专利名称：一种花生离体快速繁殖的方法
技术领域：
本发明涉及植物组织培养技术领域，具体涉及一种采用组织培养技术对花 生离体培养进行快速繁殖的方法。
背景技术：
植物组织培养技术日趋完善，并在科学研究与现代化农业生产中充分显示 出其优越性。在农林作物的脱毒快繁、突变诱发、改革作物栽培、细胞工程和 基因工程育种以及种质保存等方面都发挥巨大的作用，是一项具有广阔发展潜 力的高新技术。植株再生途径常用离体的器官或组织，进行离体培养，经细胞 的脱分化、再分化诱导产生不定芽，不定芽逐渐伸长并生叶片形成试管苗后， 然后切成单株，在生根培养基上生根，形成完整植株。
目前通过组织培养对花生进行离体繁殖一般包括如下步骤
(1) 以上胚轴或子叶为外植体，采用已有技术对外植体表面进行消毒，
既用10~12质量％次氯酸钠溶液在常温下浸泡5~15分钟，或采用75%乙醇和 0.1~0.2%升汞表面消毒各0.5~1分钟和5~10分钟；
(2) 将上述消毒后的外植体置于不定芽发生培养基中诱导不定芽发生(将 已经过表面消毒的外植体切成0.3 1厘米长的方块，分别放在MS、B5或White 固体培养基中，10~20天诱导不定芽发生)；
(3) 选择上述诱导后高度为0.1~0.5厘米不定芽组成的单个丛生芽团块转 移到芽伸长培养基上培养，促进不定芽伸长；
(4) 选择上述高度为3~7厘米且有叶片的试管苗分切成单株，在加有0.1~5 mg/L的吲哚类或萘类生长素的生根固体培养基上培养生根。
在生根固体培养基上进行生根培养，即得再生幼苗。
现有技术中，以花生上胚轴或子叶为外植体，通过不定芽器官发生再生途 径的适宜培养基分别为不定芽发生培养基MS+0.1mg/LTDZ+2mg/L6-BA; 芽伸长培养基MS+0.1mg/L4-PU+4mg/LBA;所述生根固体培养基的配制以 及生根培养条件采用本领域的通用配方及培养条件。
花生高效再生技术是遗传转化研究的基础，以花生的上胚轴和中胚轴为外 植体，在植物生长物质6-BA和NAA的作用下，可诱导不定芽发生，但其发生 效率最高仅为10%左右(吴绮和韩碧文，花生(Ar"c/^卸/70g"eflL.)胚芽的离体 培养，实验生物学报，1983， 16 (2): 119-131);在培养里添加细胞分裂素物 质6-苄基腺嘌呤(6-BA)和TDZ提高花生上胚轴的不定芽发生频率达到80.0免 (何红卫和宾金华，花生上胚轴的丛生芽诱导和植株再生[J].华南农业大学学 报自然科学版,2003， 24(3):46-49;张斌,范仲学，柳絮,秦岭,李长生，毕玉平.花生再 生体系的建立[J].安徽农业科学，2006,34 (15): 3590-3592),但是，在苄基腺 嘌呤(6-BA)和TDZ诱导不定芽发生过程中，外植体接近培养基面的组织常 出现黑色，影响了不定芽的伸长，其生长极其缓慢，甚至长时期处于芽点状态。
一般用于促进植物器官组织不定芽发生的植物生长物质有细胞分裂素类 物质6-BA (6-节基腺嘌呤)、4-PU (4-吡效隆)和TDZ (噻唑隆)，以及生长 素类物质(IAA吲哚乙酸，NAA萘乙酸)；这些物质处理的方法是将一定浓 度的物质溶解后，加入培养基中，培养材料按照常规方法进行表面消毒后，放 置培养基中，在弱光、27"C条件下培养。
现有的花生离体培养技术中，对植物生长物质要求浓度比较高，有些还需要专用设备，成本高，操作复杂，而且培养效果不太好，不利于大规模推广。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种能提高出芽率和芽伸长 的花生离体快速繁殖的方法，该方法操作简便、效果好。 本发明的上述目的是通过如下方案予以实现的
