基于上转换的新型光控活细胞染色方法及应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种基于上转换纳米颗粒的光控染料释放并对活细胞进行革E1向着色 的新方法，属生物技术和医学领域。
【背景技术】
[0002] 细胞染色技术是生命科学、基础医学和诊断学等领域非常重要的科研和临床诊断 的手段之一。但是在活细胞中，普通染料（如罗丹明和4'，6-二脒基-2-苯基吲哚等）很难 通过细胞膜，使得活细胞的着色非常困难，所以传统细胞染色过程中，常常需要先用甲醛、 丙酮等化学试剂将细胞固定，再用染料对细胞进行着色，这些化学试剂通常会破坏细胞 膜，这一过程也就导致了细胞的死亡，无法实现活细胞的生理状态的观察。
[0003] 目前，虽然在细胞染色过程中也出现了一些新型的活细胞染色试剂，可以顺利穿 透细胞膜（比如钙黄绿素）来实现对活细胞的着色，但这些染料在释放时也常存在"着色时 间和剂量不可控，半衰期短，无细胞特异性，无法对完整生物体进行着色"等缺陷，导致在细 胞染色时常需要将组织块或者细胞群落分散成游离的单个细胞，再对其进行着色。这种染 色方法对细胞着色无特异性，无法区分出正常细胞和肿瘤细胞，并且只能对细胞进行一次 染色，而对分裂、增殖细胞的染色效果不理想。因此研制新型的活细胞染色技术，实现对活 细胞乃至活体特异部位着色的新型染色技术具有重要的科研和临床应用价值。
【发明内容】
[0004] 根据现有技术的不足，我们提出新型染料技术，主要集中于如何有效向活细胞中 投递任意染料，并实现染料的定位定量释放。
[0005] 具体技术方案如下：
[0006] 本发明的基于上转换的光控活细胞染色方法；步骤如下：
[0007] 1)利用纳米级染料载体系统，将细胞浆染料或者细胞核染料包裹进入纳米颗粒的 介孔中成为一个染料库；
[0008] 2)利用染料载体系统表面的靶向修饰功能，通过主动靶向作用将染料输送到所需 细胞和组织；
[0009] 3)利用纳米颗粒中的上转换核心作为光源转换器，将近红外光转换成原位的紫外 光和可见光，位于纳米载体表面的大量光感分子在紫外光和可见光的驱动下构象发生反复 变化，从而促进分子马达的运转。本发明便可以通过控制近红外光的照射部位和时间来选 择性地将纳米颗粒内的有机染料释放出来，最终实现靶向细胞的可控制性着色。
[0010] 所述的纳米颗粒；其包括稀土上转换纳米颗粒子核；核外包裹介孔二氧化娃壳 层；壳层表面修饰光敏分子偶氮苯及祀向叶酸分子。
[0011] 本发明所述的纳米颗粒制备方法，步骤如下：
[0012] (1)按照质量分数比为氯化钇：氯化镱：氯化铥=(500~750) : (150~250) :0· 3 将原料加入到反应器中，然后向反应器中加入溶剂水使上述物质完全溶解；在磁力搅拌条 件，加热至沸腾，直至稀土盐溶液变成白色固体；
[0013] (2)水蒸干后，冷却至60~80°C，按照体积比为油酸：十八烯=2~3:1将二者加 入反应器中使白色固体完全溶解；
[0014] (3)按照质量数为NaOH:氟化铵=1~6 :3将二者加入的反应器中加入甲醇使 其完全溶解，氟化铵与上述氯化铥的质量比=3:1 ;调节温度升温到120~150°C，抽真空 30~50min，通氩气；迅速升温到260~300°C，维持反应1~3h;结束后加入丙酮离心纯 化，真空干燥处理后得到稀土上转换纳米颗粒。
[0015] 所述的包裹介孔二氧化硅壳层的制备方法：采用公开的常津，王汉杰等发明（公 开号：CN104771756A)，化疗用稀土上转换光控药物释放纳米制剂及其制备方法：
[0016] (1)取稀土上转换纳米颗粒：十六烷基三甲基溴化铵：氢氧化钠=1:(50~200): (5~20)将原料加入到反应器中，然后向反应器中加入水使上述物质完全溶解，磁力搅拌 条件下加热到50~80°C，搅拌1~2h;
[0017] (2)然后加入正硅酸乙酯，其中正硅酸乙酯与稀土上转换纳米颗粒的质量比= 0.01~0.5:1;反应1~2h后，离心纯化；
[0018] (3)将（2)中的颗粒分散到乙醇中，加入氯化钠作为除模板剂，其中氯化钠与颗粒 的质量比=10~50 :1，磁力搅拌条件下加热到50~80°C，搅拌3~9h;反应完全后离心 纯化，产物真空干燥处理后得到介孔硅壳层包覆的上转换纳米颗粒。
