本发明的优选方案，所述抗鼠二抗为羊抗鼠IgG抗体或兔抗鼠IgG抗体或驴 抗鼠IgG抗体。
[002引作为本发明的优选方案，所述金标复溶液的质量体积百分比组成为；0. 29%十二 水合磯酸氨二钢，0. 02%磯酸二氨钟，0. 02%二水合磯酸二氨钢，0. 8%氯化钢，5% -20%庶 糖，0. 5% -5%牛血清白蛋白，0. 1%叠氮钢。
[0029] 本发明中，采用非诺特罗偶联抗原I进行免疫制备的抗非诺特罗单克隆抗体对于 非诺特罗的特异性要好于采用非诺特罗偶联抗原II进行免疫制备的抗非诺特罗单克隆抗 体，其是通过W下对比实验得出的。
[0030] W载体蛋白选用牛血清白蛋白为例，选用6周龄BALB/C雌性小鼠作为免疫动物， 将非诺特罗偶联抗原I -牛血清白蛋白，非诺特罗偶联抗原II -牛血清白蛋白分别按照相 应的免疫剂量，即100 y g/只/次与等量弗氏完全佐剂乳化完全后采用皮下分点注射；每间 隔3周进行一次加强免疫，共进行4次免疫；加强免疫是将非诺特罗偶联抗原I -牛血清白 蛋白，非诺特罗偶联抗原II -牛血清白蛋白分别与弗氏不完全佐剂乳化完全后，采用皮下 分点注射。详情如下表中所示：
[0031]
【主权项】
1. 一种非诺特罗的胶体金检测卡，其特征在于：包括卡壳及设置于卡壳内的试纸条， 所述试纸条上沿液体流动方向依次设置有样本垫、金标结合物垫、硝酸纤维素膜、吸水垫， 所述金标结合物垫上包被有抗非诺特罗单克隆抗体-胶体金结合物，所述抗非诺特罗单克 隆抗体-胶体金结合物中的抗非诺特罗单克隆抗体是以非诺特罗偶联抗原I为免疫抗原 制备的，所述硝酸纤维素膜上邻近金标结合物垫的一端设置有检测线，且硝酸纤维素膜上 邻近吸水垫的一端设置有质控线，所述检测线上包被有非诺特罗偶联抗原II，所述质控线 上包被有抗鼠二抗。
2. 根据权利要求1所述的非诺特罗的胶体金检测卡，其特征在于：所述卡壳由底卡及 面卡构成，且卡壳由塑料材料制成。
3. 根据权利要求2所述的非诺特罗的胶体金检测卡，其特征在于：所述面卡上开有加 样孔，所述加样孔位于样本垫的上方。
4. 根据权利要求2所述的非诺特罗的胶体金检测卡，其特征在于：所述面卡上开有观 察窗，所述观察窗位于硝酸纤维素膜的上方。
5. -种非诺特罗的胶体金检测卡制备方法，其特征在于：包括以下步骤： 一、金标结合物垫的制备： a、 合成非诺特罗偶联抗原I :取载体蛋白，用双蒸水溶解后，再用NaOH调pH至10,加 入1，4- 丁二醇二缩水甘油醚，在氮气保护下，避光搅拌24小时，通过柱层析纯化制得接臂 载体蛋白，所述1，4-丁二醇二缩水甘油醚与蛋白载体的摩尔比为100 :1，将非诺特罗调成 碱性后，在搅拌条件下缓慢加入到接臂载体蛋白中，氮气保护下室温避光搅拌24小时，反 应产物在4°C用0. Olmol/L的磷酸盐缓冲液透析3天，透析后得到非诺特罗偶联抗原I ; b、 免疫动物：将上述步骤a中制成的非诺特罗偶联抗原I与等量弗氏完全佐剂乳化完 全后，免疫小鼠； c、 细胞融合和杂交瘤细胞筛选：取经非诺特罗偶联抗原I免疫的小鼠脾细胞与SP2/0 骨髓瘤细胞进行融合，并采用HAT培养基进行培养，对培养上清进行检测，筛选获得稳定分 泌抗非诺特罗单克隆抗体的细胞株14F8-B3-C9 ; d、 制备腹水：将分泌抗非诺特罗单克隆抗体的细胞株14F8-B3-C9培养后，注射入 BALB/C小鼠腹腔，收集其腹水； e、 抗非诺特罗单克隆抗体的纯化制备：采用硫酸铵沉淀法对腹水进行透析、过滤处理， 采用非诺特罗亲和层析柱对经透析、过滤处理的上清进行纯化，提纯制备出抗非诺特罗单 克隆抗体； f、 胶体金溶液制备：在超纯水中加入1 %氯金酸，加热煮沸，迅速加入1 %柠檬酸三钠， 继续煮沸15分钟，所述超纯水、氯金酸、柠檬酸三钠的体积比为99 :1 :1，冷却后用超纯水恢 复至原来的体积，4°C保存备用； g、 抗非诺特罗单克隆抗体-胶体金结合物溶液的制备：将胶体金溶液调PH至6. 