专利名称：一种诊断绵羊肺腺瘤病毒的重组蛋白抗原及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种重组蛋白抗原及其制备方法。
背景技术：
绵羊肺腺瘤病(OPA)是由外源性的绵羊肺腺瘤病毒(exJSRV)引起的肺脏和支气管上皮细胞的癌变，发病年龄是2月龄-11岁龄但以2-4岁龄为主，该病的特征性症状是在肺部产生大量的泡沫状乳白色或粉红的液体，当羊低头或“小推车”试验时液体从鼻孔流出，羊出现该临床症状后在数日后死亡或在运动、寒冷刺激后突然死亡。OPA早在19世纪早期就已发现，但至今尚无有效阻止其传播的方法，给许多国家的绵羊养殖业造成了重大损失。我国于1951年在兰州首次发现，1958年传入新疆，之后又传播到内蒙、青海等省份。由于没有有效便捷的OPA实验室检测手段，只能通过病理解剖和组织切片、免疫组化等方法确诊，我国只有个别省市有OPA的流行病学记录。目前国内外都未发现能让该病毒在体外高效稳定表达的细胞系，也未分离到JSRV的纯病毒，这给JSRV分子生物学特性的进一步研究及实验室诊断造成了很大的困难，关于OPA的实验室检测方法很少且多侧重于PCR方法，ELISA检测方法国内外各有一篇相关报道。CA蛋白(衣壳蛋白)抗原性强且十分保守，在创建JSRV分子生物学检测方法上具有很大的优势。目前国内关于CA蛋白表达方面的研究较少且表达技术不成熟，只针JSRV-NM株的1116-1664这548bp区段成功分段表达出CA蛋白，对该区段完整CA基因只表达出抗原性、免疫原性不强的截短蛋白。
发明内容
本发明提供一种诊断绵羊肺腺瘤病毒的重组蛋白抗原及其制备方法，目的是表达出完整的未被截短的CA蛋白，提高抗原性。本发明诊断绵羊肺腺瘤病毒的重组蛋白抗原的氨基酸序列如SEQ ID N0:1所示。本发明诊断绵羊肺腺瘤病毒的重组蛋白抗原的制备方法，按以下步骤进行一、提取自然感染OPA的绵羊的肺脏基因组DNA，以提取的基因组DNA为模板进行PCR扩增，将PCR扩增产物用I %琼脂糖凝胶电泳检测，然后采用胶回收试剂盒进行纯化，获得目的基因；二、将目的基因与PEASY Simple Cloning Vector克隆载体进行连接，将产物转化到tranS5a感受态细胞中进行蓝白筛选，次日，挑取白色单菌落接种到含0. lmg/mLAmp的LB培养基中，于37°C振动培养8h，然后使用质粒提取试剂盒提取重组质粒并进行测序鉴定；三、将鉴定正确的重组质粒和表达载体pET-28a分别用限制性内切酶EcoR I和Xho I进行双酶切，将酶切后的重组质粒和酶切后的表达载体pET-28a用T4连接酶连接，将连接产物转化到补充稀有密码子的transetta感受态细胞中，次日，挑取单菌落接种在含0. 05mg/mL Kan的LB培养液中，于37°C振动培养8h，然后使用质粒提取试剂盒提取质粒并进行测序鉴定；四、将鉴定正确的阳性菌接种到LB培养基中，在37°C、185r/min摇床培养至菌液0D600达到0. 6 0. 8，然后向菌液中加入IPTG使IPTG终浓度为0. 4mmol/L，再于30°C、185r/min诱导5h,然后于4°C、5000r/min离心15min,取沉淀,用PBS洗漆沉淀3次，洗完后用PBS溶解沉淀并进行超声处理，超声结束后于4°C、10000r/min离心5min，吸取上清，然后用KCl染色切胶纯化法进行纯化，即获得重组蛋白；其中步骤一中PCR 扩增所用上游引物 FC 为 5' -CCGGAATTCATGCCTGTCTTTGAAAATAACAACC-3'，下游引物 RC 为 5' -CCGCTCGAGTTAAGCAATGCCTTGCATGTA-3'。本发明根据GenBank上公布的内蒙株JSRV(GenBank登录号为DQ838494)的CA段选择非跨膜、无信号肽及抗原性强的特意性区域设计特异性引物，以自然感染OPA绵羊的肺脏DNA作模板通过PCR扩增获得目的基因片段(1041-1700区段，共660bp)，并对该区段碱基进行密码子分析，结果该区段含有大量稀有密码子，选择补充了稀有密码子的表达感受态进行表达，得到了大小约28KD的蛋白，共220个氨基酸，并以以上清形式表达，为进一 步建立绵羊肺腺瘤病毒抗原的ELISA检测方法及疫苗的研发奠定了良好的基础。