专利名称：一种基因工程细胞及其在nk细胞扩增中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及疾病免疫治疗，尤其涉及NK细胞免疫治疗中NK细胞的体外制备。
背景技术：
NK细胞(natural killer cell,自然杀伤细胞)是一类大颗粒淋巴细胞,是机体固有免疫和适应性免疫的重要桥梁，在机体抗感染性疾病和恶性肿瘤免疫监视过程中发挥重要作用。继发性NK细胞移植能产生良好的抗肿瘤效应，而其自身很少被受体排斥，且不会引起任何 GVHD (Graft Versus Host Disease)。因此，继发性 NK 细胞治疗(Adoptive NKcell therapy)已成为目前最热门和最有前途的恶性肿瘤治疗方法之一。尽管继发性NK细胞免疫治疗具有良好的抗肿瘤效应和巨大的应用前景，但NK细胞免疫治疗仍然难以进行常规临床应用，其中最主要障碍在于，在外周血单核细胞(PBMC)中，NK细胞只是一个很小的群体，仅占人外周血单核细胞的10 15%，难以满足巨大的临床需要。为解决这一难题，首先要在数量上保证NK细胞的有效供给。因此，探索各种有效的NK细胞体外扩增(Ex vivo expansion)方法已成为NK细胞免疫治疗的必然趋势。应用基因工程细胞(Gene engineering cells, GEC)作为饲养细胞(feedercell)进行NK细胞体外扩增是一种重要的NK细胞扩增新策略。在以往的研究中有研究者应用CD64、CD86修饰K562细胞构建人工抗原递呈细胞(Antigen present cell, aAPC)，然后将 4-1BBL (CD137L)和膜固定 IL15 (membrane-bound IL-15, mIL-15)等导入此细胞中，构建⑶64-⑶86-4-lBBL-mIL15-aAPC，并利用此人工抗原递呈细胞进行NK细胞体外扩增，这种方法可以获得较强细胞毒性的NK细胞，但NK细胞增殖受到限制，5-6周后细胞不再扩增。本发明中，我们通过基因工程技术将4-1BBL和膜固定IL21 (mbIL_21)直接修饰到K562细胞表面，构建4-lBBL-mbIL-21-GEC。与以往的人工抗原递呈细胞相比，本发明更加简单和易于操作。研究表明，4-lBBL-mbIL-21-GEC可以诱导产生大规模功能性的NK细胞，在NK细胞免疫治疗临床应用和科学研究中具有重大应用价值。
发明内容
本发明的目的是，提供一种基因工程细胞。本发明的第二个目的是，提供一种基因工程细胞的制备方法。本发明的第三个目的是，提供一种基因工程细胞在NK细胞扩增中的应用。本发明的第四个目的是，提供一种NK细胞扩增方法。为了解决本发明第一个目的，本发明提供了一种基因工程细胞，所述基因工程细胞为4-lBBL-mbIL-21-GEC，其细胞膜表面稳定表达4-1BB配体和膜固定白介素21(mbIL-21)。作为一个优选，所述基因工程细胞为4-lBBL-mbIL-21-K562细胞。为了解决本发明第二个目的，本发明提供了基因工程细胞的制备方法，包括以下步骤(1)构建4-1BBL表达的转座子；
(2)4-lBBL转座子与转座酶SBll共转染相应细胞，流式细胞分选，获得4-1BBL稳定表达细胞 4-1BBL-GEC ；
(3)在步骤(2)获得的4-1BBL-GEC基础上导入在细胞膜表面稳定表达的IL-21(membrane-bound IL-21, mbIL-21),建立 4-lBBL-mbIL_21 -GEC0作为一个优选，所述基因工程细胞为4-lBBL-mbIL-21-K562细胞。为了解决本发明第三个目的，本发明提供了基因工程细胞在NK细胞扩增中的应用。为了解决本发明第四个目的，本发明提供了一种NK细胞扩增方法，利用上述基因工程细胞进行扩增，包括以下步骤
(1)构建4-1BBL表达的转座子；
(2)4-lBBL转座子与转座酶SBll共转染相应细胞，流式细胞分选，获得4-1BBL稳定表达细胞 4-1BBL-GEC ；
(3)在步骤(2)获得的4-1BBL-GEC基础上导入在细胞膜表面稳定表达的IL-21(mbIL-21)，建立 4-lBBL-mbIL-21 -GEC ；
(4)致死性照射或丝裂霉素处理步骤(3)获得的基因工程细胞，按2:I与外周血单核细胞混合，在NK细胞扩增培养液中共培育；
