专利名称：用于诊断和治疗目的的不含半胱氨酸的金属结合肽，其生产方法和含有这些化合物的药物的制作方法
技术领域：
本发明的主体是不含半胱氨酸的金属络合肽，它们直接或通过连接物，与器官特异性探针偶联，从而作为一种结合体特异性地聚集在肿瘤、器官、组织、或发炎病灶处，所述的器官特异性探针是，如用于抗象癌胚抗原(CEA)这样的与肿瘤相关抗原的抗体或部分抗体序列，从而它们特异性地聚集在肿瘤处。
本发明进一步涉及用于生产不含半胱氨酸的金属络合肽以及它们的结合体的方法。本发明进一步涉及利用所述的结合体作为体内诊断或体内治疗的一种试剂盒的成分和包括所述的结合体和放射性核素的放射性药物，器官特异性结合体用于肿瘤、器官、或发炎病灶的显示。
除了心血管疾病外，恶性肿瘤是一种常见的死亡原因，因为无法控制其生长。尽管切除了原发肿瘤，但是无法定位很小的转移瘤，因而无法切除它们。手术或化疗后的治疗检查，一方面包括成像法，如CT或MR，另一方面包括测定象CEA这样的肿瘤相关性抗原在病人血清中的含量。尤其是对结肠直肠肿瘤。
这些成像法的一个缺陷就是不能区分瘢痕和局部复发。在测定血清中CEA含量的检查中，其缺陷除了不能定位肿瘤以外，还有敏感性较低。一方面，即使具有正常范围的CEA值也不能排除转移瘤的形成，另一方面象发炎病变这样的非恶性疾病可以导致CEA值升高。
因此肿瘤的早期定位，或肿瘤的特异性治疗，能够决定着治疗的成功，尤其是当诊断没有把握时。这种特异性研究通过免疫闪烁法而变得更为方便，这种用于核医学中的成像法，其特征是使用同位素标记的抗体或抗体结构。
当今在核医学诊断中最常使用的放射性核素是I-131，I-123，In-111和Tc-99m；它们以共价结合(I-131，I-123)或作为一种络合物(In-111，Tc-99m)存在。尽管这里列举的放射性核素因其低半衰期可将射线对病人的辐射量减至最低，但是I-131，I-123和In-111仍有一些缺陷。具有364kev能量的γ射线和8天半衰期的I-131可以发射额外的β-射线，这种射线对组织的损害极大。In-111具有172kev和245kev能量的γ射线以及2.8天的半衰期，经各个不同的研究组对它的研究证明用In-111标记的器官特异性物质导致其在网状内皮系统中的高浓度，尤其是在肝脏中，如果不是不可能，就是使得肝的诊断变得困难(Fairweather等人，Br.Med.J.，287，167-170，1983；Hnatowich等人，J.Nucl.Med.，26，849-858，1985)。由于半衰期为13.3小时γ射线的能量为159kev，放射性核素I-123很适合用于诊断目的的医学成像；然而它的生产昂贵。
对于诊断来说，最佳的选择是Tc-99m，它结合了6小时的短半衰期和140kev的射线能量，有利于立即可得的体内成像，因为它可以通过钼发生器很容易和低廉地以高锝酸盐的形式获得，并且在还原后，可得到适于络合器官特异性物质的氧化价。
金属可以直接或间接地与器官特异性物质络合。
如果以直接的方式络合，那么器官特异性化合物中含有官能团本身或这些官能团作为Tc-99m的配体必须表现出还原功能(Schwarz等人，J.Nucl.Med.，28，721，1987)。因此二硫键还原后抗体可以络合金属，而对还原的需求会引起多种缺陷。象巯基乙醇或二硫苏糖醇这样的毒性物质可用作还原剂并且必须在还原后经花费昂贵的清除过程而分离。十分常见的是，可证明抗体由于还原而被切断，它能导致作用于靶组织的抗体亲合性的损耗，就象由于金属络合的结构变化能够导致的损耗一样。另外，没有关于金属键合位置确切定位的报道，从而不能改变涉及络合物形成的基因，例如有关最优化体内稳定性的改变。
间接络合法使用象DTPA衍生物这样的双功能螫合物，活化后，它们或者能与象抗体这样的器官特异性载体以共价键偶联，或者与金属络合(Meares，Nucl.Med.Biol.，13，311-318，1986)。
基本上有两种方式用于结合体的络合。第一种是器官特异性物质首先与自由配体偶联，然后与放射性核素络合；第二种是器官特异性物质与已经形成的螫合物偶联。
双功能螫合物与一种器官特异性物质的化学偶联在两种情况下都需要极复杂的保护性被膜技术以及纯化络合的结合体。
此外，具有双功能螯合剂的器官特异性物质的蛋白质衍生物由于分子的相互作用，可能削弱对靶组织的特异性结合。
使用同位素标记的抗肿瘤相关性抗原的鼠抗体对肿瘤的体内定位有各种缺陷。分子量是生物分布的一个参数。由于分子量大(150kDalton)，导致与慢速血液清除相结合的分布不均匀，特别是对固体肿瘤。结果出现防碍最佳显示的高背景活性和肝脏内高浓度的抗体，如果不是不可能，就是使得肿瘤定位变得困难(Baum等人，Nucl.Med.Commun.，10，345-352，1989)。
此外，许多病人由于形成人抗鼠抗体的抗体而表现出过敏反应(HAMA反应)，这就禁止了用于诊断或治疗目的的所述抗体的重复使用(Sears等人，J.Biol.Resp.Modifiers，3，138-150，1984)。这种过敏反应是由抗体恒定区造成的任何减少HAMA反应的进展就是产生嵌合抗体，这种嵌合抗体具有来源于鼠的可变抗原检测区和来源于人体的恒定区(Lo Buglio等人，Pro Natl.Acld.Sci.USA，86，4220-4224，1989)。
通过形成象F(ab)2(100kDalton)和F(ab)(50kDalton)这样的抗体片段，可以降低分子量以保持亲合力和增加血液清除速度(Andrew等人，Eur.J.Nucl.Med.，12，168-172，1986)，表现出上面提到的缺陷的抗体片段作为同位素标记物。通过显示“单链片段”可以获得对分子量的进一步降低。“单链片段”具有27k道尔顿的分子量，并且由通过连接物与抗体重链可变区偶联的抗体轻链可变区组成(Bird等人，Science，242，423-426，1988)。
Milenic等人(Cancer Res.，51，6363—6371，1991)对抗肿瘤相关性抗原TAG-72的碘标记的单克隆抗体和相应的F(ab)2，F(ab)以及sFv片段的亲合性、特异性和生物分布进行了比较描述。sFv片段由于其低分子量而表现出来适合于诊断成像的药物动力学性质。如果与完全抗体相比，单价sFv片段的亲合性较低因而面临着从血液或体内更快地被清除，这可以降低背景活性并能导致提高成象反差。但是sFv片段不能用最适合于诊断的放射性核素Tc-99m标记。
根据WO92/13527，被氨基酸间断的S-保护性半胱氨酸残基充当Tc-99m结合肽，通过与器官特异性多肽偶联，有利于聚集和定位。这种方法的缺陷是耗时，并且Tc结合肽或结合体的制备昂贵，因为标记高半胱氨酸序列需要极复杂的保护性被膜技术。
Nedelman等人(J.Nucl.Med.34，234-241，1993)描述了依据动物模型的梗塞成像，这种成像使用与Tc-99m络合的双功能螫合剂偶联的抗肌球蛋白的“单链片段”。由于螯合剂与sFv片段的偶联花费昂贵，并且需要保护基团技术避免氧化，因此低廉的生产和简易的临床操作是不可能的。