本发明针对现有技术中通过组织培养对花生进行离体繁殖，所常采用的
(1)外植体表面消毒、(2)诱导不定芽发生、(3)芽伸长培养和(4)生根培
养这四步，进行了如下改进，从而使得花生离体繁殖的操作更加简单，效果更
加好
1. 对歩骤(2)中的不定芽发生培养基，本发明改进后的配方为在MS
培养基和/或B5培养基中加入了 0.0001~0.006mg/mL细胞分裂素类物质，该不 定芽发生培养基的pH为6.0，所述MS培养基和/或B5培养基可以为固体培 养基也可以为液体培养基，所述细胞分裂素类物质为6-BA (6-苄基腺嘌呤)、 4-PU (4-吡效隆)或TDZ (噻唑隆)中的两种或两种以上。
2. 对步骤(3)中的芽伸长培养基，本发明改进后的配方为在1/2MS培 养基和/或MS培养基中加入0.0005~0.003mg/mL赤霉素和/或细胞分裂素类物 质，该芽伸长培养基的pH=6.0，所述细胞分裂素类物质为6-BA、 4-PU和TDZ 中的一种或多种，所述赤霉素(GA)是指具有赤霉烷骨架，能够剌激细胞分 裂和伸长的一类化合物的总称，本发明可选择赤霉素中的任意一种，起到调节 细胞分裂和伸长的作用；
3. 对步骤(2)中诱导不定芽发生的培养条件改进为将上胚轴或子叶消 毒后，置于改进后的不定芽发生培养基中，在25士2'C,光照强度为2000-3000勒科斯的条件下静止培养7~10天。
本发明的MS培养基，1/2MS培养基，B5培养基都是本领域通用的，其 配制方法都是本领域技术人员所共知的。
本发明的进一步优化改进方案是
1. 对上述步骤(2)中不定芽发生培养基的配方做进一步优化，则不定芽 发生培养基配方为向MS培养基中加入(0.0001~0.0008mg/mL)的4-PU和
(0.001-0.006 mg/mL)的6-BA，该不定芽发生培养基的pH为6.0;
2. 对上述步骤(3)中芽伸长培养基的配方做进一歩优化，则芽伸长培养 基配方为1/2MS培养基和/或MS培养基中加入0.0005~0.003mg/mL的赤霉素 或0.001~0.003mg/mL的细胞分裂素类物质，所述芽伸长培养基的pH为6.0， 所述赤霉素类物质为任意一种，所述细胞分裂素类物质为6-BA、 4-PU和TDZ 中的一种或多种。
本发明的更佳改进方案是
1. 步骤(2)中不定芽发生培养基的配方最好是在MS培养基中加入 (0.0002~0.0006 mg/mL)的4-PU和(0.002~0.005mg/mL)的6-BA，该不定
芽发生培养基的pH为6.0;
2. 步骤(3)中芽伸长培养基的配方最好是在1/2MS培养基中加入 (0.0005~0.002 mg/mL)的赤霉素，或在MS培养基中加入(0.001~0.003
mg/mL)的6-BA，该芽伸长培养基的pH-6.0;
3. 步骤(2)中诱导不定芽发生的光照强度为2500勒科斯。
4. 步骤(3)中的芽伸长培养条件为在25±2°C、光照强度为2000~3000 勒科斯的条件下静止培养培养9~12天。与现有技术相比，本发明具有如下有益效果
1. 本发明采用4-吡效隆作为主要成分，促进植物组织发生不定芽，与已 有促进不定芽发生的物质相比，作用浓度低，效果显著，方法简便，避免了生 芽过程中外植体基部出现黑色，促进不定芽高质量生长；
2. 本发明方法与已有促进不定芽伸长的方法相比，无需增加专用设备， 赤霉素与细胞分裂素类使用浓度小，成本低，伸长培养所需时间短且效果显著。
具体实施例方式
下面结合实施例对本发明进行进一步的说明。 实施例1
本实施例的花生离体快速繁殖方法，其具体步骤如下
(1) 将花生上胚轴用10质量％次氯酸钠溶液在常温下浸泡5分钟，表面 消毒；