0后， 用20 μ g/mL浓度的抗非诺特罗单克隆抗体反应1小时，然后用10%牛血清白蛋白进行封 闭，4°C 7500g离心30分钟，去上清，胶体金沉淀用1/10胶体金体积的金标复溶液进行溶 解，制成抗非诺特罗单克隆抗体-胶体金结合物溶液，所述胶体金溶液、抗非诺特罗单克隆 抗体、牛血清白蛋白的体积比为100 :10 :5 ; K制备金标结合物垫：将上述制备的抗非诺特罗单克隆抗体-胶体金结合物溶液以 4. L/cm喷量喷涂于结合物垫上，37度干燥3小时后，放于湿度低于20 %的干燥柜保存备 用； 二、 硝酸纤维素膜的制备： a、 合成非诺特罗偶联抗原II :将对氨基苯甲酸、亚硝酸钠溶于pH2. 0的溶液中，在冰浴 和避光条件下磁力搅拌反应4小时，制得重氮盐，所述对氨基苯甲酸、亚硝酸钠的质量比为 1 :2,将该重氮盐与非诺特罗反应，生成非诺特罗衍生物，产物经柱层析纯化，将纯化后的非 诺特罗衍生物与载体蛋白按摩尔比50:1，采用EDC/NHS法合成非诺特罗偶联抗原II，然后 在4°C用0. Olmol/L磷酸盐缓冲液透析3天，得到纯化的非诺特罗偶联抗原II ; b、 制备硝酸纤维素膜：以0. Olmol/L，pH7. 4的磷酸盐缓冲液为稀释液，将非诺特罗偶 联抗原II稀释至〇. 5mg/mL，并以1 μ L/cm喷量喷涂于硝酸纤维素膜的一端作为检测线，将 抗鼠二抗稀释至1.0mg/mL，并以lyL/cm喷量喷涂于硝酸纤维素膜的另一端作为质控线， 37 °C干燥2小时后，密封，室温保存备用； 三、 非诺特罗的胶体金检测卡的组装： 在底板上依次粘贴样本垫、金标结合物垫、硝酸纤维素膜、吸水垫从而组装成试纸条， 所述硝酸纤维素膜包被非诺特罗偶联抗原II的一端搭接金标结合物垫，且硝酸纤维素膜包 被抗鼠二抗的一端搭接吸水垫，将试纸条剪切成一定宽度后装于卡壳中。
6. 根据权利要求5所述的一种非诺特罗的胶体金检测卡制备方法，其特征在于：所述 载体蛋白为牛血清白蛋白或阳离子化牛血清白蛋白或卵清蛋白或钥孔血蓝蛋白。
7. 根据权利要求5所述的一种非诺特罗的胶体金检测卡制备方法，其特征在于：所述 抗鼠二抗为羊抗鼠 IgG抗体或兔抗鼠 IgG抗体或驴抗鼠 IgG抗体。
8. 根据权利要求5所述的一种非诺特罗的胶体金检测卡制备方法，其特征在于：所述 金标复溶液的质量体积百分比组成为：〇. 29%十二水合磷酸氢二钠，0. 02%磷酸二氢钾， 0.02%二水合磷酸二氢钠，0.8%氯化钠，5 % -20 %蔗糖，0.5% -5%牛血清白蛋白，0. 1% 叠氮钠。
【专利摘要】本发明公开一种非诺特罗的胶体金检测卡及其制备方法，包括卡壳及设置于卡壳内的试纸条，试纸条上沿液体流动方向依次设置有样本垫、金标结合物垫、硝酸纤维素膜、吸水垫，金标结合物垫上包被有抗非诺特罗单克隆抗体-胶体金结合物，抗非诺特罗单克隆抗体-胶体金结合物中的抗非诺特罗单克隆抗体是以非诺特罗偶联抗原Ⅰ为免疫抗原制备的，硝酸纤维素膜上邻近金标结合物垫的一端设置有检测线，且硝酸纤维素膜上邻近吸水垫的一端设置有质控线，检测线上包被有非诺特罗偶联抗原Ⅱ，质控线上包被有抗鼠二抗。本发明制备的非诺特罗的胶体金检测卡具有成本低、灵敏度高、操作简便、无需仪器、特异性强、稳定性好、结果准确、易于判读、可现场检测等优点。
【IPC分类】G01N33-558, G01N33-577
【公开号】CN104569408
【申请号】CN201410844525
【发明人】徐波, 熊勇华, 刘春梅, 李林, 杨晓慧
【申请人】无锡中德伯尔生物技术有限公司
【公开日】2015年4月29日
【申请日】2014年12月30日