本发明的优点包括I、本发明获得的重组蛋白大小约为28KD，共220个氨基酸，以上清形式表达，生物活性好，纯化后抗原浓度为1.455mg/mL。2、内蒙株JSRV毒株来源于内蒙自然感染绵羊肺腺瘤病的无角道赛特种羊的肺脏，对于以后检测国内JSRV更有优势。3、根据病毒入侵机体后立即反转录成DNA插入到宿主核DNA中并以此形式稳定存在这个生活史，以自然感染OPA绵羊肺脏DNA为模板，解决了 JSRV RNA单链易突变、易降解、难提取的问题。4、在感受态不能提供基因翻译所需的密码子时，该密码子就会被随机替换造成翻译错误或者直接中断。本发明使用补充了 JSRV毒株CA基因所需的稀有密码子的表达感受态，解决了错误翻译和中断的问题。5、本发明方法无散毒危险、稳定性好、纯化步骤简单、灵敏度高、可实现工业化生产、成本低。
图I为具体实施方式
一获得的重组蛋白检测结果照片。
具体实施例方式本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式
，还包括各具体实施方式
间的任意组合。
具体实施方式
一本实施方式诊断绵羊肺腺瘤病毒的重组蛋白抗原的氨基酸序列如 SEQ ID NO 1 所示。
具体实施方式
二具体实施方式
一所述诊断绵羊肺腺瘤病毒的重组蛋白抗原的制备方法，按以下步骤进行一、提取自然感染OPA的绵羊的肺脏基因组DNA，以提取的基因组DNA为模板进行PCR扩增，将PCR扩增产物用I %琼脂糖凝胶电泳检测，然后采用胶回收试剂盒进行纯化，获得目的基因；二、将目的基因与pEASY Simple Cloning Vector克隆载体进行连接，将产物转化到tranS5a感受态细胞中进行蓝白筛选，次日，挑取白色单菌落接种到含0. lmg/mLAmp的LB培养基中，于37°C振动培养8h，然后使用质粒提取试剂盒提取重组质粒并进行测序鉴定；三、将鉴定正确的重组质粒和表达载体pET-28a分别用限制性内切酶EcoR I和Xho I进行双酶切，将酶切后的重组质粒和酶切后的表达载体pET-28a用T4连接酶连接，将连接产物转化到补充稀有密码子的transetta感受态细胞中，次日，挑取单菌落接种在含0. 05mg/mL Kan的LB培养液中，于37°C振动培养8h，然后使用质粒提取试剂盒提取质粒并进行测序鉴定；四、将鉴定正确的阳性菌接种到LB培养基中，在37°C、185r/min摇床培养至菌液0D600达到0. 6 0. 8，然后向菌液中加入IPTG使IPTG终浓度为0. 4mmol/L，再于30°C、185r/min诱导5h,然后于4°C、5000r/min离心15min,取沉淀,用PBS洗漆沉淀3次，洗完后用PBS溶解沉淀并进行超声处理，超声结束后于4°C、10000r/min离心5min，吸取上清，然后用KCl染色切胶纯化法进行纯化，即获得重组蛋白；其中步骤一中PCR 扩增所用上游引物 FC 为 5' -CCGGAATTCATGCCTGTCTTTGAAAATAACAACC-3'，下游引物 RC 为 5' -CCGCTCGAGTTAAGCAATGCCTTGCATGTA-3'。本实施方式获得的重组蛋白检测结果如图I所示，图中M为蛋白分子质量标准，泳道I为纯化前的重组蛋白，泳道2为纯化后的重组蛋白。本实施方式步骤一中胶回收试剂盒为购自天根公司的普通琼脂糖凝胶DNA回收 试剂盒(TIANgel Midi Purification Kit);步骤二所述trans5 a感受态细胞购自北京全式金生物技术有限公司，商品名称为Trans5 a Chemically Competent Cell ;步骤二和步骤三所述质粒提取试剂盒为购自北京全式金生物技术有限公司的EasyPure PlasmidMiniPrep Kit ;步骤三所述表达载体pET_28a购自Merck公司；步骤三所述补充稀有密码子的transetta感受态细胞购自北京全式金生物技术有限公司，商品名称为Transetta (DE3)Chemically Competent Cell。