外胚层瘤、脑垂体癌、红细胞增多症、前列腺癌、稀少癌症及相关疾病 (Rare-cancers-and-associated-disorders)、肾细胞癌视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、先 天性血管萎缩性皮肤异色症(Rothmund-Thomson Syndrome)、唾液腺癌、肉瘤、神经鞘瘤、塞 扎里综合征、皮肤癌、小细胞肺癌（SCLC)、小肠癌、软组织肉瘤、脊髓肿瘤、鳞状细胞癌（皮 肤）、胃癌、滑膜肉瘤、睾丸癌、胸腺癌、甲状腺癌、移行细胞癌（膀胱）、移行细胞癌（肾-骨 盆 _/_输尿管）、滋养细胞癌、尿道癌、泌尿系统癌、膀胱上皮分化标志物(Uroplakins)、子宫 肉瘤、子宫癌、阴道癌、外阴癌、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血病（Waldenstrom's-Macroglobulinemia)、肾母细胞瘤（Wilms'Tumour)。
[0072] 可以测试一系列抗原中的任一，例如对特定有机体、病毒、自体抗原或癌细胞特异 的那些。作为选择，可以使用更常用的试剂来测试细胞介导的免疫应答的通用能力。后者的 实例包括来自结核分枝杆菌(M. tuberculosis)的PPD和破伤风类毒素。任何肽、多肽或蛋白 质，碳水化合物、糖蛋白、磷脂、磷蛋白或磷脂蛋白或非蛋白化学试剂可用于本检验系统。
[0073] 如上所述，免疫效应子分子的检测可以在蛋白或核酸水平上进行。因此，提到"所 述免疫效应子分子的存在或水平"包括直接或间接数据。例如，高水平的IFN- y mRNA为间接 数据，显示增加的IFN-Y水平。用于评估RNA的本领域已知的检验描述于例如Sambrook， Molecular Cloning:A Laboratory Manual,3rd Edition,CSHLP,CSH,NY,2001and Ausubel (Ed)Current Protocols in Molecular Biology,5th Edition,John ffiley&Sons,Inc,NY, 2002〇
[0074] 免疫效应子的配体在检测和/或定量这些分子上特别有用。针对免疫效应子分子 的抗体特别有用。本文涉及的用于检验的技术在本领域是已知的，并且包括，例如三明治检 验、ELISA和ELISSPOT。还包括快速现场护理免疫层析装置（Rapid point of care immunochromatographic devices)。提到"抗体"包括抗体的部分、哺乳动物源化(例如人源 化)抗体、重组或合成抗体以及杂交和单链抗体。
[0075] 多克隆和单克隆抗体都能够通过用免疫效应子或其抗原性片段免疫获得，任一类 型可用于免疫检验。获得两种类型血清的方法在本领域是已知的。多克隆血清不太优选，但 通过以下相对容易制备：用有效量的免疫效应子，或其抗原性部分注射合适的实验室动物， 从该动物收集血清，通过任何已知的免疫吸附技术分离特定血清。虽然通过该方法产生的 抗体实际上可用于任何类型的免疫检验，由于产品的潜在异质性它们通常不优选。
[0076] 在免疫检验中单克隆抗体的使用特别优选，因为能够大量产生它们以及产品的均 匀性。通过将永久细胞系和对免疫原性制剂敏感的淋巴细胞融合衍生的，用于单克隆抗体 生产的杂交瘤细胞系的制备可以通过本领域技术人员已知的技术来完成。
[0077] 因此，本发明的另一方面涉及用于检测来自受试者的包含免疫细胞的样品中的免 疫效应子的方法，所述方法包括:在足以形成抗体-效应子复合物的条件下，将所述样品或 所述样品的等分试样与对所述免疫效应子或其抗原性片段特异的抗体接触一段时间，然后 检测所述复合物。
[0078] 样品包括全血。该方法包括在平面或球形固体载体上的微阵列和巨阵列(macro-arrays)〇
[0079] 通过参考美国专利4,016,043,4,424,279和4,018,653可以看出，可以获得宽范围 的免疫检验技术。
[0080]以下为一种类型检验的描述。将未标记的抗体固定在固体基质上，将要就免疫效 应子(例如抗原)测试的样品与结合分子接触。孵育足以允许形成抗体-抗原复合物的合适 的时间后，然后将用能够产生可检测信号的报道分子标记的针对该抗原特异的二抗加入并 孵育，使经过足以形成抗体-抗原-标记的抗体的另一复合物的时间。冲洗掉任何未反应的 材料，通过观察由报道分子产生的信号确定抗原的存在。结果通过简单的观察可视信号可 以是定性的，或可以通过与包含已知量的抗原的对照样品比较来定量。该通用技术对于本 领域技术人员是已知的，为许多变体中的任何。
