专利名称：表达牛病毒性腹泻病毒(bvdv)被膜糖蛋白的复制型不致病病毒的制作方法
技术领域：
本发明涉及牛病毒性腹泻病毒(BVDV)及其治疗疫苗的领域。文献资料van Zijl，M.et al，Live Attenuated Pseudorabies Virus ExpressingEnvelope Glycoprotein E1 of Hog Cholera Virus Protects Swine a-gainst both Pseudorabies and Hog Cholera，Journal of Virology，Vol.65，No.5，pp.2761-2765(1991).U.S.patent 4,703,011，Kit，M.，and Kit，S.，Thymidine Kinase Deletion Mutants of Bovine Her-pesvirus-1，issued 27 October 1987.U.S.patent 4,824,667，Kit，M.，and Kit，S.Thymidine Kinase Deletion Mutants of Bovine Her-pesvirus-1，Vaccines Against Infectious Bovine Rhinotracheitis Con-taining Same and Methods for the Production and Use of Same，issued25 April，1989.Collett，M.S.，et al.，Proteins Encoded by BcvineViral Diarrhea VirusThe Genomic Organization of a Pestivirus，Vi-rology，Vol 165 PP·200-208(1988).Collett，M.S.，et al.，Molec-ular Cloning and NucleotideSequence of the Pestivirus Bovine Viral Di-arrhea Virus，Virology，Vol.165 PP.191-199(1988).
牛病毒性腹泻病毒(BVDV)是属于黄热病病毒(Flaviviridae)科的鼠疫病毒。它在绵羊、山羊、特别是牛中引起许多不同的症状。该症状取决于动物的年龄，生理学和病毒学状态。在年幼的敏感性牛犊和年幼的成体中，它引起的疾病的特征为高发病率和低死亡率。症状可包括发烧、抑郁，环鼻分泌液体，腹泻及偶尔口腔溃疡。除了这些初级影响外，该病毒也引起免疫抑制。尽管初级BVDV感染一般相当轻微，但该病毒可能加强或增强其它协同感染微生物的致病性。
在老龄或敏感动物中，BVDV引起与上面在年幼敏感牛犊中所述的那些症状相似的症状。另外，在妊娠动物中，病毒具有穿过胎盘并感染胎儿的能力。该感染的后果取决于胎龄以及它是否处于其免疫系统具有足够能力的阶段。感染的可能后果包括胎儿重吸收，流产，僵化，先天缺陷，分娩缺陷，生出持续感染BVDV的牛犊，和完全正常的牛犊。出生的持续感染BCDV的牛犊体现了该BVDV致病复合体中最重要的部分。持续感染的动物将大量病毒排放到其环境中，可能感染敏感动物。而且，即使持续感染的动物对在子宫中感染它们的病毒具有免疫耐受性，但当被其它亲缘关系密切的BVDV生物型感染时，它们也会形成疾病。这些感染的特征是发病率低(因为相对来说正好在妊娠期间感染而产生被BVDV持续感染的正常牛犊的妊娠动物不会有许多)，但死亡率高。该疾病综合症称为粘膜疾病，并且其自身表现通常为极急性症状，牛犊死于过多的含大量鲜血的水样腹泻。
该病毒的重要性和其在牛群中的广泛存在在试图预防BVDV感染的尝试中导致形成了许多疫苗。这些疫苗根据灭活或减毒的传统观念形成，但由于BVDV的特性，它们有许多明显的缺陷。
普遍承认灭活的疫苗制品不如减毒的活疫苗有效。来自灭活疫苗制品的灭活抗原进行外源性加工。注射到动物体后，抗原成为动物可溶性蛋白成份的一部分。通过胞饮机制抗原进入抗原呈递细胞并通常产生抗体。令人遗憾的是，由于抗体不能进入细胞，它们一般仅能在成熟病毒从细胞中释放时打断病毒生活史。另一方面，来自在细胞内复制的活病毒的抗原进行内源性加工且该机制产生优选的细胞介导的免疫应答。细胞介导的免疫应答可识别被病毒感染的细胞且具有在较早阶段打断病毒生活史的能力。因此，在对许多病毒感染的免疫防御中认为细胞介导的应答极其重要。
由于细胞介导的应答，因此诸如疫苗的减毒活产品应诱导有效的细胞介导的应答。对于BVDV，为产生活疫苗而对病毒的减毒通常不阻止疫苗病毒引起正常情况下与野外分离物相关的免疫抑制(Roth J.A.and Kaeberle M.L.，Suppression of Neutrophil and Lym-phocyte Function Induced by a Vaccinal Strain of Bovine Viral Diar-rhea Virus With or Without the Adninistration of ACTH，AmericamJournal of Veterinarg Research，Vol.44 PP·2366-2372(1983))。疫苗阻止免疫抑制反应的失败使疫苗产生了严重的缺陷。动物拥有者可能接种动物以使其抵抗疾病，但由于疫苗的该特性，拥有者反而给其它疫病感染动物提供了机会。这就通使拥有者使用灭活的BVDV疫苗，但由于免疫系统的作用方式，该疫苗并不特别有效。