急需的诊断和治疗需要是提供作用突出的化合物，这些化合物因为在靶组织内的聚集行为，同时因为未特异性结合部分的快速清除以便不会在病人体内产生任何过敏反应，以及结合确定的放射性核素和具有体内高稳定性而作用突出。
此外，这些化合物的制备应不成问题，并且其临床操作应省时和简便。
这一难题通过本发明得以解决，其中提供了通式I的化合物R1-X-R2(I)其中X是20个相同或不同的α-，β-和/或γ-氨基酸残基的链，所述的链含有至少一种属于甲硫氨酸，精氨酸，赖氨酸和天冬酰胺基团的氨基酸并且不含半胱氨酸，在其N末端上有一个自由基或一个通过取代氢原子与其结合的残基R1，在其C末端上有一个自由基或一个通过取代羟基与其结合的残基R2，其中
R1是氢原子，含多达10个碳原子的支链或直链烷基，芳香基，烷芳基，芳烷基，烷羰基或芳羰基，它们可选择性地被羟基，氨基或羧基取代，R2是羟基，含多达10个碳原子的支链或直链烷氧基或芳氧基，它们每个都可选择性地被羟基，氨基或羧基，氨基，N(RaRb)基取代，其中Ra和Rb相同或不同并且代表含多达10个碳原子的支链烷基或酰基残基，它们可选择性地被羟基，氨基或羧基取代，或者R2是磷酸残基，它们与肽、蛋白质、生物或大分子的结合体以及它们与金属离子的络合物和它们的水溶性盐。
根据本发明的通式I，优选的化合物中，链X由3至15个氨基酸组成。
特别优选的化合物中，链X由3至8个氨基酸组成。
本发明特别优选的化合物包括以下序列glu-met-gly-asn-gly-glu，gly-gly-gly-gly-gly-met，met-gly-gly-gly-gly-met，met-gly-met-gly-his-gly-his，met-gly-met-gly-met-gly-met-gly，gly-gly-met-gly-met-gly-gly-gly，arg-gly-met-gly-met-gly-gly-gly，arg-gly-met-gly-met-gly，arg-arg-gly-gly-gly-glu，arg-gly-gly-gly-gly-gly，
met-gly-met-gly-his-gly，ala-lys-his-lys-his-his，gly-met-arg-met-gly-arg，gly-met-lys-met-gly-arg，gly-gly-met-arg-met-gly-gly-gly或gly-gly-met-lys-met-gly-gly-gly.
根据本发明的通式I，R1-X-R2(I)其它优选的化合物的特征在于R1是单键或氢原子，或R2是单键、羟基或氨基。
本发明进一步提提供了肽、蛋白质、生物或大分子以及与受体结合的物质与通式I化合物的结合体。
优选的结合体中肽、蛋白质、生物或大分子以及与受体结合的物质的特征是结合体与选择性地聚集在患病的组织或肿瘤处的物质一起存在，在所述的物质与通式I的化合物之间存在共价结合，所述的共价结合用于对含氨基如肽、蛋白质、抗体或其片段，类酯这样的物质酰胺化(amidic)和对含醛基的物质亚氨化(imidic)。
聚集在患病组织外的特质优选激素，神经激素，神经递质，生长刺激因子，植物激素，信息素，酶辅助因子，酶底物，特异性接合受体的药物，或寡核苷酸。
在聚集于患病组织外的物质中特别优选催产素，后叶加压素，血管紧张素，促黑激素，生长激素抑制素，tyrotropin-releasinghormones，促性腺激素释放激素，睾酮，雌二醇，黄体酮，皮质醇，醛甾酮，维生素D，胃泌素，分泌素，生长激素，前列腺素，神经降压素，胰岛素，胰高血糖素，降钙素，生长激素释放激素，促乳素，脑磷脂，内啡肽，多巴胺，去甲肾上腺素，谷氨酸，血清素，乙酰胆碱，肾上腺素，interleucines，血管生成素，胸腺生成素(thyompoetins)，促红细胞生成素，玉米素，赤霉酸衍生物，酵母因子，昆虫信息素，辅酶A，纤维蛋白原，血管紧张素原，梅坎米胺，雷尼替丁(ranitidin)，甲腈咪胍(cimetidin)，lovastatine或异丙基肾上腺素衍生物。
本发明的其它化合物，其特征在于聚集在患病组织处或肿瘤处的物质是肽或蛋白质，特别是抗体、抗体片段如F(ab)2，F(ab)，单链抗体或CDRS。
特别优选的化合物，其特征在于聚集在患病组织处或肿瘤处的抗体是α-CEA抗体(用于生产该抗体的杂交细胞克隆保藏在分子生物学研究中心，登记号是B4-F/C3(1988年目录))或该抗体的F(ab)2，F(ab)是sFv片段或CDRS。
图1是由杂交细胞克隆号B4-F/C3生产的通过合成的连接物偶联的抗体轻链可变区和重链可变区的碱基和氨基酸序列。
此外，根据本发明的化合物，其特征在于聚集在患病组织处的物质是肽，如内皮肽(endothines)，部分内皮肽序列，内皮肽类似物，内皮肽衍生物，或内皮肽拮抗剂。
根据本发明，特别优选的化合物其特征在于肽包括以下序列cys-ser-cys-ser-ser-leu-met-asp-lys-glu-cys-val-tyr-phe-cys-his-leu-asp-ile-ile-tpr，cys-ser-cys-ser-ser-trp-leu-asp-lys-glu-cys-val-tyr-phe-cys-his-leu-asp-ile-ile-trp，cys-thr-cys-phe-thr-tyr-lys-asp-lys-glu-cys-val-tyr-tyr-cys-his-leu-asp-ile-ile-trp，cys-ser-ala-ser-ser-leu-met-asp-lys-glu-ala-val-tyr-phe-cys-his-leu-asp-ile-ile-trp，cys-ser-cys-asn-ser-trp-leu-asp-lys-glu-cys-val-tyr-phe-cys-his-leu-asp-ile-ile-trp，cys-ser-cys-lys-asp-met-thr-asp-lys-glu-cys-leu-asn-phe-cys-his-gln-asp-val-ile-trp，ala-ser-cys-ser-ser-leu-met-asp-lys-glu-cys-val-tyr-phe-ala-his-leu-asp-ile-ile-trp，ala-ser-his-ser-ser-leu-met-asp-lys-glu-ala-val-tyr-
phe-ala-his-leu-asp-ile-ile-trp，cys-ser-cys-ser-ser-trp-leu-asp-lys-glu-ala-val-tyr-phe-ala-his-leu-asp-ile-ile-trp，cys-val-tyr-phe-cys-his-leu-asp-ile-ile-trp，N-acetyl-leu-met-asp-lys-glu-ala-val-tyr-phe-ala-his-leu-asp-ile-ile-trp，或者部分序列his-leu-asp-ile-ile-trp或者环状氨基酸序列Cyclo-(Dtrp-Dasp-pro-Dval-leu)，Cyclo-(Dglu-ala-alloDile-leu-Dtrp).