[0081 ] 在这些检验中，对瞬时免疫效应子（instant immune effector)具有特异性的一 抗共价地或主动地结合到固体表面。典型地固体表面为玻璃或聚合物，最常用的聚合物为 纤维素、聚丙烯酰胺、尼龙、聚苯乙烯、聚氯乙烯或聚丙烯。固体载体可为以下形式：容器、 珠、球、微孔板(microplate)的盘(discs )、或适于进行免疫检验的任何其它表面。结合方法 在本领域是已知的，通常由交联共价结合或物理吸附组成，在用于测试样品的制剂中洗涤 聚合物_抗体复合物。然后将要测试的样品的等分试样加入固相复合物，并在合适的条件下 (例如约20°C至约40°C)孵育足够的时间（例如2-120分钟或当更方便时，过夜）以允许结合 存在于抗体中的任何亚单位。孵育时间后，将抗体亚单位固相洗涤和干燥，并与对抗原的部 分的特异性二抗一起孵育。二抗与报道分子连接，报道分子用于指示二抗与半抗原的结合。
[0082] 对于该检验有许多变体。一种特别有用的变体为所有或许多组分基本上同时地混 合的同时检验（simultaneous assay)。
[0083] 关于本说明书中所用的〃报道分子〃，是指通过其化学性质提供分析上可鉴定的信 号的分子，其允许检测抗原结合的抗体。检测可以是定性或定量的。在该类型检验中最常用 的报道分子为酶、荧光团或包含放射性核素的分子（即放射性同位素)和化学发光分子。合 适荧光团的实例提供于表2。在酶免疫检验的情况下，酶通常借助于戊二醛或高碘酸盐缀合 到二抗。然而，为了更容易地识别，存在各种不同的缀合技术，其对于本领域技术人员容易 获得。其中常用的酶包括辣根过氧物酶、葡萄糖氧化酶、半乳糖苷酶和碱性磷酸酶。当通 过相应的酶水解时，与特定酶一起使用的底物通常就产生可检测的颜色变化而选择。合适 酶的实例包括碱性磷酸酶和过氧化物酶。还可以使用荧光底物，其产生荧光产物而不是上 述的发色底物。在所有情况下，将酶标记的抗体加入一抗-抗原复合物，使其结合，然后洗涤 掉过量的反应试剂。然后将包含合适底物的溶液加至抗体-抗原-抗体的复合物。底物将与 连接到二抗的酶反应，给出定性可视的信号，其可通常分光光度地被进一步定量，以给出存 在于样品中的抗原的量的指示。再一次，本发明扩展到基本上同时的检验。
[0084] 作为选择，荧光化合物，例如荧光素和罗丹明，可以化学地偶联到抗体上而不改变 其结合能力。当通过用特定波长的光照射激活时，荧光染料-标记的抗体吸收光能，诱导分 子中的可激发性状态，然后发射为用光显微镜能够可视检测的特征颜色的光。使荧光标记 的抗体与一抗-抗原复合物结合。洗涤掉未结合的反应试剂之后，然后将残余的三元复合物 暴露到合适波长的光下，观察到的荧光指示目的抗原的存在。免疫荧光和EIA技术在本领域 非常良好的建立，对于本方法特别优选。然而，还可以使用其它报道分子，例如放射性同位 素、化学发光或生物发光分子。
[0085] 存在可使用的一系列其它检测系统，包括胶体金，本发明包括所有此类检测系统。 [0086]本发明还涉及基因检验，例如包括RT-PCR分析或其它基于本领域已知的策略的扩 增来检测编码免疫效应子的基因序列的RNA表达产物。
[0087] 在一种实施方式中，PCR使用引物对进行，其一种或两种通常用相同或不同的能够 给出可区分信号的报道分子标记。荧光团的使用在本发明实施中尤其有用。合适荧光团的 实例可以选自表2中给出的列表。其它标记包括发光（luminescence)和磷光以及红外染料。 这些染料或荧光团还可用作用于抗体的报道分子。
[0088] 本发明包括分析荧光发射的任何合适方法。在这点上，本发明涉及包括但不限于 以下技术:例如由Lakowicz等，Biophys. J. ,72:567，1997公开的2-光子和3-光子时间分辨 的焚光光谱（2_photon and3_photon time resolved fluorescence spectroscopy)，例如 由Eriksson等，Biophys.J. ,2:64,1993公开的焚光寿命成像以及例如由Youvan et al.， Biotechnology ? 3:1-18，1997公开的能量共振能量转移。