(5)每周重复刺激I次，连续数周，以获得足够量的NK细胞。作为一个优选，所述基因工程细胞为4-lBBL-mbIL-21-K562细胞。本发明的优点在于，为建立一种高效和高细胞毒性的NK细胞体外扩增方法，我们通过在细胞膜表面稳定表达4-1BB配体(4-1BBL)和膜固定白介素21 (mbIL-21 )，构建新型基因工程细胞4-lBBL-mbIL-21-GEC，如4-lBBL-mbIL-21_K562细胞，以此作为扩增的饲养细胞，从外周血单核细胞中直接扩增NK细胞，而不是先构建人工抗原递呈细胞，然后在此基础上遗传修饰。与以往的人工抗原递呈细胞相比，本发明更加简单和易于操作。流式细胞分析、细胞毒性试验等表明所扩增的NK细胞纯度好、细胞毒性强，具有明显的肿瘤细胞杀伤效应。本发明提供的NK细胞扩增方法简单、易于操作；扩增效率好、纯度高；扩增持续时间长、肿瘤细胞杀伤效应明显。
图I为本发明的工作示意图。
图2为4-1BBL和mbIL-21在4-lBBL-mbIL-21_K562基因工程细胞中的表达。
图3为扩增细胞中NK细胞的纯度(W代表扩增周数)。
图4为扩增细胞的总数目。
图5为扩增前后NK细胞的受体表达(W代表扩增周数，O W代表PBMC)。
图6为扩增前后NK细胞的肿瘤细胞杀伤效率。
图7为STAT3抑制剂JSI-124抑制扩增NK细胞受体表达。
图8为STAT3抑制剂JSI-124损害扩增NK细胞的形态、增殖和细胞杀伤效力。
具体实施方式
下面结合附图对本发明提供的4-lBBL-mbIL-21-K562的制备方法和NK细胞扩增方法的具体实施方式
做详细说明，图I为本发明的工作示意图。实施例I、基因工程细胞4-lBBL-mbIL-21_K562的制备方法
I.从 Open Biosysems (Thermo Fisher Scientific, CO, USA)购买 4-1BBL/PCR4TOPO质粒，PCR扩增，然后插入GlySer-EGFP (CoOp)-pSBSO睡美人表达载体的Nhe I-XhoI位点，构建4-lBBL/pSBSO转座子。2.将4-lBBL/pSBSO转座子与转座酶SBll共转染K562细胞，流式细胞分选，获得4-1BBL 稳定表达的 K562 细胞(4-1BBL-K562)。3.将 IL-21-Fc (CoOp)-pSBSO 与转座酶 SBll 共转染 4-1BBL-K562 细胞，流式细胞分选，建立4-lBBL-mbIL-21-K562基因工程细胞。流式细胞分析证实4-lBBL-mbIL-21_K562细胞表面有明显的4-1BBL和IL-21的表达(图2)。实施例2、NK细胞扩增方法
I.从 Open Biosysems (Thermo Fisher Scientific, CO, USA)购买 4-1BBL/PCR4TOPO质粒，PCR扩增，然后插入GlySer-EGFP (CoOp)-pSBSO睡美人表达载体的Nhe I-XhoI位点，构建4-lBBL/pSBSO转座子。2.将4-lBBL/pSBSO转座子与转座酶SBll共转染K562细胞，流式细胞分选，获得4-1BBL 稳定表达的 K562 细胞(4-1BBL-K562)。3.将 IL-21-Fc (CoOp)-pSBSO 与转座酶 SBll 共转染 4-1BBL-K562 细胞，流式细胞分选，建立4-lBBL-mbIL-21- K562基因工程细胞。4.用淋巴细胞分离液分离人外周血单核细胞。5. IOOGy放射线照射构建的基因工程细胞，或15ug/mL丝裂霉素处理构建的基因工程细胞4小时；之后，细胞用PBS洗2 3次。6.预处理过的基因工程细胞与淋巴细胞按2:1混合，在含有10%FBS、1% P/S、2 mML-谷氨酰胺、50U/ml IL-2的RPMI1640培养液中于5% CO2培养箱中共培育，每2天更换新
鲜培养基一次。7.按步骤5和6程序每周重复刺激扩增后细胞I次。8.在不同时间点，检测NK细胞纯度(见图3)、细胞总数目(见图4)、NK细胞表面受体表达(见图5)和对肿瘤细胞的杀伤效力(见图6)。实施例3、NK细胞扩增机理研究
I.从 Open Biosysems (Thermo Fisher Scientific, CO, USA)购买 4-1BBL/PCR4TOPO质粒，PCR扩增，然后插入GlySer-EGFP (CoOp)-pSBSO睡美人表达载体的Nhe I-XhoI位点，构建4-lBBL/pSBSO转座子。2.将4-lBBL/pSBSO转座子与转座酶SBll共转染K562细胞，流式细胞分选，获得4-1BBL 稳定表达的 K562 细胞(4-1BBL-K562)。3.将 IL-21-Fc (CoOp)-pSBSO 与转座酶 SBll 共转染 4-1BBL-K562 细胞，流式细胞分选，建立4-lBBL-mbIL-21- K562基因工程细胞。4.用淋巴细胞分离液分离人外周血单核细胞。5. IOOGy放射线照射构建的基因工程细胞，或15 μ g/mL的丝裂霉素处理构建的基因工程细胞4小时；之后，细胞用PBS洗2 3次。