根据本发明，化合物可以作为与金属离子的络合物存在。在优选的络合物中，金属离子是放射性核素。优选的放射性核素是元素Tc，Re，At，In或Ca的同位素。特别优选的是放射性核素Tc-99m。
本发明的另一个主体是一种用于生产根据本发明通式I的化合物的方法R1-X-R2(I)其中X是20个相同或不同的α-，β-和/或γ-氨基酸残基的链，所述的链含有至少一种属于甲硫氨酸、精氨酸、赖氨酸或天冬酰胺基团的氨基酸并且不含半胱氨酸，在其N末端上有一个自由基或一个通过取代氢原子与其结合的残基R1，在其C末端上有一个自由基或一个通过取代羟基与其结合的残基R2，其中R1是氢原子，含多达10个碳原子的支链或直链烷基、芳香基、烷芳基、芳烷基、烷羰基或芳羰基，它们可选择性地被羟基、氨基或羧基取代，R2是羟基，含多达10个碳原子的支链或直链烷氧基或芳氧基，它们每个都可选择性地被羟基、氨基或羧基、氨基、N(RaRb)基取代，其中Ra和Rb相同或不同并代表含多达10个碳原子的支链烷基或酰基残基，它们可选择性地被羟基、氨基或羧基取代，或者R2是磷酸残基，它们与肽、蛋白质、生物或大分子的结合体以及它们与金属离子的络合物。
根据本发明的方法，其特征在于a)氨基酸按公知的方法，逐一地按规定的顺序和另一些与合成树脂偶联的氨基酸进行酰胺化偶联，所述的氨基酸在肽合成完成后从合成树脂中分离，或b)按已知的这些化合物的化学合成方法，生产编码通式(I)的化合物的寡聚或多聚核苷酸，该生产可经过将核苷酸C-5′上的羟基与另一核苷酸的磷酸基连接或通过使用标记的寡核苷酸检测编码的MRNA链，分离所述的MRNA，接着转化成CDNA以及借助于聚合酶链式反应对其进行扩增并插入常规的表达载体中，在原核或真核细胞中表达，
和以这种方式生产的化合物任选与选择性聚集在患病组织处或肿瘤处的物质结合，在所述的物质之间存在共价结合，它用于对含氨基如肽，蛋白质，抗体或其片段，类酯这样的物质酰胺化和对含醛基的物质亚氨化，和以这种方式生产的化合物和结合体任选在还原剂或辅助配位体存在的条件下，任选以盐的形式与金属反应。
本发明的另一个主体是一种用于制备放射性药物的试剂盒及其使用说明，该试剂盒由通式I的化合物或所述化合物与肽、蛋白质、生物或大分子以及受体结合物质的结合体和任选的还原剂和辅助配位体组成它可以是干燥型或溶液型的，使用说明包括将所述化合物与以高锝酸盐或高铼酸盐溶液形式存在的Tc-99m或Re反应的说明。
本发明的另一主体是用于放射疗法和放射性诊断的放射性药物制剂，其特征在于它们含一种上面定义的根据本发明的化合物。
放射性药物制剂可以含有常用的草药辅助剂和支持物和/或具有脂质体形式。
使用不含半胱氨酸肽络合金属有许多优点。
因此本发明的肽不用昂贵的保护基技术就可以生产并且可与器官特异性探针结合，而且尽可能地节约了时间。抗体或部分抗体序列，肽的结构可以用作器官特异性探针，其中的肽结构有内皮肽，内皮肽衍生物，部分内皮肽序列，内皮肽类似物，或内皮肽拮抗剂，激素，神经激素，神经递质，生长刺激因子，植物激素，信息素，酶辅助因子，酶底物，特异性结合受体的药物，或寡核苷酸。
从上面提到的物质中选择的化合物可以是，如催产素，后叶加压素，血管紧张素，促黑激素，生长激素抑制素，tyrotropin-releasing hormones，促性腺素释放激素，睾酮，雌二醇，黄体酮，皮质醇，醛甾酮，维生素D，胃泌素，分泌素，生长激素，前列腺素，神经降压素，胰岛素，胰高血糖素，降钙素，生长激素释放激素，促乳素，encephalins，内啡肽，多巴胺，去甲肾上腺素，谷氨酸，血清素，乙酰胆碱，肾上腺素，interleucines，血管生成素，胸腺生成素，促红细胞生成素，玉米素，赤霉酸衍生物，酵母因子，昆虫信息素，辅酶A，纤维蛋白原，血管紧张素原，梅坎米胺，雷尼替丁，甲腈米胍，lovastatine或异丙基肾上腺素衍生物。
由根据本发明的肽和器官特异性探针组成的结合体也可根据遗传工程技术分离。
此外，金属络合结合位置可以在器官特异性探针中产生。首先，要测定象抗体这样的器官特异性探针氨基酸序列的三维排列，要考虑到原子半径和结合角度，并且要用数学和几何学的方法如微分几何来定位潜在的结合位置。
在这些潜在的结合位置上，没有很好地编码，或者根本没有编码，金属络合的氨基酸的核苷酸可对其进行诱变用编码金属络合的氨基酸的核苷酸取代。
金属络合位点的产生包括取代一个或几个氨基酸，所述的涉及金属络合的氨基酸被一个或几个由不涉及金属络合的氨基酸形成的“环”间断。金属络合位点根据已知的分子生物学方法产生，如使用T4聚合酶和选择引物进行双链质粒-DNA诱变(Deng等人，Anal.Bioch.，200，81-88，1992)或使用PCR进行双链质粒-DNA诱变(Landt等人，Gene，96，125-128，1990)。以这种方式操作并修饰的器官特异性探针随后可使用遗传工程技术来表达。
生物分子本身能够以这样的方式通过该方法来修饰，其特征在于保留其生物学特性，如鉴定和结合肿瘤、器官、组织或发炎病灶，另外，其特征在于它们能稳定地结合金属。因此，在所述的生物分子中产生的区域与通式I相对应，该通式带有由适当修饰的生物分子的相应片段形成的残基R1和R2。
此外，定点诱变能够改变生物分子，以便在生物分子中形成通式I的几个区域。然后络合形成金属络合物，其中的络合位置由生物分子的不同片段或部分提供，个别络合位置可以被任意的氨基酸链或其它隔离物间断。总之，重要的是保留了生物分子的原有性质，尤其是它们作为器官特异性探针功能的能力。
本发明的肽具有确定的金属键合位置并且表现显著的金属络合物性质。本发明的肽具有体内高稳定性的特征。
表1列出了根据实施例5测定的牛血浆中肽的Tc络合物稳定性的数据。Tc络合物保留了4小时的稳定性。使用根据本发明的化合物，有充分时间来进行治疗和诊断。
表1肽的Tc络合物在牛血浆中的稳定性Tc络合物 小时后的蛋白质结合稳定性(％)(％)1h 2h 4hmet-gly-met-gly-hi s-gly-his100100 10036.5±3.6arg-gly-met-gly-met-gly-gly-gly 95.7 94.692.8 21.0±0.9arg-gly-met-gly-met-gl y97.7 97.997.1 24.6±1.7发现由如抗CEA的部分抗体序列和本发明的肽组成的结合体能够使用遗传工程技术表达而保留了免疫原性。因为当使用不含半胱氨酸的肽时，可以避免在表达期间形成不需要的二硫键，从而防止了任何错误的结合体折叠。
尤其是发现放射性标记的器官特异性探针由在DD-252200中描述的α-CEA抗体(号码B4F/C3)或基片段如Fab2、Fab或sFv和不含半胱氨酸的Tc-99m络合肽组成，它与肿瘤特异性地并稳定地结合，并在肿瘤处发生快速特异性的聚集。
用于生产抗体的杂交细胞克隆保存在前体GDR的微生物研究中心(1988年目录)，登记号B4-F/C3。
测序了轻链可变区和重链可变区。所述区的核苷酸序列和相关的氨基酸序列以及合成的接头见图1。
进一步发现在剩余物中存在的结合部分可以很快地从体内消除。使用闪炼照相机或另一种用于核医学的仪器，可很好地将高浓度的放射性标记的结合体用于肿瘤定位；成像具有极佳信噪比的特征。
根据本发明的结合体的另一个显著特征是用于最佳肿瘤定位所需的时间由于在肿瘤内的特异性高聚集和良好的药物动力学性质而变得少了，它可以将对病人的处理减到最低程度，尤其是对病人的射线处理。
意外地发现不含半胱氨酸的金属络合肽本身能够用于肝功能诊断。
表2，3和4表示根据本发明化合物的器官分布和排泄动力学。所做试验在实施例2.3.、3.3和6.3中描述。
后来在肝脏中发现了大部分的放射剂量。这一结果可用于检查功能。