(2) 配制不定芽发生培养基(MS固体培养基中加入0.0006 mg/mL 4-PU 和0.005 mg/mL 6-BA， pH 6.0)将上述消毒后的花生上胚轴置于该不定芽发 生培养基内，在25±2°C、光照强度为2000勒科斯的条件下静止培养9天；
(3) 配制芽伸长培养基(在MS固体培养基中加入0.003 mg/mL赤霉酸G A3， pH6.0)，将生芽后的上胚轴置于该芽伸长培养基中，在25±2°C、光照 强度为2000勒科斯的条件下培养12天；
(4) 生根培养得到幼苗。
以花生上胚轴在不含4-PU 、 6-BA和其他任何激素的MS固体培养基培 养为对照组，不定芽发生率为10.3%,经本方法培养的上胚轴接近培养基面的 组织不出现黑色，不定芽发生率为52.2%，芽点致密；经MS+0.003 mg/mL GA3芽伸长培养基培养后，芽长度平均为1.2厘米。而对照组只有0.4厘米。 实施例2
本实施例的花生离体快速繁殖方法，其具体步骤如下.-
(1)将花生子叶用11质量％次氯酸钠溶液在常温下浸泡8分钟，表面消
毒；
(2)配制不定芽发生培养基(1/2MS培养基中加入0.0006 mg/mL 4-PU 和0.002 mg/mL6-BA， pH6.0)将上述消毒后的花生子叶置于该不定芽发生培 养基内，在25土2。C、光照强度为3000勒科斯的条件下培养9天；
(3) 配制芽伸长培养基(在MS固体培养基中加入0.003 mg/mL 6-BA， p H 6.0)，将生芽后的子叶置于该芽伸长培养基中，在25±2°C、光照强度为2 000勒科斯的条件下培养12天；
(4) 生根培养得到幼苗。
花生子叶在不含4-PU、 6-BA和其他任何激素的1/2MS固体生芽培养基 培养9天，不定芽发生率为12.1%,经本方法培养的上胚轴接近培养基面的组 织不出现黑色，不定芽发生率为72.2%。经加有0.003 mg/mL 6-BA的MS固 体培养基(伸长培养基)培养后，芽长度平均为1.6厘米，而对照只有0.5厘米。
实施例3
本实施例的花生离体快速繁殖方法，其具体步骤如下
(1)将花生子叶用12质量免次氯酸钠溶液在常温下浸泡5分钟，表面消
毒；
(2)配制不定芽发生培养基(B5培养基中加入0.0002 mg/mL 4-PU和0.005mg/mL6-BA， pH6.0)将上述消毒后的花生子叶置于该不定芽发生培养基内， 在25土2X:、光照强度为3000勒科斯的条件下培养10天；
(3) 配制芽伸长培养基(在MS固体培养基中加入0.001 mg/mL 6-BA， p H6.0),将生芽后的外植体置于该芽伸长培养基中，在在25土2X:、光照强度 为2500勒科斯的条件下培养12天；
(4) 生根培养得到幼苗。
花生子叶在不含4-PU 、 6-BA和其他激素的MS固体生芽培养基培养9 天，不定芽发生率为16.1%，经本方法培养的子叶不定芽发生率为85.2%，接 近培养基面的组织不出现黑色；经0.001 mg/mL 6-BA的MS固体培养基(伸 长培养基)培养后，芽长度平均为2.1厘米，而对照只有0.8厘米。
实施例4
本实施例的花生离体快速繁殖方法，其具体歩骤如下
(1)将花生上胚轴用10质量％次氯酸钠溶液在常温下浸泡6分钟，表面 消毒；
(2)配制不定芽发生培养基(MS培养基中加入0.0002 mg/mL 4-PU和0.002 mg/mL 6-BA， pH 6.0 )将上述消毒后的花生上胚轴置于该不定芽发生培养基内， 在25士2。C、光照强度为2000勒科斯的条件下培养10天；
(3) 配制芽伸长培养基(在MS固体培养基中加入0.001 mg/mL GA3， p H 6.0)，将生芽后的上胚轴置于该芽伸长培养基中，在25±2°C、光照强度为 2000勒科斯的条件下培养12天；