[0019] 本发明所述的壳层表面修饰光敏分子偶氮苯及靶向叶酸分子的方法，步骤如下：
[0020] ⑴按照物质的质量分数比为4-苯偶氮苯甲酰氯：叶酸：3_氨丙基三乙氧基硅烷 =1:(1~50):(1~6)将原料加入到反应器中，然后向反应器中加入溶剂二甲基亚砜将上 述物质完全溶解，避光条件下搅拌5~10h;
[0021] (2)接着加入按照质量份数比碳二亚胺：N-羟基琥珀酰亚胺=0· 4:0. 4~0· 8,其 中碳二亚胺与4-苯偶氮苯甲酰氯的质量份数比为0. 4 :1，继续搅拌3~9h后离心纯化，得 到表面修饰光敏分子偶氮苯及靶向叶酸分子壳层。
[0022] 本发明所述纳米颗粒装载有机染料的步骤如下：
[0023] (1)按照物质的质量分数比为上转换纳米纳米颗粒：有机染料=1~10:1加入到 反应器中，然后向反应器中加入二甲基亚砜溶剂将上述物质完全分散；
[0024] (2)在磁力搅拌条件下，搅拌6~12h，然后离心纯化，最终得到上转换光控染料释 放的纳米载体，产物真空干燥处理，得到颗粒尺寸为80~150nm的纳米载体。
[0025] 本发明所述基于上转换纳米颗粒的染色方法，步骤如下：
[0026] 1)将制备好的上转换光控纳米染料载体颗粒与待染色活细胞共培养0.5~2h;
[0027] 2)当纳米染料载体在靶向分子叶酸的作用下特异性地聚集到肿瘤部位后，给予具 有组织穿透性的近红外激光照射；
[0028] 3)穿透深部组织的激光被上转换纳米核捕获，在该部位产生相应的紫外光和可见 光；
[0029] 4)紫外光和可见光被纳米载体表面的光敏小分子偶氮苯吸收后，其构象发生反复 变化，促进分子马达运转，从而控制染料的释放。
[0030] 上述步骤中称取物质的质量为毫克级（mg)，称取的体积为毫升级（ml)。
[0031] 本发明提供了一种上转换光控染料释放纳米载体的制备方法。如图3所示，其主 要涉及三个部分内容即1)稀土上转换纳米颗粒的合成；2)稀土上转换纳米颗粒包覆介孔 硅壳层及表面光敏分子和靶向分子的修饰以及有机染料的包埋。组装得到的稀土上转换光 控染料释放的纳米载体的结构稳定，粒径均一，具有靶向定位，光控释放等优点。
[0032] 本发明首先，如图4透射电镜测试结果显示，利用溶剂热法制备稀土上转换纳米 颗粒（A)粒径小于50nm，粒度分布均勾，制备的稀土上转换光控染料释放纳米颗粒（B)粒 径小于l〇〇nm，粒度分布均勾。如图5焚光发射光谱分析所示，制备的稀土上转换纳米载体 颗粒能够在近红外光照射下，发出多重颜色的光如紫外光和蓝光等。如图6明场及暗场条 件下照片显示，上转换纳米载体的宏观照片（A)和近红外照射条件下的荧光照片（B)。如 图7进行细胞毒性实验结果表明，制备的上转换纳米载体的细胞毒性非常低。如图8装载 有DAPI细胞核染料的纳米载体对人宫颈癌细胞（Hela细胞）进行着色，当给予近红外光照 射以后细胞的着色效果更加明显（C图）。
[0033] 二、本发明的有益效果：
[0034] 1)本发明涉及的稀土上转换光控染料释放纳米载体系统的主要优势包括：操作 简便，适用性强，成本低，在水中具有较好的分散性，能够同时实现染料在肿瘤组织处的定 时、定量和定位释放。
[0035] 2)本发明涉及的稀土上转换光控染料释放的纳米载体的主要性能指标包括：a) 有效粒径在80~150nm之间，粒径更均匀，且可以根据载体的组成成分，实验条件等进行调 节；b)稳定性好，可在水溶液中保存至少2个月以上；c)表面含有大量靶向分子叶酸，易于 载体在肿瘤组织处的聚集；d)整个制备过程简单快捷，制备周期短，产率高，适合大批量生 产。
[0036] 本发明同传统的化疗载体相比具有如下优势：
【附图说明】
[0038] 图1 :稀土上转换纳米载体吸收近红外光转换为紫外光和可见光的并激活偶氮苯 分子马达启动的作用机理图。
[0039] 图2 :上转换纳米载体光控染料释放的作用机理图。
[0040] 图3 :上转换光控染料释放纳米载体的制备方法流程图。
[0041] 图4:按照实施例1合成的稀土上转换纳米颗粒（A)和按照