本实施方式步骤二中将目的基因与pEASY Simple Cloning Vector克隆载体进行连接的方法按照 pEASY-T ISimple Cloning Kit 说明书进行，pEASY-T ISimple CloningKit购自北京全式金生物技术有限公司。以本实施方式获得的重组蛋白免疫实验兔得到的兔免血清作为一抗，以辣根过氧化物酶标记的猪抗兔IgG为二抗，对黑龙江省齐齐哈尔地区的50个样本及内蒙地区的70个样本进行检测。具体方法如下(I)以自然感染绵羊肺腺瘤病的无角道赛特种羊的肺脏作为阳性肺脏标准品；以鸡东地区刚出生的羔羊肺脏为标准阴性肺脏；(2)所有肺脏样品用液氮研磨后按Img组织粉末用IOOiU IXPBS溶解(每个样品取样量均大于5mg)，-70°C反复冻融3次后离心取上清，上清2XSDS(不含溴酚蓝)DTT = 5 : 4 : I混匀后沸水浴5min后，得肺脏处理液，-20°C冻存备用；(3) ELISA 检测方法I)包被将纯化的重组蛋白用PBS稀释至2 ii g/mL，用微量加样器加入ELISA中，100 u L/孔，加完后用微量振荡器振动ELISA板使重组蛋白分布均匀，37°C 30min后4°C过夜。2)甩干，PBST洗板3次,每孔270 u L,每次用微量振荡器振Imin静置2min。3)甩干，用I % BSA封闭室温孵育I. 5h，每孔270 ii L。4)重复步骤2)。5)将肺脏处理液倍比稀释25倍后取60 ii L与60 ii L I 1000稀释的纯化兔抗血清(重组蛋白免疫实验兔得到的兔免血清)混合后37°C作用40min，取出100 u L混合液加入ELISA板中，让包被抗原竞争混合液中的抗体竞争40min。同时设阴性对照(60 u LI 1000稀释的纯化兔抗血清与60iUPBST混合后37°C作用40min后取IOOiiL加入ELISA板中)、100%封闭(不加一抗和病毒)。6)重复步骤2)。7)每孔加入 HRP-猪抗兔 IgG(l 1600) 100 u L 37°C孵育 45min。8)重复步骤2)。9)每孔加入TMB底物溶液100 U L，避光显色。10)加入2M硫酸100 u L终止反应。11)在450nm波长下，酶标仪测其OD值，并记录结果。 抑制率=(阴性-阳性)/(阴性-100%封闭组)X 100%肺脏样品抑制率大于46. 54%判定为阳性。测定结果待检肺脏样品中阳性率为61. 11% ;内蒙地区的感染率为45. 71% ;黑龙江省齐齐哈尔地区的感染率为46%。另外，还可将本实施方式获得的重组蛋白抗原作为疫苗，注射到绵羊体内，以预防绵羊肺腺瘤病毒感染。
具体实施方式
三本实施方式与具体实施方式
二不同的是步骤一中PCR扩增的
反应体系如下
成分用量
肺脏基因组DNA1.25|iL
10|iM 引物 FC0.5|iL
10|iM 引物 RC0.5|iL
10x￡r Taq 缓冲液2.5|iL
dNTP2.0|aL
Iix Taq 111! 0.15(aL
无菌水18.1(iLPCR 扩增条件为95°C预变性 10min，95°C变性 30s，57°C退火 30s，72°C延伸 30s，共25个循环，再72°C延伸10min，4°C保温。其它与具体实施方式
二相同。
具体实施方式
四本实施方式与具体实施方式
二或三不同的是步骤四所述用PBS溶解沉淀具体为按照诱导后每mL菌液离心所得沉淀加60 ii L PBS溶解。其它与具体实施方式
二或三相同。
具体实施方式
五本实施方式与具体实施方式
二至四之一不同的是步骤四所述超声处理的方法为超声3s停3s，如此循环，共处理20min，超声功率是400W。其它与具体实施方式
二至四之一相同。
权利要求