[0089] 发光(Luminescence)和磷光可分别由本领域已知的合适的发光或磷光标记产生。 在这点上可使用鉴定此类标记的任何光学方法。
[0090]红外辐射可由合适的红外染料产生。可用于本发明的示例性红外染料包括但不限 于以下公开的那些：Lewis et al.，Dyes Pigm.，42(2):197，1999，Tawa et al.， Mater.Res.Soc.Symp.Proc.,488[Electrical,Optical and Magnetic Properties of Organic Solid-State Materials IV],885-890,Daneshvar et al.,J.Immunol.Methods, 226(1-2):119-128,1999,Rapaport et al?，Appl.Phys.Lett.,74(3):329-331，1999and Durig et al.，J.Raman 5口6(：1：1'〇8(3.，24(5):281-285，1993。可以使用任何合适的红外光谱 法来询问（interrogate )红外染料。比如，在该点上可使用例如由Rahman et al ?， J. Org. Chem.，63:6196，1998描述的傅立叶变换红外光谱。
[0091 ]合适地，电磁波散射可由入射电磁福射包括光和X射线的衍射、反射、偏振或折射 引起。此类散射可用于定量mRNA的水平或蛋白质的水平。
[0092] 在分析荧光团发射上流式细胞仪特别有用。
[0093] 如本领域已知，流式细胞仪为高通量技术，其包括当悬浮于流体流时随着它们通 过一道或多道激光束的路径，快速分析颗粒(例如标记的mRNA，DNA或蛋白质）的物理和化学 特性。由于每一颗粒拦截激光束，使用任何合适的例如下文描述的跟踪算法，由每一细胞或 颗粒发射的散射光和荧光可以被检测和记录。
[0094] 现代流式细胞仪能够进行这些达100,000细胞/颗粒f1的任务。通过使用过滤器和 二向色镜的光学阵列，不同波长的荧光可以被分离并同时检测。此外，可以使用许多具有不 同激发波长的激光。因此，可以使用各种荧光团以靶向或检查例如样品内不同的免疫效应 子或来自多个受试者的免疫效应子。
[0095] 可用于本发明方法的合适的流式细胞仪包括使用单激发激光（single excitation laser)，测定5至9个光学参数(参见表3)的那些，所述单激发激光通常为氩离 子风冷激光，运行在15mW，其光谱线488nm。更先进的流式细胞仪能够使用多个激发激光，除 了氩离子激光（488或514nm)之外，例如HeNe激光（633nm)或HeCd激光（325nm) 〇
[0096] 例如，Biggs et al.，Cytometry,36:36-45,1999已经使用三个激发激光构建了11 个参数的流式细胞仪，并且已经证明除了正向和侧向散射测定外使用9个可区分的荧光团 以旨在免疫表型分型（即分类)颗粒。目前商业上可获得的参数的最大数量为17:正向散射、 侧向散射和三个激发激光，每个具有5个荧光检测器。所有参数是否都能够充分地利用极大 地依赖于消光系数、量子产率和所有荧光团之间光谱重叠的量(Malemed et al.，〃Flow cytometry and sorting〃，2nd Ed.，New York,Wiley-Liss, 1990)。然而，将理解本发明不限 于任何特定的流式细胞仪或任何特定的参数组。在这点上，本发明还涉及使用例如Fu et al ?，Nature Biotechnology, 17 : 1109-1111，1999 公开的微型流式细胞仪 (microfabricated flow cytometer)代替传统的流式细胞仪。
[0097] 本发明的检验对于高通量筛选或对于就来自一个受试者的许多免疫效应子筛选 而言可以是自动化或半自动化的。自动化通过计算机软件方便地控制。
[0098] 因此本发明涉及用于评估一种或多种免疫效应子存在或不存在的计算机程序产 品，所述产品包括：
[00" ] (1)接收与标记的mRNA或抗体相关的报道分子的特性（i den t i ty)作为输入值的代 码；
[0100] (2)将所述输入值与参考值比较，以确定报道分子的水平和/或与报道