(4) 生根培养得到幼苗。
花生上胚轴在不含4-PU 、6-BA和其他激素的MS固体生芽培养基培养9天，不定芽发生率为18.1%,经本方法培养的上胚轴不定芽发生率为93.6%， 接近培养基面的组织不出现黑色，芽体呈白色；经0.001 mg/mL GA3的MS固 体培养基(伸长培养基)培养后，芽长度平均为2.5厘米，而对照只有0.7厘 米。
权利要求
1、一种花生离体快速繁殖的方法，包括如下步骤(1)对外植体表面进行消毒；(2)消毒后的外植体置于不定芽发生培养基中诱导不定芽发生；(3)将诱导后不定芽组成的单个丛芽转移到芽伸长培养基上继续培养；(4)生根培养；其特征在于所述步骤(2)中的不定芽发生培养基是在MS和/或B5培养基中加入0.0001～0.006mg/mL细胞分裂素类物质，pH6.0；所述步骤(3)中的芽伸长培养基是在1/2MS培养基和/或MS培养基中加入0.0005～0.003mg/mL赤霉素和/或细胞分裂素类物质，pH6.0。
2、 根据权利要求1所述花生离体快速繁殖的方法，其特征在于步骤(2) 中所述细胞分裂素类物质为6-苄基腺嘌呤、4-吡效隆或噻唑隆中的两种或两种 以上；步骤(3)中所述细胞分裂素类物质为6-苄基腺嘌呤、4-吡效隆和噻唑 隆中的一种或多种。
3、 根据权利要求1所述花生离体快速繁殖的方法，其特征在于所述步骤 (2)中不定芽发生培养基配方为MS培养基中加入O.OOOl 0.0008mg/mL4-吡效隆和0.001W.006mg/mL6-苄基腺嘌呤；所述步骤(3)中的芽伸长培养基是 在1/2MS培养基和/或MS培养基中加入0.0005~0.003mg/mL赤霉素或 0.001~0.003 mg/mL细胞分裂素类物质。
4、 根据权利要求3所述花生离体快速繁殖的方法，其特征在于所述步骤 (2)中不定芽发生培养基配方是在MS培养基中加入0.0002 0.0006mg/mL4-吡效隆和0.002 0.005mg/mL6-苄基腺嘌呤；所述步骤(3)中芽伸长培养基的 配方是在1/2MS培养基中加入0.0005~0.002mg/mL赤霉素，或在MS培养基 中加入0.001 0.003mg/mL6-节基腺嘌呤。
5、 根据权利要求1的花生离体快速繁殖的方法，其特征在于所述步骤(2)的不定芽诱导培养条件为25±2°C，光照强度为2000~3000勒科斯的条件下静 止培养7 10天。
6、 根据权利要求1的花生离体快速繁殖的方法，其特征在于所述步骤(3) 中芽伸长的培养条件为25±2°C、光照强度为2000~3000勒科斯的条件下静止 培养培养9 12天。
7、 根据权利要求5的花生离体快速繁殖的方法，其特征在于所述步骤(2) 的培养光照强度为2500勒科斯。
全文摘要
本发明公开一种花生离体快速繁殖的方法，该方法是在现有组织培养花生离体繁殖所包括的如下四个步骤(1)外植体表面消毒、(2)诱导不定芽发生、(3)不定芽伸长培养和(4)生根培养的基础上，对步骤(2)中的不定芽发生培养基以及诱导不定芽培养条件和步骤(3)中的芽伸长培养基以及培养条件进行了优化改进。本发明采用4-吡效隆作为主要成分，促进植物组织发生不定芽，与已有促进不定芽发生的物质相比，作用浓度低，效果显著，在不定芽发生过程中外植体接近培养基面的组织不会出现黑色，促进芽生长。本发明方法与已有促进不定芽伸长的方法相比，无需增加专用设备，赤霉素与细胞分裂素类使用浓度小，成本低，伸长培养所需时间短且效果显著。
文档编号A01H4/00GK101411305SQ20081021940
公开日2009年4月22日 申请日期2008年11月25日 优先权日2008年11月25日
发明者璨 刘, 玲 李, 铭 覃 申请人:华南师范大学