1.一种诊断绵羊肺腺瘤病毒的重组蛋白抗原，其特征在于诊断绵羊肺腺瘤病毒的重组蛋白抗原的氨基酸序列如SEQ ID N0:1所示。
2.如权利要求I所述的诊断绵羊肺腺瘤病毒的重组蛋白抗原的制备方法，其特征在于断绵羊肺腺瘤病毒的重组蛋白抗原的制备方法，按以下步骤进行 一、提取自然感染OPA的绵羊的肺脏基因组DNA，以提取的基因组DNA为模板进行PCR扩增，将PCR扩增产物用I %琼脂糖凝胶电泳检测，然后采用胶回收试剂盒进行纯化，获得目的基因；二、将目的基因与PEASY Simple Cloning Vector克隆载体进行连接，将产物转化到trans5a感受态细胞中进行蓝白筛选,次日，挑取白色单菌落接种到含0. lmg/mLAmp的LB培养基中，于37°C振动培养8h，然后使用质粒提取试剂盒提取重组质粒并进行测序鉴定；三、将鉴定正确的重组质粒和表达载体pET-28a分别用限制性内切酶EcoR I和Xho I进行双酶切，将酶切后的重组质粒和酶切后的表达载体pET-28a用T4连接酶连接，将连接产物转化到补充稀有密码子的transetta感受态细胞中，次日，挑取单菌落接种在含0. 05mg/mL Kan的LB培养液中，于37°C振动培养8h，然后使用质粒提取试剂盒提取质粒并进行测序鉴定；四、将鉴定正确的阳性菌接种到LB培养基中，在37°C、185r/min摇床培养至菌液0D600达到0. 6 0. 8，然后向菌液中加入IPTG使IPTG终浓度为0. 4mmol/L,再于30°C、185r/min诱导5h，然后于4°C、5000r/min离心15min，取沉淀，用PBS洗涤沉淀3次，洗完后用PBS溶解沉淀并进行超声处理，超声结束后于4°C、10000r/min离心5min，吸取上清，然后用KCl染色切胶纯化法进行纯化，即获得重组蛋白；其中步骤一中PCR扩增所用上游引物FC 为 5' -CCGGAATTCATGCCTGTCTTTGAAAATAACAACC-3'，下游引物 RC 为 5' -CCGCTCGAGTTAAGCAATGCCTTGCATGTA-3'。
3.根据权利要求2所述的诊断绵羊肺腺瘤病毒的重组蛋白抗原的制备方法，其特征在于步骤一中PCR扩增的反应体系如下 成分用量肺脏基因组DNA1.25|iL10|iM 引物 FC0.5|iLIOjiM 引物 RC0.5|_iL10x￡x Taq 缓冲液2.5|iL dNTP2.0|_iLEx Tag 酶O.I5|iL 无菌水18. IpL PCR扩增条件为95°C预变性10min，95°C变性30s，57。。退火30s，72。。延伸30s，共25个循环，再72°C延伸10min，4°C保温。
4.根据权利要求2或3所述的诊断绵羊肺腺瘤病毒的重组蛋白抗原的制备方法，其特征在于步骤四所述用PBS溶解沉淀具体为按照诱导后每mL菌液离心所得沉淀加60y L PBS溶解。
5.根据权利要求4所述的诊断绵羊肺腺瘤病毒的重组蛋白抗原的制备方法，其特征在于步骤四所述超声处理的方法为超声3s停3s，如此循环，共处理20min，超声功率是400W 。
全文摘要
一种诊断绵羊肺腺瘤病毒的重组蛋白抗原及其制备方法，涉及一种重组蛋白抗原及其制备方法。本发明提供一种诊断绵羊肺腺瘤病毒的重组蛋白抗原及其制备方法，目的是表达出完整的未被截短的CA蛋白，提高抗原性。诊断绵羊肺腺瘤病毒的重组蛋白抗原的氨基酸序列如SEQ ID NO1所示。方法以提取的基因组DNA为模板进行PCR扩增，获得目的基因；与载体进行连接，得重组质粒；将重组质粒和表达载体pET-28a连接，转化感受态中，测序鉴定；将阳性菌接种到LB培养基中，向菌液中加入IPTG，离心取沉淀，超声后离心，吸取上清，纯化，即获得重组蛋白。本发明获得的重组蛋白以上清形式表达，生物活性好。用于绵羊肺腺瘤病毒检测。
文档编号C12N15/70GK102702334SQ20121023674
公开日2012年10月3日 申请日期2012年7月10日 优先权日2012年7月10日
发明者付丽君, 唐颖, 宋铭忻, 张子群, 彭永刚, 李巍, 路义鑫, 韩彩霞 申请人:东北农业大学