总之，灭活的疫苗安全但不特别有效，而减毒的活疫苗较有效，但在某些情况下可能不很安全。
本发明结合了减毒活疫苗的有效性和灭活疫苗的安全性。牛泡疹病毒1型(BHV—1)是另一种主要的牛病原体，它产生呼吸道疾病。因此，与BVDV共同的是，BHV—1也在粘膜表面复制。我们取得了编码gp53的基因，gp53是BVDV病毒的主要糖蛋白，宿主对它产生有效的免疫反应，在牛泡疹病毒—1(BHV—1)中表达了该蛋白，这一重组病毒(BHV/BVDV gp53)用作抗，BVDV的疫苗。(Do-nis，R.O.and Dubovi，E.J.，Glycoproteins of BovineViral Diar-rhoea Mucosal Disease Virus in Infected Bovine Cells，Journal of Gen-eral Virology，Vol.68，pp.1607-1616(1987)和Magar，R.，et al.，Bovine Viral Diarrhea Virus ProteinsHeterogeneity of Cy-topathogenic and Noncytopathogenic Strains and Evidence of 53KGlycoprotein Neutralization Epitope，Veterinary Microbiology.Vol.16，pp.303-314.引用的参考文献列入本文以供参考)。
一种用于预防由牛病毒性腹泻病毒(BVDV)引起的疾病的复制型不致病病毒，其中所说的复制型不致病病毒包括取自BVDV病毒的基因或基因组合，所说的复制型不致病病毒在功能上可表达所说的基因或基因组合。本发明包括下列实施例一种病毒，其中所说的复制型不致病病毒是减毒的，选自减毒的牛泡疹病毒1型(BHV—1)，减毒的腺病毒，减毒的牛乳头炎病毒，减毒的牛乳头状瘤病毒，或减毒的假狂犬病病毒。一种病毒，其中所说的复制型不致病病毒是减毒的并含有且表达下列基因的任意组合编码gp48，gp25，p14衣壳蛋白，p20N—末端蛋白酶和p125/p80蛋白质的基因。一种病毒，其中的减毒经过使胸苷激酶(tk)基因失去功能来实现。
一种病毒，其中的信号肽在所说的牛泡疹病毒1型(BHV—1)中插入到编码gp53的基因或基因组合的前面。一种病毒，其中所说的编码gp53的基因插入到灭活的胸苷激酶(tk)基因位点。一种病毒，其中用于产生该病毒的在功能上表达的基因或基因组合包含具有完整病毒DNA的重组质粒，所说的质粒包含a)含有胸苷激酶(tk)基因且胸苷激酶(tk)基因具有缺失的BHV—1基因组DNA片段，b)插入胸苷激酶(tk)基因缺失位置的启动子/多聚腺苷化信号，c)位于gp53基因或基因组合之前的信号肽基因序列，将它们全部插入到启动子和多聚腺苷酸化信号之间。一种病毒，其中所说的质粒由具有质粒pHAS4特征的质粒构成。一种病毒，其中所说的信号肽基因序列取自任意充分鉴定的信号肽序列，如见于Perlman，D.，etal.，J.Mol.Biol.Vol.167pp.391-409(1983)(以参考文献引用)的充分鉴定的39个信号肽序列例子中的任意序列。一种病毒，其中所说的信号肽基因序列取自假狂犬病病毒gIII基因(PRV)和/或中生长激素(BGH)。
一种病毒，其中的质粒选自下列质粒、a).pBHVtK ex-1∷BGH/p53；b)pBHVtK ex-1∷gIII/p53；c)pBHVtKex-3∷BGH/p53；或d)pBHVtKex-3∷gIII/p53。一种生产在功能上表达的基因或基因组合的产物的病毒，选自下列病毒中的一种T11—3，T11—6或T11—8。一种病毒，其中用于产生该病毒的在功能上表达的基因或基因组合包括具有完整病毒DNA的重组质粒，所说的质粒包含a)含有胸苷激酶(tk)基因和具有胸苷激酶(tk)基因缺失的BHV—1基因组DNA片段，b)在胸苷激酶(tk)基因缺失处插入的启动子/多聚腺苷化信号，c)在启动子和多聚腺苷化信号之间插入的gp53基因或基因组合。一种病毒，其中的质粒是pBHVtK ex-3∷p53.选自下列病毒之一的病毒T2—3#3或T2—2#5。一种用于预防由牛病毒性腹泻病毒(BDVD)引起的疾病的疫苗，包含本文所述的药用上有效量的病毒和一种载体。
上述用于预防由牛病毒性腹泻病毒(BDVD)引起的疾病的疫苗，包含上述药用上有效量的病毒和一种载体，所说的载体包含任意生理缓冲介质，即、含2.5到15％的无抗BHV抗体的血清之介质(PH大约为7.0到7.4)。
一种免疫动物抵抗由牛病毒性腹泻病毒(BDVD)引起的感染性疾病的方法，包含给动物施用本文所述的药用上有效量的病毒或疫苗。
一种制备本文所述的病毒的方法，包括a)分离引起BVDV的在功能上表达的基因或基因组合，b)将所说的基因或基因组合插入到复制型不致病病毒中，c)选择在功能上可表达所说的基因或基因组合之产物的活病毒。