表2小鼠体内Tc-99m-arg-gly-met-gly-met-gly-gly-gly的器官分布和排泄动力学时间 0.25h 1.0h3.0h 5.0h％剂量/g％/g ±S.D. ％/g ±S.D. ％/g ±S.D. ％/g ±S.D.脾 0.63 0.230.300.100.330.15 0.30 0.00肝 5.27 3.001.570.471.130.23 1.27 0.47肾 4.57 1.401.500.201.270.06 0.97 0.25肺 1.20 0.260.500.100.300.00 0.20 0.10骨 0.37 0.120.200.000.170.06 0.17 0.06心 0.40 0.100.200.000.100.00 0.10 0.00脑 0.07 0.060.030.000.010.01 0.01 0.00尾 1.87 0.550.300.100.200.00 0.13 0.06肌肉0.27 0.120.100.000.040.00 0.03 0.01肠＋内含物 23.03 3.1827.17 3.0421.00 4.28 11.37 12.63皮肤0.53 0.230.170.060.100.00 0.06 0.02血液1.13 0.230.430.060.200.00 0.13 0.06
表2(续)％ID ％ ±S.D ％±S.D.％ ±S.D. ％ ±S.D.脾 0.06 0.020.040.010.030.010.03 0.00肝 6.98 2.602.070.431.480.161.27 0.29肾 1.53 0.500.470.090.420.060.26 0.06肺 0.23 0.060.090.010.050.010.03 0.01骨 0.01 0.000.010.000.000.000.00 0.00心 0.04 0.000.020.000.010.000.01 0.00脑 0.02 0.000.010.000.010.000.00 0.00尾 1.21 0.290.190.040.140.020.10 0.05肌肉 0.04 0.020.010.000.010.000.01 0.00肠＋内含物 61.01 4.2072.32 1.7255.39 10.19 20.57 18.37皮肤 2.03 0.780.590.050.300.050.21 0.05心液 2.09 0.380.810.100.380.020.19 0.06总计 ％ ±S.D ％±S.D.％ ±S.D. ％±S.D.-总器官残体83.34 3.4878.79 0.7659.50 10.52 25.56 22.40-总尿量15.04 1.4622.11 1.4220.93 1.4423.50 2.13总粪便量 0.170.2222.89 10.69 52.04 24.24-总计98.37 2.93101.08 1.94103.32 0.99 101.64 0.97
表3 小鼠体内Tc-99m-arg-gly-met-gly-met-gly的器官分布与排泄动力学时间 0.25h 1.0h 3.0h5.0h％剂量/g％/g±S.D％/g ±S.D. ％/g ±S.D. ％/g ±S.D.脾 0.400.10 0.230.060.130.060.170.06肝 5.071.21 2.131.270.700.100.630.12肾 2.430.51 0.970.120.670.120.600.00肺 0.770.06 0.430.060.200.000.100.00骨 0.300.10 0.130.060.100.000.100.00心 0.270.06 0.100.000.100.000.040.01脑 0.030.00 0.020.000.040.050.030.03尾 2.832.15 0.400.100.530.150.200.17肌肉0.230.15 0.100.000.030.010.030.01肠＋内含物 22.57 1.76 23.47 1.8010.33 3.077.201.67皮肤0.370.06 0.100.000.100.000.040.01血液0.730.06 0.270.060.130.060.100.00
表3(续)％ID ％±S.D ％± S.D.％±S.D.％ ±S.D.脾 0.040.000.030.00 0.020.000.02 0.00肝 6.951.862.621.44 0.890.130.75 0.10肾 0.840.150.310.06 0.240.030.21 0.01肺 0.160.010.080.01 0.030.000.03 0.00骨 0.010.000.000.00 0.000.000.00 0.00心 0.030.000.010.00 0.010.000.00 0.00脑 0.010.000.010.00 0.020.000.01 0.00尾 1.841.420.260.07 0.350.110.12 0.11肌肉0.040.030.010.00 0.010.000.01 0.00肠＋内含物 63.11 0.7467.20 4.58 28.36 7.5724.08 4.11皮肤1.570.220.490.07 0.270.000.15 0.02血液1.350.180.490.06 0.270.050.16 0.04总计 ％±S.D ％±S.D. ％±S.D.％±S.D.总器官残体81.05 2.0175.10 2.77 31.66 7.7926.01 3.88总尿量19.18 0.9525.57 0.39 14.51 6.7022.14 8.15总粪便量 0.820.65 52.06 16.40 48.39 11.20总计100.22 2.26101.49 2.52 98.23 5.5696.54 0.60
表4 小鼠体内Tc-99m-glu-met-gly-asn-gly-glu-cys-val-tyr-phe-cys-his-leu-asp-ile-ile-trp的器官分布与排泄动力学时间 0.25h 1.0h 3.0h 5.0h％剂量/g ％/g ±S.D％/g ±S.D. ％/g ±S.D. ％/g ±S.D.脾3.270.291.500.261.900.10 1.830.06肝10.03 0.468.170.927.470.58 7.031.50肾54.70 3.2462.57 1.6550.90 4.77 48.80 6.93肺4.930.382.830.061.930.38 1.200.26骨2.370.311.930.231.500.26 1.470.21心2.970.421.770.231.000.17 0.770.06脑0.270.060.130.060.100.00 0.100.00尾3.300.173.370.061.830.12 2.832.74肌肉 0.700.000.500.000.330.12 0.200.00肠＋内含物1.730.232.330.152.700.00 2.500.70皮肤 1.330.061.030.060.670.23 0.770.12血液 8.801.393.600.171.900.35 1.200.10
表4(续)％ID ％±S.D％ ±S.D.％±S.D.％±S.D.脾 0.370.010.150.020.240.020.240.02肝 17.76 2.3814.19 0.8313.64 0.8511.38 2.10肾 20.85 0.5623.21 1.5418.65 1.5818.30 1.91肺 0.940.130.700.140.400.080.280.07骨 0.070.010.060.000.050.000.050.00心 0.380.080.250.060.130.010.110.00脑 0.130.010.070.000.040.010.030.00尾 2.580.172.620.161.410.062.031.83肌肉 0.120.010.080.010.050.010.040.00肠＋内含物 5.370.166.670.317.480.676.260.49皮肤 5.140.543.940.112.850.362.780.48血液 19.13 3.647.850.134.260.242.500.06总计 ％±S.D ％±S.D.％±S.D.％±S.D.总器官残体 81.42 4.7769.20 0.7357.05 2.3450.93 2.43总尿量 16.20 4.2027.75 2.7541.30 2.8246.05 0.71总粪便量 0.570.410.380.552.351.26总计 97.62 0.8097.52 1.6298.73 1.0399.33 0.47