6.预处理过的基因工程细胞与淋巴细胞按2:1混合，在含有10%FBS、1% P/S、2 mML-谷氨酰胺、50U/ml IL-2的RPMI1640培养液中于5% CO2培养箱中共培育，每2天更换新
鲜培养基一次。7. I周后按步骤5和6程序重复刺激扩增后细胞。8. I周后按步骤5和6程序重复刺激步骤7所得扩增细胞，设2个组，在培养基中分别加入O. I μ M的JSI-124和等体积的DMSO09.第3天流式细胞分析检测NK细胞受体表达(图7)，第5天在相差显微镜下观察NK细胞形态并拍照(图8Α)，第0、3、7天计数NK细胞数目(图8Β)，第7天检测NK细胞对肿瘤细胞的杀伤效力(图8C)。通过构建4-lBBL-mbIL_21- K562新型基因工程细胞，以此作为扩增的饲养细胞，从外周血单核细胞中直接扩增NK细胞。细胞计数、流式细胞分析、细胞毒性试验等表明细胞扩增倍数高、NK细胞纯度好、细胞毒性强，具有明显的肿瘤细胞杀伤效应。进一步的机理研究表明，本发明所诱导的NK细胞扩增是STAT3依赖性的，抑制STAT3磷酸化将损害NK细胞的扩增。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，如用其它类型的细胞如721. 22UU937等细胞替代K562细胞，用其它方式实现4-1BBL和mbIL-21在细胞膜表面的表达，在4-1BBL和mbIL-21基础上再修饰其它基因，应用其它组织来源细胞如脾细胞进行扩增，对扩增条件和程序进行改进等等，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
权利要求
1.一种基因工程细胞，其特征在于，所述基因工程细胞为4-lBBL-mbIL-21-GEC，其细胞膜表面稳定表达4-1BB配体和膜固定IL-21。
2.根据权利要求I所述的一种基因工程细胞，其特征在于，所述基因工程细胞为4-lBBL-mbIL-21-K562 细胞。
3.权利要求I所述的基因工程细胞的制备方法，其特征在于，包括以下步骤(I)构建4-1BBL表达的转座子；(2)4-lBBL转座子与转座酶SBll共转染相应细胞，流式细胞分选，获得4-1BBL稳定表达细胞 4-1BBL-GEC ；(3)在步骤(2)获得的4-1BBL-GEC基础上导入在细胞膜表面稳定表达的IL-21，建立4-lBBL-mbIL-21-GEC。
4.根据权利要求3所述的基因工程细胞的制备方法，其特征在于，所述基因工程细胞为 4-lBBL-mbIL-21-K562 细胞。
5.权利要求I或2所述的基因工程细胞在NK细胞扩增中的应用。
6.一种NK细胞扩增方法，其特征在于，利用权利要求I所述基因工程细胞进行扩增，包括以下步骤(1)构建4-1BBL表达的转座子；(2)4-lBBL转座子与转座酶SBll共转染相应细胞，流式细胞分选，获得4-1BBL稳定表达的细胞4-1BBL-GEC ；(3)在步骤(2)获得的4-1BBL-GEC基础上导入在细胞膜表面稳定表达的IL-21，建立4-lBBL-mbIL-21 -GEC ；(4)致死性照射或丝裂霉素处理步骤(3)获得的基因工程细胞，按2:I与外周血单核细胞混合，在NK细胞扩增培养液中共培育；(5)每周重复刺激I次，连续数周，以获得足够量的NK细胞。
7.根据权利要求6所述的一种NK细胞扩增方法，其特征在于，所述基因工程细胞为4-lBBL-mbIL-21-K562 细胞。
全文摘要
本发明公开了一种基因工程细胞及其在NK细胞扩增中的应用，提供了一种高效和高细胞毒性的自然杀伤(NK)细胞体外扩增方法。通过基因工程技术在细胞膜表面稳定表达4-1BB配体(4-1BBL)和膜固定白介素21(mbIL-21)，构建4-1BBL-mbIL-21-基因工程细胞(4-1BBL-mbIL-21-GeneEngineeringCells,4-1BBL-mbIL-21-GEC)，如4-1BBL-mbIL-21-K562细胞等，以此作为扩增的饲养细胞，从外周血单核细胞中直接扩增NK细胞，更加简单和易于操作。细胞计数、流式细胞分析、细胞毒性试验等研究表明细胞扩增倍数高，NK细胞纯度好、细胞毒性强、具有明显的肿瘤细胞杀伤效应。
文档编号C12N5/0783GK102911918SQ20121023702
公开日2013年2月6日 申请日期2012年7月10日 优先权日2011年12月29日
发明者朱诗国, 王艳丽 申请人:上海交通大学医学院