一种制备本文所述的病毒的方法，其中用于产生该病毒的在功能上表达的基因或基因组合物经过包括将质粒与完整病毒DNA组合的方法来生产，所说的质粒包含a).含有胸苷激酶(tk)基因且具有胸苷激酶(tk)基因缺失的BHV—1基因组DNA片段，b)将启动子/多聚腺苷酸化信号插入所说质粒的胸苷激酶(tk)基因缺失处，c)在启动子和多聚腺苷酸化信号之间插入gp53基因或基因组合物，d)用所说的质粒转染细胞以产生含有插入活病毒中的所说的功能性基因或基因组合物的重组病毒，该活病毒在通常的宿主中不引起免疫抑制并表达所说的功能性基因或基因组合物。
一种制备本文所述的病毒的方法，其中用于产生该病毒的在功能上表达的基因或基因组合物由包括将质粒与完整病毒DNA组合的方法来生产，所说的质粒包含a)含有胸苷激酶(tk)基因且该胸苷激酶(tk)基因具有缺失的BHV—1基因组DNA片段，b)将启动子/多聚腺苷酸化信号插入所说质粒的胸苷激酶(tk)基因缺失处，c)将前面带有信号肽基因序列的gp53基因或基因组合插入启动子和多聚腺苷酸化信号之间，d)用所说的质粒转染细胞以产生含有插入活病毒中的所说的功能性基因或基因组合物的重组病毒，该活病毒在通常的宿主中不引起免疫抑制并表达所说的功能性基因或基因组合物。
图1、用于将外源基因插入BHV—1的穿梭载体的构建。
图2、在BVDV gp53基因上加上信号肽序列的方法。
图3、用于将gp53插入BHV—1中的5个穿梭质粒的图谱a.实施例1pBHVtKex-3∷p53b.实施例2pBHVtKex-1∷BGH/p53c.实施例3pBHVtKex-1∷gIII/p53d.实施例4pBHVtKex-3∷BGH/p53e.实施例5pBHVtKex-3∷gIII/p53图4.BHV-1/gp53重组病毒预期的转录图谱。
图5.Northem印迹显示了gp53信使RNA在BHV-1重组体中的转录。
图6.免疫沉淀显示了gp53蛋白质在BHV-1重组体中的表达。
下面所用的全部术语是本领域的技术人员易于理解的。在许多处，装置或试剂的厂商名称在命名的装置或试剂后的圆括号中提供。通常使用的术语，试剂和缓冲液，如“质粒”，“Klenow片段”，“再连接钝末端”，“Tris”，螯合缓中液，如EDTA和EGTA，以及通常使用的色谱柱在提及时不作进一步的解释。
在对用于本发明的化合物的构建的描述中，使用标准分子生物学技术并在此简要命名或描述。这些技术的详细解释可见标准实验室手册，如“Molecular Cloninga Laboratory Manual”(1989)，Sam-brook，et，al.，Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Harbor，NewYork，或“Current Protocols in Molecwlar Biology”(l991)，Ausubel，F.M.，et.al.，eds.，Wiley Interscience，New York.
本发明结合了减毒活疫苗的有效性和灭活疫苗的安全性。我们获取了编码pg53的基因，它是BVDV病毒的主要糖蛋白，针对该蛋白宿主可产生有效的免疫反应，在牛泡疹病毒—1(BHV)中表达该蛋白，该重组病毒(BHV/BVDV pg53)用作抗BVDV的疫苗。
牛泡疹病毒(BHV)是产生呼吸疾病的另一类主要的牛病原体。因此，与BVDV相同的是，BHV也在粘膜表面复制。对于BVDV，复制主要在消化道粘膜界面，在呼吸道界面的复制较少。对于BHV，在呼吸道界面的复制占优势。共同的粘膜免疫系统保证了在一个表面产生的免疫反应在其它表面仍具有效力。因此，本发明的重组病毒BHV/BVDV gp53在给奶牛、绵羊或山羊施用时(优选经过鼻内途经)，在呼吸道粘膜进行复制并产生免疫反应。
BVDV gp53基因在BHV中表达前，使用已知的方法使BHV病毒的胸苷激酶基因缺失以减毒病毒。BHV(一种活的减毒病毒)可复制并产生细胞介导的反应。作为复制过程的一部分，还会表达BVDV pg53基因，由于病毒在细胞内，用于针对重组病毒BVDVgp53部分的细胞介导的反应之正确加工也会发生。最重要的是，该反应的发生没有可能引起免疫抑制的副作用，因为仅存在一部分BVDV病毒。因此，本发明结合了BVDV减毒活病毒疫苗的有效性和灭活制品的安全性。
方法部分所提供的实施例只用于解释的目的，不是为了以任何方式限制本发明的范围。所有的介质和缓冲溶液都在玻璃蒸馏水中配制，除非另有说明。组合物和用药本发明的药用有效量的疫苗可以与药用上可接受的载体或稀释剂一起使用，作为在动物，如牛、绵羊或山羊中抗BHV-1和BVDV的疫苗。
在本发明中有用的药用上可接受的载体或稀释剂的例子包括任何生理缓冲介质，即、pH大约为7.0至7.4，含大约2.5至15％血清，血清中不含抗BHV抗体(即BHV血清阴性)。不含γ球蛋白的血清优于含γ球蛋白的血清。本发明中所使用的血清的例子包括胎牛血清，羔羊血清，马血清，猪血清，和山羊血清。含量从大约0.5至3.0％的血清蛋白，如猪白蛋白或牛血清白蛋白(下文称为“BSA”)可用于代替血清。然而，需要避免使用在接种动物时诱导过敏反应的存在于载体或稀释剂中的外源蛋白质。
病毒可在任何常规含磷酸盐缓冲液，谷氨酸盐，酪蛋白胨及蔗糖或山梨糖，或含磷酸盐缓冲液，乳糖，葡聚糖和谷氨酸盐的稳定溶液中稀释。
优选本发明的疫苗病毒以至少105到106PFV/ml的滴度贮存于-70℃到-90℃或以冻干状态贮存于2℃至7℃。冻干病毒可用无菌蒸馏水或使用含保存剂如庆大霉素和两性霉素B或青霉素和链霉素的水稀释剂重新配制备用。