此外，发现放射性标记的器官特异性探针由部分内皮肽序列和Tc-99m络合肽组成，该探针特异性地聚集在血管的动脉粥样硬化病变处。这里又是特别快地聚集在动脉粥样硬化病灶的结合体，因此能够进行早期和高对比观察。
图2和3表示与部分内皮肽序列his-leu-asp-ile-ile-trp结合的络合Tc化合物的聚集(参见实施例7)。
本发明的肽和经与器官特异性探针偶联而获得的结合体特别适于以一种试剂盒的形式用作诊断和治疗的手段。
下面的实施例用于说明本发明。
肽合成的一般说明保护性Fmoc(9-芴基甲酯基-)衍生物优选用作保护N端的氨基酸。通式(I)的化合物在合成树脂上从羧基末端至氨基末端合成。以共价键与合成树脂结合的化合物在室温下使用97％三氟乙酸/2％三异丁基硅烷/1％水从合成树脂中分离(2-4h)并通过制备的HPLC装置(RP-18，梯度在30分钟内从0.1％三氟乙酸至60％乙腈/0.1％三氟乙酸，流速10ml/min)纯化。
实施例11.1)肽H2N-met-gly-met-gly-his-gly-his-CONH2(1.1.1)H2N-met-gly-met-gly-his-gly-his-COON(1.1.2)根据上述一般说明合成并纯化肽。
C28H44N1207S2 MWcalc.724.8det.726 (FAB-MS)
C28H43N1108S2 MWcalc.725.8det.727 (FAB-MS)1.2)H2N-met-gly-met-gly-his-gly-his-CONH2(1.2.1)或H2N-met-gly-met-gly-his-gly-his-COOH(1.2.2)的锝-99m络合物(1.2)。
在300μl磷酸盐缓冲液(Na2HPO4，0.5mol/l，pH8.5)中的0.5mg(0.69μmol)H2N-met-gly-met-gly-his-gly-his-CONH2或H2N-met-gly-met-gly-his-gly-his-COOH的溶液与50ml的0.15摩尔二水柠檬酸三钠溶液和2.5μl的0.2摩尔二水氯化锡溶液混合。在混合适当后，反应混合物与来自Mo-99/Tc-99m发生器的高锝酸盐溶液(0.4-0.9mCi混合)，在室温下保温10分钟并过滤(0.2μm滤器)。
使用HPLC分析标记物MERCK核苷柱，125×4mm，5μm；梯度在7.5分钟内从100％A至100％B；洗脱液A磷酸盐缓冲液(Na2HPO4；0.01M；pH2.0)；洗脱液B乙腈/磷酸盐缓冲液(Na2HPO4；0.01M)；pH2.0)50∶50(v/v)；流速1.0ml/min。
Tc-99m络合物的放射化学纯度大于95％。
实施例22.1)肽H2N-arg-gly-met-gly-met-gly-gly-gly-CONH2(2.1.1)H2N-arg-gly-met-gly-met-gly-gly-gly-COOH(2.1.2)根据上述一般说明合成并纯化肽。
C26H48N1208S2 MWcalc.720.08det. 722 (FAB-MS)C26H47N1109S2 MWcalc.721，8det. 723 (FAB-MS)2.2)H2N-arg-gly-met-gly-gly-met-gly-gly-gly-CONH2(2.2.1)或H2N-arg-gly-met-gly-gly-gly-COOH(2.2.2)的锝-99m络合物(2.2)。
所用溶液50.0mgSnCl2溶解于1ml 0.5mol/lHCl中，用双蒸H2O加至10ml(22.1mmol/l)。
0.5mol/l磷酸氢二钠溶液，用NaOH(0.1mol/l)将pH调至8.5。
500mg柠檬酸钠溶于10ml双蒸H2O中(170mmol/l)。
10.4mg(14.4μmol)H2N-arg-gly-met-gly-met-gly-gly-gly-CONH2或H2N-arg-gly-met-gly-met-gly-gly-gly-COOH溶于1mlNaOH(1mol/l)中。
100μlTc99m高锝酸盐具有18.4MBq(498.4μCi)的活性。
操作150μl arg-gly-met-gly-met-gly-gly-gly与750μl磷酸盐缓冲液，150μl柠檬酸溶液，7.5μlSnCl2和150μlTc—99m高锝酸盐混合并在室下保温20分钟。用2793μlPBS(pH7.4)稀释这一批标记物。总体积4000μl(pH7.4)，具有的总活性为6.2MBq(168μCi)。
用HPLC分析标记物MERCK核苷柱，125×4mm，5μm；
梯度在7.5分钟内从100％A至100％B；洗脱液A磷酸盐缓冲液(Na2HPO4；0.01mol/l，pH2.0)洗脱液B乙腈/磷酸盐缓冲液(Na2HPO4；0.01mol/l；pH2.0)50∶50(v/v)；流速1.0ml/min。
Tc—99m络合物的放射化学产率为100％。
2.3)H2N-arg-gly-met-gly-met-gly-gly-gly-CONH2的锝-99m络合物(2.2.1)的器官分布与消除。
在一次性静脉给药后，检查小鼠体内Tc-99m-arg-gly-met-gly-met-gly-gly-gly(其生产和标记，见实施例2.1.1和2.2.1)的器官分布和排泄。
操作种类小鼠，NMRI，Schering SPF，Ca，20g，n＝12。
剂量每只动物100μl，相当于54nmol，具有155.4kBq(4.2μCi)活性的arg-gly-met-gly-met-gly-gly-gly，比活＝2.88kBq/nmol(77.8nCi/nmol)。
时间给药后0.25h，1h，3h，5h(每个时间点三只动物)。
参数血液、肝、肾、肌肉、心、脑、脾肠、皮肤、肺、骨和残体中以及尿和粪便中的放射性。
溶解于PBS(pH7.4)的物质施用于臀静脉。将动物保存在带有废物接受器的笼中，给药后在那里收集尿及粪便。每次按规定的时间处死并处理三只动物。使用γ-计数器(第9号常规程序)测定血液、肝、肾、肌肉、心、脑、脾、肠、皮肤、肺、骨和残体中以及尿和粪便中的放射性。
计算下面的值每g组织剂量％，
在不同器官中以及在尿和粪便中的剂量％(见表2)。
实施例33.1)肽H2N-arg-gly-met-gly-met-gly-CONH2(3.1.1)H2N-arg-gly-met-gly-met-gly-COOH(3.1.2)根据上述一般说明合成并纯化肽。
C22H42N1006S2MWcalc.606，75det. 605(FAB-MS)C22H41N907S2 MWcalc.706，7det. 609(FAB-MS)3.2)H2N-arg-gly-met-gly-met-gly-CONH2(3.2.1)或H2N-arg-gly-met-gly-met-gly-COOH(3.2.2)的锝-99m络合物〔32.2〕。
所用溶液50.0mgSnCl2溶解于1ml0.5mol/lHCl中，用双蒸H2O加至10ml(22.1mmol/l)。
0.5mol/l磷酸氢二钠溶液，用NaOH(0.1mol/l)将pH调至8.5。
500mg柠檬酸钠溶于10ml双蒸H2O中(170mmol/l)。
10.6mg(17.5μmol)arg-gly-met-gly-met-gly溶于1mlNaOH(1mol/l)中。
100μLTc99m高锝酸盐具有18.4MBq(498.4μCi)的活性。
操作150μl arg-gly-met-gly-met-gly与750μl磷酸盐缓冲液，150μl柠檬酸溶液，7.5μl SnCl2和200μlTc-99m高锝酸盐混合并且在室温下保温20分钟。然后用2742.5μlPBS(pH7.4)稀释标记物。总体积4000μl(pH7.4)，具有6.2MBq(168μCi)的总活性。
使用PHLC分析标记物MERCK核苷柱，125×4mm，5μm；梯度在7.5分钟内从100％A至100％B洗脱液A磷酸盐缓冲液(Na2pHO4；0.01mol/l；pH2.0)；洗脱液B乙腈/磷酸盐缓冲液(Na2HPO4；0.01mol/l；pH2.0)50∶50(v/v)；流速1.0ml/min。
