入400mg制备好的介孔娃壳层包覆的上转换纳米颗粒，反应9h后离心纯化， 得到表面功能化修饰的稀土上转换纳米颗粒包覆介孔娃壳层的纳米颗粒，产物真空干燥处 理后保存。
[0098] c)细胞核染料的装填：
[0099] (1)称取5mg4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI)染料，将上述两种原料加入9ml 乙醇溶液中。
[0100] (2)磁力搅拌条件下，搅拌12h，然后离心纯化，最终得到稀土上转换光控染料释 放的纳米载体，产物真空干燥处理后保存。
[0101] 实施例7:
[0102] 形态观察、粒径及其分布测定。取样品溶液经超速离心分离后，取出沉淀物，加蒸 馏水少量使分散，滴于碳支持膜上制样，在透射电镜下观察其形貌状态并拍照。透射电镜下 观察到化疗用稀土上转换光控药物释放纳米制剂颗粒呈均匀规则的球形粒子。实验测得的 化疗用稀土上转换光控药物释放纳米制剂粒径分布均勾，在80~150nm范围内可控。所制 得的纳米粒子如图4所示。
[0103] 实施例8 :
[0104] MTT法测试光控热疗用靶向稀土上转换-金核壳纳米制剂的细胞毒性：
[0105] 1)取处于对数生长期的小鼠成纤维细胞，0.125%胰蛋白酶消化后充分吹打成单 细胞悬液，计数后调整细胞浓度为5X104/ml。
[0106] 2)向96孔板的每孔中加入100μ1细胞悬液，在37°C，5%C02培养箱中培养24h。
[0107] 3)将120μ1含有一定浓度的化疗用稀土上转换光控药物释放纳米制剂溶液加入 到新鲜培养基中，并在37°C，5% 0)2培养箱中通细胞共培养24h。
[0108] 4)24h后取出培养板，向每个孔中加入10μ1MTT溶液，在37°C，5%C02培养箱中 继续培养4h后，小心吸取培养孔中的培养基，向每个孔中加入200μ1DMS0 (二甲基亚砜） 溶液，在摇床上摇动20min，使DMS0溶液充分地溶解Formazan晶体。
[0109] 5)用酶联免疫检测仪在570nm波长处，以空白管调零，测定各孔的吸光值A，按下 式计算细胞存活率。每组设8个平行，计算其平均值。
[0110] 细胞存活率（％ )=实验细胞组吸光值（A2)/空白细胞组吸光值（Al)*100%
[0111] 实施例9:
[0112] 装载有DAPI细胞核染料的纳米载体对活的Hela细胞进行着色：
[0113] 1)将Hela按1X105细胞/孔均匀铺在24孔细胞培养板中，在37°C，5%C02培养 箱中培养24小时。
[0114] 2)取0. 1毫克按实施例3制备的纳米载体，加入至0. 5毫升的DMEM细胞培养液中 充分混匀。
[0115] 3)取出细胞培养板，吸去培养液，每孔加入2)中的纳米载体和细胞培养液，于 37°C，5%C02培养箱中继续培养4h后，用3. 5W的980nm近红外光间歇照射5分钟，然后再 静止10分钟，最后小心吸取培养孔中的培养基，向每个孔中加入1毫升PBS清洗3遍，在荧 光显微镜下检测细胞核的着色情况。
[0116] 图8 :装载有DAPI细胞核染料的纳米载体对人宫颈癌细胞（Hela细胞）进行着色， 当给予近红外光照射后细胞的着色效果。
【主权项】
1. 一种基于稀土上转换光控染料投递的纳米颗粒；其特征是包括稀土上转换纳米颗 粒子核；核外包裹介孔二氧化娃壳层；壳层表面修饰光敏分子偶氮苯及祀向叶酸分子。2. 如权利要求1的稀土上转换光控染料投递纳米载体转换方法，其特征是步骤如下： 1) 将制备好的上转换光控纳米染料载体颗粒通过静脉注射或局部注射的方式给药； 2) 当纳米染料载体在靶向分子叶酸的作用下特异性地聚集到肿瘤部位后，给予具有较 强组织穿透性的近红外激光的照射； 3) 穿透深部组织的激光被上转换纳米核捕获，在该部位产生相应的紫外光和可见光； 4) 紫外光和可见光被纳米载体表面的光敏小分子偶氮苯吸收后，其构象发生反复变化 并充当一个分子马达的作用，从而控制染料的释放。3. 权利要求1的稀土上转换光控染料投递纳米载体制备方法，其特征是步骤如下： 1) 稀土上转换纳米颗粒的合成：利用各种稀土盐为原料，通过溶剂热制备出稀土上转 换纳米颗粒； 2) 稀土上转换纳米颗粒外包覆介孔硅壳：采用溶胶凝胶法合成介孔硅层； 3) 进行娃壳层表面光敏分子和革E1向分子的修饰：将叶酸革E1向分子和光敏偶氮苯分子 连接在介孔娃壳层的表面； 4) 将有机染料染料包埋到上转换纳米载体介孔中。