给药的有用剂量的变化取决于接种动物的年龄，重量和种类以及给药的方式。例如，合适的剂量可以是大约104.5到107PFV/动物，优选大约104.5至105.5PFV。
本发明的疫苗可经鼻内，阴道内或肌肉内给药，鼻内途径是优选的给药方式。
本发明的用途本发明试图给用户提供一种用于预防BVDV引起的疾病的有效疫苗，其中的疫苗可安全地和有效地经肌肉内，鼻内或阴道内给药。经鼻内是优选的给药途径。
生产本发明的疫苗的目的是治疗疾病，优选通过预防达到治疗目的。预防或预防应用指防止宿主形成疾病的症状或减轻该疾病的影响，即防止典型的疾病症状。预防的意思是终止，阻止或延缓疾病发作的决定性行为。预防可包括下列概念妨碍、挫败、阻塞、拦截、很可能还有禁止、阻止或排除。排除表明不发生疾病状态的发作或在导致疾病状态中病原体大量失效。防止或预防可指疾病状态被拖延，意思是阻止或防止疾病的预期行为已发生但产生疾病的症状未消除。
该疫苗在对BVDV疾病各种表现形式的传播中提供有效保护的能力证实了本发明的有用性。由于疫苗使用gp53(一种主要的BVDV糖蛋白)，针对gp53宿主产生有效的免疫反应，因此对于所治疗的潜在的宿主，该疫苗将提供大量的益处。本发明的另一目的是提供一种BVDV疫苗，它能安全地给牛犊和在妊娠全部阶段的妊娠母牛用药。
活性的测量该疫苗使用gp53，它是BVDV的一种主要的糖蛋白，针对它宿主可产生有效的免疫反应。其他作者已揭示了gp53具有高度免疫原性(Donis，R.O.和Dubori，E，J.，Glycoproteins of BovineViral Diarrhoea-Mucosal Disease Virus in Infected Borine Cell，Jour-nal of General Virology，Vol.68，pp.1607-1616(1987))。产生有效免疫反应的试剂可制成有效的疫苗，这是人们所熟知的(Magar.R.，et al.，Borine Viral Diarthea Virus ProteinsHeterogeneity of Cy-topathogenil and Noncytopathogenil Strains and EVidence of 53K Gly-coprotein Neutrali2tion Epitope.Veterinary Microbiology，Vol.16，pp.303-314)。本发明的疫苗含表达大量gp53的基因，如图5所示。由于大量gp53的表达，本发明的疫苗可给所治疗的潜在的宿主提供大量益处。
优选的复合物任何以tk缺失减毒的并携带gp53基因，gp53基因前有信号肽的且表达是够量gp53的BHV-1病毒是优选合适的候选疫苗。似乎信号肽序列可取自任何合适的来源。我们选择检查了两种不同的信号肽以保证gp53蛋白质在体内的最佳定位。我们选择了两种候选信号肽，称之为“T11-6”(在实施例2中使用)和“T11-3”(在实施例3中使用)，以便进行疫苗试验。前一种病毒命名为VC VR-58保藏于ATCC。后一种“T11-3”质粒也进行了保藏。我们标记为“T11-8”的病毒可能含tk转录子的截短形式，这可能表明(但是未必一定是指)它作为候选疫苗具有较小的吸引力。在含有取自感染的牛犊的胎牛血清之培养基中传代时，大量现存的细胞系被非细胞致病性BVDV持续感染。对于本发明，用作活的减毒疫苗的病毒不合污染的BVDV是绝对必要的。
复合物的制备用于将基因插入牛泡疹病毒1型(BHV-1)中的表达穿梭载体的构建。
我们构建了2个穿梭载体来将外源基因插入BHV-1中。尽管本发明显示了BHV-1用作BVDV基因之载体的用途，但许多其它病毒也可充当相同的角色。其它来自牛、绵羊和山羊的例子可包括牛、山羊和绵羊痘病毒，腺病毒，牛乳头炎病毒，牛乳头状瘤病毒和假狂犬病病毒。不致病的病毒指任何具有在其一种宿主物种中复制之能力但在该物种中不产生任何疾病症状的病毒。这类不致病的病毒可能经自然突变以致病性亲本病毒产生，可经诸如化学品或光进行诱变以产生不致病的病毒，或可通过使用重组DNA技术导致不致病。见1)病毒中和区定位，E.wimmer，E.A.Emini，和D.C.Dia-mondand.2).疫苗产品的免疫原性和中和抗体，E Norrby。两篇文章都由Notkins和Oldstone编辑，由Springer-Verleg New YorkInc，于1986年出版。
由于我们试图通过灭活病毒胸苷激酶(tk)来减毒BHV-1(M.Kit，et al.，美国专利4,703,011(1983))，所以我们决定使用BHV-1tk基因作为插入位点。这一试验不仅保证了使病毒tk完全失活，还使我们能够以建立的方法来选择重组体，即tk-阴性病毒(M，F.Shih，et al.，Proe Natl Acad Sci VSA，81；5867-5870(1948))。其它减毒BHV-1的方法，如其它非必需基因的缺失也可用于本发明。我们以质粒pHAS4开始，它含2.7kb的BHV-1 Sal I亚片段，克隆进质粒pVC18的HindIII-A片段。E.PetrovKis，资料未出版。M.Engels，etal.，Virus Res，657-73(1986)；J.E.Mayfield，et al.，J.Virol，47259-264(1983)；A.L.Meyer，et al.，BiochimBiophys Acta，1090267-9(1991)。如图1所示，该SalI片段含完整的tk基因，以及与HSV-1 VL24基因同源的部分上游基因和部分糖蛋白H基因。L.J.Bello，et al.，Virology，189407-414(1992)；J.G.Jacobson，et al.，J.Virol，631839-1843(1989)；M.Kit，et al.，美国专利4,703,011，(1983)；A.L.Meyet，et al.，Biochim Biophys Acta，1090267-9(1991)。
