断试剂的制备方法，其特征在于:荧光纳米量子点材料是非金属量子点荧光材料，或金属量子点荧光材料，或贵金属纳米团簇荧光材料，荧光纳米量子点的粒径:0.1- 1.0微米。
6.根据权利要求4所述人泌尿系统病原菌感染临床诊断的免疫荧光诊断试剂的制备方法，其特征在于:荧光纳米量子点材料的激发光波长为200nm - 700nm波长范围内的自发荧光物质或人工合成的荧光物质。
7.根据权利要求4所述人泌尿系统病原菌感染临床诊断的免疫荧光诊断试剂的制备方法，其特征在于:荧光纳米量子点材料的荧光发光色为蓝色，或绿色，或橙色，或红色。
8.根据权利要求4所述人泌尿系统病原菌感染临床诊断的免疫荧光诊断试剂的制备方法，其特征在于:所述的病原菌是细菌、真菌、霉菌中的任意一种。
9.一种人泌尿系统病原菌感染临床诊断的免疫荧光诊断试剂的应用方法，其特征在于: a.过滤包被:用2ml注射器吸取Iml待测尿液样品，经直径Icm且内置0.22微米滤膜的组装式滤器过滤，取出滤膜，置载玻片上，风干30分钟，使菌体固定在膜片上； b.在膜片上滴加200ul荧光纳米量子点抗体复合物溶液，37°C，孵育Ih；C.洗涤:每次用2ml PBS洗涤，洗3次，洗去未结合多余抗体；d.观察:将膜片置于荧光显微镜下，或荧光检测仪，或激发不同波长的便携式激发光源仪器，如紫外显示器，以相关波长观察荧光发光的留存结果。
【文档编号】G01N33/577GK103499685SQ201310481151
【公开日】2014年1月8日 申请日期:2013年10月15日 优先权日:2013年10月15日
【发明者】牛远杰, 陈家童, 蒋宁, 尚芝群, 喻其林, 刘越 申请人:牛远杰, 陈家童, 蔣宁, 尚芝群, 喻其林, 刘越