4. 如权利要求3所述的方法，其特征是所述的稀土上转换纳米颗粒的合成方法如下： (1) 按照质量分数比为氯化钇：氯化镱：氯化铥=(500~750) : (150~250) :0. 3将原 料加入到反应器中，然后向反应器中加入溶剂水使上述物质完全溶解；在磁力搅拌条件，加 热至沸腾，直至稀土盐溶液变成白色固体； (2) 水蒸干后，冷却至60~80°C，按照体积比为油酸：十八烯=2~3:1将二者加入反 应器中使白色固体完全溶解； ⑶按照质量数为NaOH:氟化铵=1~6 :3将二者加入的反应器中加入甲醇使其完全 溶解，氟化铵与上述氯化镑的质量比=2~3:1 ;调节温度升温到120~150°C，抽真空30~ 50min，通氩气；迅速升温到260~300°C，维持反应1~3h;结束后加入丙酮离心纯化，真空 干燥处理后得到稀土上转换纳米颗粒。5. 如权利要求3所述的方法，其特征是所述上转换纳米颗粒外包覆介孔硅壳的制备方 法如下： (1) 按照物质的质量份数比为稀土上转换纳米颗粒：十六烷基三甲基溴化铵：氢氧化 钠=1 : (50~200) : (5~20)将原料加入到反应器中，然后向反应器中加入水使上述物质 完全溶解，磁力搅拌条件下加热到50~80°C，搅拌1~2h; (2) 然后加入正硅酸乙酯，其中正硅酸乙酯与稀土上转换纳米颗粒的质量比=0. 01~ 0. 5 :1 ;反应1~2h后，离心纯化； (3) 将（2)中的全部颗粒分散到乙醇中，加入氯化钠作为除模板剂，其中氯化钠与颗粒 的质量比=10~50 :1，磁力搅拌条件下加热到50~80°C，搅拌3~9h;反应完全后离心 纯化，产物真空干燥处理后得到介孔硅壳层包覆的上转换纳米颗粒。6. 如权利要求3所述的方法，其特征是所述娃壳层表面光敏分子和革E1向分子的修饰的 方法，其特征是步骤如下： (1)按照物质的质量分数比为4-苯偶氮苯甲酰氯：叶酸：3_氨丙基三乙氧基硅烷=1 : (1~50) : (1~6)将原料加入到反应器中，然后向反应器中加入溶剂二甲基亚砜将上述物 质完全溶解，避光条件下搅拌5~10h; (2) 接着加入按照质量份数比碳二亚胺：N-羟基琥珀酰亚胺=0. 4:0. 4~0. 8,其中碳 二亚胺与4-苯偶氮苯甲酰氯的质量份数比为（0, 1~0. 4) :1，继续搅拌3~9h; (3) 然后加入介孔硅壳层包覆的上转换纳米颗粒，其中纳米颗粒与4-苯偶氮苯甲酰氯 的质量比=10~50 :1，反应5~10h后离心纯化，得到稀土上转换光控染料释放纳米载体。7.如权利要求3所述的方法，其特征是所述有机染料染料包埋到上转换纳米载体介孔 中的方法：步骤如下： (1) 按照物质的质量分数比为上转换纳米载体：有机染料=1~10:1加入到反应器 中，然后向反应器中加入二甲基亚砜溶剂将上述物质完全分散； (2) 在磁力搅拌条件下，搅拌6~12h，然后离心纯化，最终得到上转换光控染料释放的 纳米载体，产物真空干燥处理，得到颗粒尺寸为80~150nm的纳米载体。
【专利摘要】本发明涉及一种基于上转换的新型光控活细胞染色方法及应用。本发明的技术方案包括三方面：1)稀土上转换纳米颗粒的合成：首先利用稀土盐为原料，通过溶剂热法制备出稀土上转换纳米颗粒。2)介孔硅壳层包覆的上转换纳米颗粒及表面光敏分子和靶向分子的修饰：采用模板法在上转换纳米颗粒外层包覆介孔硅，接着用偶氮苯和叶酸对其进行修饰。3)有机染料的包埋:将有机染料包埋至介孔中。本发明的优势：1)具有靶向作用，能够实现在肿瘤部位的精准定位。2)只有当外界980nm近红外光照射时，染料才能被释放，从而实现肿瘤部位的精准定时、定量着色。3)该染料投递载体可循环使用，以减少原料的使用及降低能耗，从而降低成本。
【IPC分类】A61K9/51, A61P35/00, A61K31/519, A61K41/00, A61K49/00
【公开号】CN105251005
【申请号】CN201510789352
【发明人】常津, 郑斌, 王汉杰, 张莹, 侯贝贝, 张博
【申请人】天津大学
【公开日】2016年1月20日
【申请日】2015年11月17日