经过用BglII和XhoI消化pHSA4将424bP的缺失导入tk基因中，用DNA聚合酶I的Klenow片段(Klenow)补齐末端并重新连接所得的钝端片段。这一操作恢复了BglII识别位点，但失去了XhoI位点(图1)。所得的质粒命名为pHAS4ΔBX。选择该缺失是因为它不妨碍以前鉴定的在tk基因5’端重叠的VL24同系物转录起始位点。L.J.Bello，et al.，Virology，189407-414(1992)；J.G.Jacobson，et al.，J.Virol.631839-1843(1989)。在BHV-1 tk基因内的许多其它缺失也是可能的。为了利于随后的克隆操作，我们经过用HindIII消化pHAS4ABX，用Klenow补齐粘性未端并重新连接钝端从而去掉了pVC18中的HindIII位点。
我们获得了含人细胞肥大病毒(cmv)主要立即早期启动子和牛生长激素多聚腺苷酸化序列的1775bp序列盒。R.J.Brideau，etal.，J.Gen Virol，74；471-477(1993)。在许多不同系统中这些基因表达信号通常用于外源基因的高水平表达，但其它启动子/多聚腺苷酸化信号对也可在此使用。在载体p3CL-DHFR中的该序列盒以单个EcoRI和BglII位点为边界，并在启动子和多聚腺苷酸化信号之间含单个HindIII和SalI限制性位点以便克隆外源基因。用EcoRI消化p3CL-DHFR载体，然后补齐并连接到BamHI接头(New England Biolabs，Bererly，Massachusetts)上。这一操作重新产生EcoRI位点。然后用BamHI和BglII消化构建体并将释放的序列盒连接到pHAS4ΔBX的BglII位点上(图1)。将连接物转化进大肠杆菌DH5α菌株。经过非对称的限制性位点定位，我们分离了含有相对于BHV-1tK基因以两种取向存在的p3CL插入片段之重组质粒。于是这两种称为pHAS4ΔBXex-1和pHAS4ΔBXex-3(图1)的构建体在BHV-1 tK基因和侧翼区的边界上含有强启动子和多聚腺苷酸化信号以便能同源重组进BHV-1基因组。
图1，用于将外源基因插入BHV-1的穿梭载体的构建。PHAS4是来自BHV-1 HindIII-A片段的2.7kb的亚片段。显示了所要缺失的BglII/xhoI亚片段。pHAS4的缺失衍生物是pHAS4ΔBX。缺失的胸苷激酶(tK)基因以黑色带点方框表示。含启动子和多聚腺苷化信号的序列盒在pHAS4ΔBX的正下方显示。CMV立即早期启动子以白色带点方框表示，牛生长激素(BGH)多聚腺苷酸化信号以带条纹的方框表示。最后显示了两个表达穿梭质粒pHAS4ΔBXex1和pHAS4ΔBXex3的插入片段。
将信号肽序列加到BVDV gp53基因上以前已描述了含有来自病毒株2724(一种非细胞致病性病毒株)之BVDV gp53基因的cDNA(Kennedy，M.et al，abstracts of theAmerican College of Veterinary Microbiologists，1992 workshop)。由于BVDV RNA基因组一般翻译成一条长的多蛋白，然后经翻译后修饰成各种病毒蛋白质，故BVDV基因组的gp53部分不含将蛋白质转位到细胞膜上所需的常用信号肽，其中该蛋白质在膜上正常表达。尽管如此，cDNA在无细胞系统和杆状病毒中都能成功地表达，虽然缺乏常规信号肽，该蛋白质似乎在两种系统中都能转位，糖基化和锚着。然而，我们决定使用和不使用各种信号肽来评价gp53在BHV-1中的表达。
为了将编码信号肽的核苷酸序列加到gP53基因上，我们经定点诱变将BamHI位点导入p53基因的5′端，操作如下将p53基因以钝端连接到质粒pSP72(Promega Corp.，Madison，Wisconsin)补齐的BamHI位点上，于是从所得的质粒上去掉全部BamHI位点。使用合成的寡核苷酸和“Double Take”定点诱变试剂盒(Stratagene，La Jolla CA)根据厂家说明书从cDNA所用的起始密码子11碱基处导入单个碱基的改变，即从C变为G。该碱基的改变将单个BamHI位点导入基因中而不改变gp53氨基酸序列(图2 B部分)。经过核苷酸测序证实了碱基的改变，所得的质粒称为pP53mut。我们将编码来自PRV gIII基因(A.K.Robbins，et al.，J.Virol，58339-347(1986))和来自牛生长激素(R.P.Woychik，et al.，Nucl.Acids Res，107197-7210(1982))的信号肽的核苷酸插入pP53mut序列中(图2 A部分)。合成编码两信号肽的互补寡核苷酸以便退火的寡核苷酸具有SalI5′粘性末端和BamHI3′粘性末端(图2 A部分)。将这些信号肽序列盒连接到用BamHI和SalI消化的pP53mut上并转化进DH5α。经过核苷酸测序证实信号肽序列盒的正确插入。