Tc-99m络合物的放射化学产率为100％。
3.3)H2N-arg-gly-met-gly-met-gly-CONH2的锝-99m络合物(3.2.1)的器官分布和消除。
在一次性静脉内给药后检查小鼠体内Tc-99m-arg-gly-met-gly-met-gly(其生产和标记，见实施例3.1.1和3.1.2)的器官分布和排泄。
操作种类小鼠，NMRI，Schering SPF，Ca，20g，n＝12剂量每只动物100μl，相当于66nmol，具有155.4kBq(4.2μCi)活性的arg-gly-met-gly-met-gly，比活＝2.37kBq/nmol(64nCi/nmol)。
时间给药后0.25h，1h，3h，5h(每次三只动物)。
参数血液、肝、肾、肌肉、心、脑、脾、肠、皮肤、肺、骨和残体中以及尿和粪便中的放射性。
溶于PBS(pH7.4)中的物质施用于臀静脉。将动物保存在带有废物接受器的笼中，给药后在那里收集尿和粪便。每次按规定的时间处死并处理三只动物。使用γ-计数器(第9号常规程序)测定血液、肝、肾、肌肉、心、脑、脾、肠、皮肤、肺、骨和残体中以及尿和粪便中的放射性。
计算下面的值每g组织剂量％，在不同器官中以及在尿和粪便中的剂量％(见表3)。
实施例44.1)H2N-glu-met-gly-asn-gly-glu-CONH2(4.1)根据上述一般说明合成并纯化肽。
C23H38N8011SMWcalc.634.7det，636，(FAB—MS)4.2)H2N-glu-met-gly-asn-gly-glu-CONH2的锝-99m络合物(4.2)。
在300μl磷酸盐缓冲液中(Na2HPO4，0.5mol/l.pH8.5)的0.5mg(0.8μmol)H2N-glu-met-gly-asn-gly-glu-CONH2(4.1)与50μl的0.15摩尔二水柠檬酸三纳溶液和2.5μl的0.2摩尔二水氯化锡溶液混合。通过这一混合后，反应混合物与来自Mo-99/Tc-99m发生器的高锝酸盐溶液(0.4-0.9mCi)混合，在室温下保温10分钟，并且过滤(0.2μm滤膜)。
使用HPLC分析标记物MEREK核苷柱，125×4mm，5μm；梯度在7.5分钟内从100％A至100％B；洗脱液A磷酸盐缓冲液(Na2HPO4；010/M；pH2.0)；洗脱液B乙腈/磷酸盐缓冲液(Na2HPO4；0.01mol；pH2.0)50∶50(v/v)；流速1.0ml/min。
Tc-99m络合物的放射化学纯度大于95％。
实施例5肽的Tc络合物的体内稳定性不结合蛋白质的肽Tc络合物的稳定性按以下步骤测定根据上述一般说明合成并纯化肽并按实施例1所述标记。0.5ml(相当于0.5mCi)标记物与4.5ml牛血浆(Fa.Kraeber)或PBS混合。两份样品中，每份分别在混合后立即及混合后1h，2h和4h取出1ml样品，通过超滤(Centricon30000，Fa.Amicon)分离蛋白质。滤液用HPLCMERCK核苷柱，125×4mm，5μm分离；梯度在7.5分钟内从100％A至100％B洗脱液A磷酸盐缓冲液(NaHPO4，0.01M；pH2.0)；洗脱液B乙腈/磷酸盐缓冲(Na2HPO40.01mol；pH2.0)50∶50(v/v)；流速1.0ml/min。
肽Tc络合物的蛋白质结合从与牛血浆和与PBS保温的络合物的峰面积差计算。通过取总的峰面积作为100％并计算络合物峰面积的百分数来测定稳定性。所检测肽的络合物保持稳定达4h(见表1)。
实施例66.1)H2N-glu-met-gly-asn-gly-glu-cys-val-tyr-phe-cys-his-leu-asp-ile-ile-trp-COOH(6.1)根据上述一般说明合成并纯化肽。
MWcalc.2039.31det. 2030(FAB—MS)6.2)H2N-glu-met-gly-asn-gly-gly-cys-val-tyr-phe-cys-his-leu-asp-ile-ile-trp-COOH的锝—99m络合物(6.2)。
所用溶液50mgSnCl2溶于10ml0.1mol/lHCl中(22.1mmol/l)。
0.1mol/l磷酸氢二钠水溶液，用NaOH(0.1mol/l)将pH调至7.5。
葡萄糖酸钠溶液(0.01mol/l双蒸H2O)0.5mg(0.272μmol)H2N-glu-met-gly-asn-gly-glu-cys-val-tyr-phe-cys-his-leu-asp-ile-ile-trp-COOH溶于500μmlH2O(双蒸水)和100μl磷酸盐缓冲液中。
100μlTc99m高锝酸盐具有1.8MBq(48μCi)的活性。
操作用Tc-99m标记葡萄糖酸盐2ml葡萄糖酸钠溶液与0.5mlTc-99m高锝酸盐(37MBq/1mCi)混合并再次与15μlSnCl2混合。用TLC，硅胶60来检查葡萄糖酸盐是否标记完全；洗脱液为丙酮。
用Tc-99m葡萄糖酸盐标记H2N-glu-met-gly-asn-gly-glu-cys-val-tyr-phe-cys-his-leu-asp-ile-ile-trp-COOH120μl H2N-glu-met-gly-asn-gly-glu-cys-val-tyr-phe-cys-his-leu-asp-ile-ile-trp-COOH与2mlTc-99m葡萄糖酸Na溶液混合并在室温下保温15分钟。总体积2120μl(pH7.0)，具有7.1MBq(193.2μCi)的总活性。标记物用HPLC分析MERCK核苷柱，125×4mm，5μm；梯度在8分钟内从100％A至100％B，洗脱液A磷酸盐缓冲液(Na2HPO4；0.01M；pH7.5)；
洗脱液B乙腈/磷酸盐缓冲液(Na2pHO4；0.01mol/lpH7.5)50∶50(v/v)；流速1.0ml/min。
Tc-99m络合物的放射化学产率为95％。
6.3)H2N-glu-met-gly-asn-gly-glu-cys-val-tyr-phe-cys-his-leu-asp-ile-ile-trp-COOH的锝-99m络合物(6.2)的器官分布及消除。
有一次性静脉内给药后检查小鼠体内Tc-99m-gly-met-gly-asn-gly-glu-cys-val-tyr-phe-cys-his-leu-asp-ile-ile-trp(生产和标记见实施例6.1和6.2)的器官分布和排泄。
操作种类小鼠，NMRI，Schering SPF.Ca.20g，n＝12。
剂量每只动物100μl，相当于242pmol glu-met-gly-asn-gly-glu-cys-val-tyr-phe-cys-his-leu-asp-ile-ile-trp，具有111kBq(3μCi)的活性，比活＝459kBq/nmol(12.4μCi/nmol)。
时间给药0.25h，1h，3h，5h(每次三只动物)。
参数血液、肝、肾、肌肉、心、脑、脾、肠皮肤、肺、骨和残体中以及尿和粪便中的放射性。
溶于PBS(pH7.4)中的物质施用于臀静脉。将动物保存在带有废物接受器的笼中，给药后在那里收集尿和粪便。每次按期处死三只动物并制备样品。使用γ-计数器(第9号常规程序)测定血液、肝、肾、肌肉、心、脑、脾、肠、皮肤、肺、骨和残体中以及尿和粪便中的放射性。
计算下面的值每g组织的剂量％，不同器官中以及尿和粪便中的剂量％(见表4)。
实施例7WHHL兔中动脉粥样硬化血管病灶的检查通过一次性静脉内使用Tc-99m-glu-met-gly-asn-gly-glu-cys-val-tyr-phe-cys-his-leu-asp-ile-ile-trp后，使用γ-照相机来显示WHHL兔中动脉粥样硬化血管病灶。如实施例6.1和6.2所述来完成生产和标记。
操作种类Froxfield兔HH047560，Emsicon-Jung，雌性，4.3kg，1992，10.15.出生。1993.5.3的血清胆固醇水平为24.6mmol/l。
麻醉Rompun/ketavet(1∶2)，ca.3mli.m.(最初)，100μl/mini.v.