本发明可使用编码任意充分鉴定的信号肽的互补寡核苷酸。充分鉴定的信号肽序列的39个例子见Perlman，D，et al.，J.Mol.Biol.Vol.167 pp.391-409(1983)(引用以供参考)。这些和任意其它充分鉴定的信号肽可适用于实施本发明。
图2.在BVDV gp53基因上加上信号肽序列的方法。A部分合成的与牛生长激素(BGH)和假狂犬病病毒gIII(PRV gIII)的信号肽序列相对应的寡核苷酸。合成互补的寡核苷酸以便退火对具有5′端的SalI位点和3′端的BamHI位点。还显示了推断的信号肽氨基酸序列。在每种情况下，信号肽预期的切割位点正好位于丙氨酸(A)(末端的3个氨基酸)之后。原始天然蛋白质的2个氨基酸残基(BGH中是F.P；gIII中是P.S)的密码子位于信号肽序列的左侧以保证正确切割。
B部分编码BVDV gp53基因的cDNA之定点诱变。显示了gp53 cDNA的前60个核苷酸和相应的氨基酸序列。改变箭头所示的单个碱基对以便在序列中产生BamHI限制性位点，在方框中显示。这一变化不改变氨基酸序列。然后如图所示用BamHI消化cDNA，使其在阅读框中与A部分所示的信号肽序列之一连接。
除了gp53之外的其它表达基因片段。
其它BVDV基因或基因组合在活病毒载体中的表达也是本发明的实施方案。这包括接种动物转对其诱导免疫反应的任何和全部BVDV蛋白质。该例子包括(但不限于)其它两种BVDV表面糖蛋白，gp48和gp45(Collett，M.S.，et al.，Virology 165200-208(1988))，p14衣壳蛋白质(Thiel，H.，J，et al.，J.Virol.654705-4712(1991))和p20 N-末端蛋白酶(Wiskerchen，M.，et al.，J.Vi-rol.654508-4514(1991))。这一组蛋白质可与gp53基因一起从单一cDNA分子上表达，表达的多蛋白可正确地自我加工成分开的蛋白质。在疫苗中表达的另一BVDV侯选蛋白质是非结构p125/p80蛋白质(Deregt，D.，et al.，Can.J.Microbiol.37815-122(1991))，它在感染的母牛中诱导明显的抗体反应。
将BVDV gp53基因插入BHV-1表达载体中。
经过补齐载体和插入片段各自的粘性末端接着将钝端连接来将加有或未加信号肽序列的p53基因连接到pHAS4ΔBXex-1和pHAS4ΔBXex-3的HindIII插入位点上。将连接物转化进大肠杆菌DH5α菌株。我们想最终评价gp53在BHV-1中以各种取向和具有至少2个不同信号肽的表达情况以保证获得最有效的表达。使用以洋地黄毒苷-dVTP标记的p53插入片段作探针经菌落杂交筛选转化的菌落。“本质”DNA杂交系统(Boeringer Mannheim Bio-chemicals(BMB)，Indianapolis，IN)可用于该杂交和在本发明的鉴定中描述的全部其它DNA杂交。然后经过限制性分析那些相对于CMV启动子和BgH多聚腺苷酸化信号以合适取向携带gp53基因的重组体来筛选阳性重组体。分离出5个质粒，将它们以图解的形式在图3A-E中描述。其描述如下实施例1pBHVtKex-3∷p53含有在pHAS4ΔBXex-3 CMV启动子和BGH多聚腺苷酸化信号之间插入的BVDV gp53基因，不加信号肽。在该构建体中，原始gp53基因在定点诱变前插入，见图3A。然后该质粒用于构建病毒T2-3#。
实施例2pBHVtKex-1∷BGH/P53含在BGH信号肽序列之后插入pHAS4ΔBXex-1的突变的gP53基因，见图3B。该质粒用于构建病毒T11-6。该病毒已保藏。
实施例3pBHVtKex-1∷gIII/p53含有在PRV gIII信号肽序列之后插入pHAS4ΔBXex-1的诱变的gp53基因。见图3C。该质粒用于构建病毒T11-3。该质粒已保藏。
实施例4pBHVtKex-3∷BGH/P53含有在BGH信号肽序列之后插入pHAS4ΔBXex-3的诱变的gp53基因。见图3D。
实施例5pBHVtKex-3∷gIII/p53含有在PRV gIII信号肽序列之后插入pHAS4ΔBXex-3的诱变的gp53基因。见图3E。该质粒用于产生病毒T11-8。该质粒已保藏。
图3A-E用于将gp53插入BHV-1的五个穿梭质粒的完全图谱。gp53基因以实心带表示，BHV-1序列以黑色带点带表示，CMV启动子区域以白色带点带表示，BGH多聚腺苷酸化信号区以条纹带表示。质粒载体pVC18以单条线表示。显示了每种情况下相对于BHV-1 tK原始转录方向的gp53的转录方向。显示了各种信号肽序列。
a.实施例1.pBHVtKex-3∷p53。
b.实施例2.pBHVtKex-1∷BGH/p53c.实施例3.pBHVtKex-1∷gIII/p53d.实施例4.pBHVtKex-3∷BGH/p53e.实施例5.pBHVtKex-3∷gIII/p53这些和所有其它可能的将BVDV gp53基因插入BHV-1tK基因的方式都是本发明的实施方案。这些质粒和以这种方式产生的任何质粒称为“主要质粒载体”，它们是用于产生本发明的病毒疫苗的质粒载体。
将gp53基因导入BHV-1“Iowa”使用XbaI将携带gp53的5种表达穿梭质粒线型化并按Cai修改的(w.cai，et al.，J Virol，61714-721(1987))标准CaPO4方法(R.I.Graham，et al.，Virology，52456-467(1973))将它们共转染进具有来自BHV—1病毒株Iowa(tK阳性)单位长度DNA的牛鼻甲(BT)细胞中。该细胞从ATCC获得。然后在100Mg/ml5-溴-2′-脱氧尿苷(BDVR，Sigma Chemical Company，St.Louis，Missouri)存在的条件下对143tK-细胞(S.K.Mittal，et al.，J.Gen Virol，70(1989))或对Rab(RV)细胞(S.Kit，et al.，Virology，130381-389(1983))进行两轮选择染子以分离不再表达tK的病毒。这是以前描述的标准程序(M.Kit，et al.，美国专利4,703,011(1983))。也可使用允许BHV—1生长的其它tK-细胞系。经过两轮BDVR传代后，在含1％低熔点琼脂糖的完全培养基中将仍表现为细胞致病效应的转染子感染到BT细胞上以获得单个噬菌斑，从每个转染子中挑出许多的单个噬菌斑并经点印迹DNA杂交筛选病毒DNA中的p53基因。尽管不是全部转染子在BDVR传代中存活(特别是那些在143tK-细胞上进行的传代，因为这些细胞仅在边缘上允许BHV-1病毒生长)，但那些存活的转染子产生100％的重组病毒。分离了4种不同的重组病毒并作了进一步的鉴定实施例1.T2-3#3和T2-2#5(两种相同但独立分离出的病毒克隆)在pBHVtKex-3∷p53中包含的插入序列重组进BHV-1“Iowa”。含有未加信号肽序列、位于CMV启动子和BGH多聚腺苷酸化信号之间，转录方向与BHV-1tK基因方向相同的BVDVgp53基因。
实施例2，T11-6(该病毒以UC VR-58命名提交给ATCC)pBHVtKex-1∷BGH/p53包含的插入序列重组进BHV-1“Iowa”。含有具有位于CMV启动子和BGH多聚腺苷酸化信号之间的BGH信号肽序列且相对于BHV-1 tK基因转录方向相反的BVDV gp53基因。
实施例3，T11-3在pBHVtKex-1∷gIII/p53中包含的插入序列重组进BHV-1“Iowa”。含有具有位于CMV启动子和BGH多聚腺苷酸化信号之间的PRV gIII信号肽序列且相对于BHV-1tK基因转录方向相反的BVDV gp53基因。
实施例5，T11-8pBHVtkex-3∷gIII/p53中包含的插入序列重组进BHV-1“Iowa”。含有具有位于CMV启动子和BGH多聚腺苷酸化信号之间的PRV gIII信号肽序列且转录方向与BHV-1tK基因相同的BVDV gp53基因。
用“Iowa”DNA和质粒pBHVtKex3∷BGH/p53共转染时(实施例4)未分离出病毒，但这种预期的病毒易于构建，该病毒和含有插入到胸苷激酶基因中之BVDV gp53基因的任何其它BHV-1病毒都是本发明的实施例。从这些病毒中分别纯化了其DNA，使用gp53基因和CMV启动子/BgH多聚腺苷酸化序列盒作控针经Southern杂交检查以合适的取向存在的合适的插入序列(资料未显示)。这四种病毒全部携带位于BHV-1tK基因中的完全启动子/基因/多聚腺苷酸化序列盒，其中tK基因根据限制性片段大小预测为已缺失。作为与这些转染的对照，也用BHV-1“Iowa”单位长度DNA转染了pHAS4ΔBX质粒并分离出携带tK中424bp缺失的tK阴性后代(也用southern杂文证实)。该病毒命名为IowaΔBX。这些病毒全部是在BT细胞上经有限稀释纯化两次的噬菌斑。
在含有取自感染的牛犊的胎牛血清之培养基中传代时，大量的现存细胞系被非细胞致病性BVDV持续感染。对于本发明，用作活的减毒疫苗的病毒不合污染的BVDV病毒是绝对必要的。为了确保携带BVDV序列的BHV-1病毒不被非细胞致病性BVD病毒污染，我们从每种病毒中制备了DNA(包括亲本病毒株Iowa和IowaΔBX)并使用克隆的RNAse(RNAse ONE，Promega Corporation，Madison，Wisconsin)对该DNA制品进行彻底的RNAse处理。由于BVDV仅具有RNA作为其遗传材料，该操作应从病毒DNA制品中除去任何可能污染的BVDV序列。然后将这些RNAse处理的病毒DNA转染进证实为无BVD的MDBK细胞(ATCC)中并从转染子中挑选病毒噬菌斑以用于进一步的操作。
gp53重组体的转录分析。
从每个重组病毒和亲本BHV-1病毒株Iowa中制备RNA并经Northern杂交评价gp53的转录。可能的信使RNA种类和所用的探针如图4所示。
图4BHV-1/gp53重组病毒预期的转录子如后面图5所示。两种探针是1)gp53 cDNA和2)pHAS4的SalI/BglII部分(如上面图谱所示)。第一个图谱显示了病毒T11-3和T11-6预期的转录子，第二个图谱显示了T11-8预期的转录子。显示了tK和UL24的转录起始位点以供参考。