剂量1ml，相当于54.3nmol glu-met-gly-asn-gly-gly-cys-val-tyr-phe-cys-his-leu-asp-ile-ile-trp，具有37MBq(1mCi)的活性，比活＝681kBq/nmol(18.4μCi/nmol)。
记录参数γ-照相机Elcint SP4HR，能量140kev，速率方式标准准直仪4，格式字码，框架尺寸128，图象扩大1，旋光性180°。
测定参数不同器官内和主动脉内的相对强度。
观察周期i.v.使用Tc-99m-glu-met-gly-asn-gly-glu-cys-val-tyr-phe-cys-his-leu-asp-ile-ile-trp后0-5h。
在整个试验期间做不同长度和来自不同位置的平面记录。5h后使用T-61(1ml)处死兔子，摘除主动脉，完成苏丹(III)染色和放射自显影图(磷成像器)。
结果1ml Tc-99m-glu-met-gly-asn-gly-glu-cys-val-tyr-phe-cys-his-leu-asp-ile-ile-trp经耳静脉给WHHL兔用药。由于LDL受体缺乏或缺陷，WHHL兔在血液中表现出高LDL水平，因此自发形成动脉粥样硬化性血管病变。左侧的记录0.5hp.i.表现出在心、肝、肾和膀胱中的高活性和在骨中的低活性。可见腹动脉区的动脉粥样硬化(见图2)。
给药后5h处死兔子，并且完成苏丹(III)染色和放射自显影图(见图3)。比活性在血小板中为353cpm/mm2，在正常动脉壁上为42cpm/mm2(浓缩系数＝8)。
实施例8带有Tc结合肽的单链FV片段根据标准的方法从产生鼠抗CEA的杂交瘤细胞培养物中分离mRNA，并且从mRNA产生的cDNA用作PCR的模板，与适合的引物组合生产该抗体的完全VL和VH编码区。
合成的寡核苷酸用于编码(GGGGS)3的接头肽，另一合成的寡核苷酸用于编码PPMGMGHG序列的Tc-结合肽(Tc肽)。根据标准方法用TAQ聚合酶进行的PCR产生一种结构，它可编码VH-接头-VL-TC-肽或VL-接头-VH-TC-肽序列。
在修饰载体内(PHEN衍生物)克隆后，在E.coli，TG1菌株内进行表达，该载体具有来自Erwinia Carotivorum果胶裂合酶的信号肽编码区，它用于在外周胞质区以可溶性单链FV片段的形式进行表达。通过Western印迹技术，使用抗接头肽或TC结合肽的多克隆血清来证明表达。
外周胞质部分通过渗压休克获得，并且可溶性单链Fv片段通过以抗个体基因型抗体为基础的亲和色谱法纯化，抗体用于抗接头肽，或通过金属螫合柱依据TC-肽的金属离子亲和性进行亲和色谱纯化。
实施例9结构中具有其TC-键合位置的单链Fv片段单链FV片段的构建体如实施例1所述产生，而TC-结合变异体由VL结构区(环位置L36至L43)或在VH结构区(环位置H38至H45)使用合成引物进行而产生；所述的变异体具有在VH或VL区，或者在两个区中的MGMGHG环序列，用于提高Tc标记。
权利要求
1.通式I的化合物，R1-X-R2(I)其中X是20个相同或不同的α-，β-和/或γ-氨基酯残基的链，所述的链含有至少一个属于甲硫氨酸，精氨酸，赖氨酸和天冬酰胺基团的氨基酸并且不含半脱氨酸，在其N末端上有一个自由基或一个通过取代氢原子与其结合的残基R1，在其C末端上有一个自由基或一个通过取代羟基与其结合的残基R2，其中R1是氢原子，含多达10个碳原子的支链或直链烷基，芳香基，烷芳基，芳烷基，烷羰基或芳羰基，它们任选被羟基，氨基或羧基取代，R2是羟基，含多达10个碳原子的支链或直链烷氧基或芳氧基，它们每个都可任选地被羟基，氨基或羧基，氨基，N(RaRb)基取代，其中Ra和Rb相同或不同并代表含多达10个的碳原子的支链烷基或酰基残基，它们可任选地被羟基，氨基或羧基取代，或者R2是磷酸残基，它们与肽，蛋白质，生物成大分子的结合体以及它们与金属离子的络合物和它们的水溶性盐。
2.根据权利要求1的化合物，其特征在于链X由3至15个氨基酸组成。
3.根据权利要求1的化合物，其特征在于链X由3至8个氨基酸组成。
4.根据权利要求1至3中至少一项的化合物，其特征在于R1是单键或氢原子。
5.根据权利要求1至4中至少一项的化合物，其特征在于R2是单键、羟基或氨基。
6.根据权利要求1的化合物，其特征在于它们包括以下序列glu-met-gly-asn-gly-glu，gly-gly-gly-gly-gly-met，met-gly-gly-gly-gly-met，met-gly-met-gly-his-gly-his，met-gly-met-gly-met-gly-met-gly，gly-gly-met-gly-met-gly-gly-gly，arg-gly-met-gly-met-gly-gly-gly，arg-gly-met-gly-met-gly，arg-arg-gly-gly-gly-glu，arg-gly-gly-gly-gly-gly，met-gly-met-gly-his-gly，ala-lys-his-lys-his-his，gly-met-arg-met-gly-arg，gly-met-lys-met-gly-arg，gly-gly-met-arg-met-gly-gly-gly或gly-gly-met-lys-met-gly-gly-gly.
7.根据上述权利要求之一的化合物，其特征在于结合体与选择性地聚集在患病组织或肿瘤内的物质一起存在，在所述的物质之间存在共价结合，它用于对含氨基如肽、蛋白质、抗体或其片段、类酯这样的物质酰胺化和对包括醛基的物质亚胺化。
8.根据权利要求7的化合物，其特征在于聚集在患病组织处的物质是激素，神经激素，神经递质，生长刺激因子，植物激素，信息素，酶辅助因子，酶底物，特异性地结合受体的药物，或寡核苷酸。
9.根据权利要求8的化合物，其特征在于聚集在患病组织处的特质是催产素，后叶加压素，血管紧张素，促黑激素，生长激素抑制素，tyrotropin-releasing hormones，促性腺激素释放激素，睾酮，雌二醇，黄体酮，皮质醇，醛甾酮，维生素D，胃泌素，分泌素，生长激素，前列腺素，神经降压素，胰岛素，胰高血糖素，降钙素，生长激素释放激素，肿乳素，encephalin，内啡肽，多巴胺，去甲肾上腺素，谷氨酸血清素，乙酰胆碱，肾上腺素，interleucines，血管生成素，胸腺生成素，促红细胞生成素，玉米素，赤霉酸衍生物，酵母因子，昆虫信息素，辅酶A，纤维蛋白原，血管紧张素原，梅坎米胺，雷尼替丁，甲腈咪胍，lovastatine或异丙基肾上腺素衍生物。
10.根据权利要求7的化合物，其特征在于聚集在患病组织处或肿瘤处的物质是肽或蛋白质，尤其是抗体，象F(ab)2，F(ab)这样的抗体片段，单链抗体或CDRS。
11.根据权利要求10的化合物，其特征在于聚集在患病组织处或肿瘤处的抗体是α-CEA抗体，用于生产该抗体的杂交细胞克隆保存在分子生物学研究中心，登记号为B4-F/C3(1988年目录)或该抗体的F(ab)2，F(ab)是sFv片段或CDRS。
12.根据权利要求7的化合物，其特征在于聚集在患病组织内的物质是肽，如内皮肽，部分内皮肽序列，内皮肽类似物，内皮肽衍生物，或内皮肽拮抗剂。
13.根据权利要求12的化合物，其特征在于肽包括以下序列cys-ser-cys-ser-ser-leu-met-asp-lys-glu-cys-val-tyr-phe-cys-his-leu-asp-ile-ile-trp，cys-ser-cys-ser-ser-trp-leu-asp-lys-glu-cys-val-tyr-phe-cys-his-leu-asp-ile-ile-trp，cys-thr-cys-phe-thr-tyr-lys-asp-lys-glu-cys-val-tyr-tyr-cys-his-leu-asp-ile-ile-trp，cys-ser-ala-ser-ser-leu-met-asp-lys-glu-ala-val-tyr-phe-cys-his-leu-asp-ile-ile-trp，cys-ser-cys-asn-ser-trp-lue-asp-lys-glu-cys-val-tyr-phe-cys-his-leu-asp-ile-ile-trp，cys-ser-cys-lys-asp-met-thr-asp-lys-glu-cys-le-asn-phe-cys-his-gln-asp-val-ile-trp，ala-ser-cys-ser-ser-leu-met-asp-lys-glu-cys-val-tyr-phe-ala-his-leu-asp-ile-ile-trp，ala-ser-ala-ser-ser-leu-met-asp-lys-glu-ala-val-tyr-phe-ala-his-leu-asp-ile-ile-trp，cys-ser-cys-ser-ser-trp-leu-asp-lys-glu-ala-val-tyr-phe-ala-his-leu-asp-ile-ile-trp，cys-val-tyr-phe-cys-his-leu-asp-ile-ile-tyr，N-acetyl-leu-met-asp-lys-glu-ala-val-tyr-phe-ala-his-leu-asp-ile-ile-trp，或部分序列his-leu-asp-ile-ile-trp，或环状氨基酸序列Cyclo-(Dtrp-Dasp-pro-Dval-leu)，Cyclo-(Dglu-ala-alloDile-leu-Dtrp)
14.根据上述权利要求中的至少一项的化合物，其特征在于络合物的金属离子是放射性核素。
15.根据权利要求14的化合物，其特征在于放射性核素是元素Tc、Re、At、In或Ca的同位素。
16.根据权利要求14的化合物，其特征在于放射性核素是Tc-99m。
17.生产通式I化合物的方法，R1-X-R2(I)其中X是20个相同或不同的α-，β-和γ-氨基酸残基的链，所述的链含至少一个属于甲硫氨酸，精氨酸，赖氨酸和天冬酰胺基团的氨基酸并且不含半胱氨酸，在其N末端上有一个自由基或一个通过取代氢原子与其结合的残基R1，在其C末端上有一个自由基或一个通过取代羟基与其结合的残基R2，其中R1是氢原子，含多达10个碳原子的支链或直链烷基，芳香基，烷芳基，芳烷基，烷羰其或芳羰基，它们可任选地被羟基，氨基或羧基取代，R2是羟基，含多达10个碳原子的支链或直链烷氧基或芳氧基，它们每个都可任选地被羟基，氨基或羧基，氨基，N(RaRb)基取代，其中Ra和Rb相同或不同并且代表含多达10个碳原子的支链烷基或醛基残基，它们可以被羟基，氨基或羧基取代，或者R2是磷酸残基，以及它们与肽，蛋白质，生物或大分子的结合体以及它们与金属离子的络合物，其特征在于a)氨基酸按公知的方法，逐一地按照所需顺序与合成树脂偶联的氨基酸进行酰胺化偶联，所述的氨基酸在肽的合成完成后从合成树脂中分离。或b)按已知的这些化合物的化学合成方法生产编码通式(I)的化合物的寡聚或多聚核苷酸该生产可通过将一个核苷酸C-5’上的羟基与另一核苷酸的磷酸基连接或通过便用标记的寡核苷酸检测编码的mRNA链，分离所述的mRNA，接头转化成cDNA并借助于聚合酶链反应扩增，插入常规的表达载体并在原核或真核细胞中表达来进行，和如果需要，以这种方式生产的化合物可与选择性聚集在患病组织处或肿瘤处的物质结合，在所述的物质之间存在共价结合，它用于对含氨基如肽、蛋白质、抗体或其片段、类酯这样的物质酰胺化和对包括醛基的物质亚氨化，和以这种方式生产的化合物和结合体任选在还原剂或辅助配位体存在的条件下，可任选地与以盐的形式存在的金属反应。
18.用于制备放射性药物的试剂盒和其使用说明书，试剂盒由根据权利要求1至13中任何一项的化合物，以及还原剂和可任选的辅助配位体组成，可以是干燥型或者溶液型，使用说明书包括用于将所述化合物与以高锝酸盐或高铼酸盐溶液形式存在的Tc-99m或Re反应的说明。
19.用于放射疗法或放射性诊断的放射性药物制剂，其特征在于它含有根据权利要求1至16中的任何一项的化合物。
20.根据权利要求19的放射性药物制剂，其特征在于它含有以脂质体形式存在的根据权利要求1至16的化合物。
全文摘要
本发明涉及不含半胱氨酸的金属络合肽，它们可以直接或通过连接物与器官特异性探针偶联，从而作为一种结合体特异性地在肿瘤、器官、组织或发炎病灶处聚集，所述的器官特异性探针是如用于抗象癌胚抗原(CEA)这样的肿瘤相关性抗原的抗体或部分抗体序列，从而它们特异性地在肿瘤处聚集。本发明进一步涉及用于生产不含半胱氨酸的金属络合肽以及它们的结合体的方法。本发明进一步涉及利用所述的结合体作为体内诊断或体内治疗的一种试剂盒的成分和包括所述的结合体和放射性核素的放射性药物。器官特异性结合体用于肿瘤、器官或发炎病灶的显示。
文档编号C07K16/32GK1134159SQ94193979
公开日1996年10月23日 申请日期1994年10月27日 优先权日1993年11月1日
发明者J·康拉德, L·丁克尔伯格, S·尔伯, C·弗罗梅尔, W·霍奈, W·科拉姆, G·库特奈尔, R·马林, H·M·斯切尔, J·斯克内德-梅格奈尔, R·斯坦布雷彻尔 申请人:柏林弗赖恩大学诊断研究学院有限公司