全部gp53重组病毒产生一条1.6kb的信使RNA.它与32p标记的gp53探针杂交，预计的大小便于在CMV启动子上起始转录和在BgH多聚腺苷酸化位点上终止，如图5探针1。T2-3#3和T2-2#5病毒未显示。作为另外的主要带，T11-3和T11-6产生8.5kb的转录子，T11-8和T2-3#3产生5.6kb的转录子。对重组病毒而言这些转录子是单一的，并且分别与在CMV启动子处起始，通过BgH多聚腺苷酸化信号阅读并在UL24或tK/gH多聚腺苷酸化信号处终止的信使RNA一致。
与上游和下游探针的杂交证实了这些较长的信使RNA的相同性。p53探针不与Iowa，IaΔBX或感染RNA的模拟物杂交。作为定量对照，我们使用探针pHAS6，它是位于tK开放阅读框架下游并在gH基因内部的一条867bp的SalI片段(A.L.Meyer，et al.，Biochim Biophys Acta，1090261-9(1991))。所有这些病毒产生相当量的3.1kb的gH信使RNA(资料未显示)。该探针还与T11-8和T2-3-3中较长的p53信使RNA和Iowa中4.3Kb tK的信使RNA(与gH转录子是有共同的3′末端，L.J.Bello，et al.，Virology，189407-414(1992))杂交。
为了检查gp53插入序列上游的转录模式，使用由pHAS4，片段组成的探针，该片段从上游SalI位点到tK基因的BglII位点(重组病毒中的缺失起点)(即探针2)。全部病毒都产生一条大约4.4Kb的信使RNA，推断为UL24(图5，探针2)。然而，该信使RNA比Bello等(L.J.Bello，et al.，Virology，189407-414(1992))描述的BHV-1病毒株Cooper中的5.2Kb UL24信使RNA要小并与野生型病毒型株Iowa中的tK信使RNA共同迁移。尽管没有经过使用单链探针进一步评价这些共同迁移的信使RNA，但用探针pHAS6仅在Iowa DNA中检测到了4.2Kb的tK转录子并用上游探针在所有病毒RNA中检测到了相同大小的转录子，即使其它病毒不可能产生野生型大小的tK转录子。在T11-3和T11-6中，上游探针未检测到任何tK信使RNA的截短形式且仅与UL24信使RNA和8.5Kb p53信使RNA杂交。另一方面，在T11-8中，该探针与大约5.0，3.7，1.8和1.0Kb的四种增加的(次要的)带杂交。
图5，Northern印迹显示了BHV-1重组病毒中gp53信使RNA的转录子。第一组显示了与探针1(pg53 cDNA)杂交的转录子，第二组显示了与探针2(pHAS4的SalI/BglI亚片段)杂交的转录子。代号M＝模拟病毒感染的细胞，I＝BHV-1“Iowa”感染的细胞，3.6，8＝T11-3，T11-6和T11-8感染的细胞。RNA大小标准品以千碱基(KB)在每组左侧给出。
BVDV gp53蛋白质在BHV-1中的表达。
以免疫沉淀法(IP)评价了gp53蛋白质在BHV-1重组体中的表达。IP的详细方法可见标准参考文献(如Current Protocols inMolecular Biology”，Ausubel，F.M.，et.al.，eds.，Wiley Interscience，New York)。用BHV-1重组体感染的BT细胞经新陈代谢用35S-甲硫氨酸(Amersham，Arlington Heights，Illinois)标记。溶解病毒感染的细胞并将可溶蛋白质与来自牛或山羊的抗BVDV超免疫血清(VMRD，Pullman，Washington)反应。用葡萄球菌A(免疫沉淀素，Gibco/BRL，Gaithersburg，Maryland)或蛋白A琼脂糖4B(Pharmaci-a，Uppsala，Sweden)沉淀抗原/抗体复合物。经SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和荧光摄影术分辨免疫反应性蛋白质。
图6显示了在信号肽序列后携带gp53基因的所有3种重组病毒都产生显著量的蛋白质。从携带gp53基因但不合信号肽的T2-3#3或T2-2#5病毒中未检测到gp53的任何表达，即使该病毒合成相当大量的gp53信使RNA。克隆T2-3#3和T2-2-2#5是单独分离的克隆，这排除了某一特定的病毒具有排斥gp53表达之缺陷的可能性(资料未显示)。剩下的可能性是从T2-3中合成gp53，但迅速被降解，或者是我们所用的抗体不能检测该蛋白质的未加工形式。
图6显示gp53在BHV-1重组体中表达的免疫沉淀蛋白质。用多克隆中抗BVDV血清沉淀标记的蛋白质，该血清与BHV-1抗原也具有微弱的反应性。代号3.6，8＝T11-3，T11-6和T11-8感染的细胞蛋白质，IA＝BHV-1“Iowa”感染的细胞蛋白质，M＝模拟病毒感染的细胞蛋白质。MW＝近似蛋白质分子量标准品，单位为干道尔顿。
T11-3，T11-6和T11-8的gp53蛋白质带宽大，表明该蛋白质已加工，它们似乎与NADL gp53蛋白质相当但大小不相同(资料未显示)。经用N-葡聚糖酶(Genzyme，Cambridge，Massachusetts)消化从BVDV-NADL和BHV-1表达的gp53蛋白质中去掉N-连接的糖不能分辨该蛋白质的大小差异，但该蛋白质大小的成比例减少表明gp53天然和重组形式以相同的方式进行加工。重组和天然蛋白质之间的轻微大小差异可能是由于BHV-1病毒的gp53基因来自具有轻微大小差异的gp53的不同的BVD病毒株，或cDNAgp53克隆可能不含从BVDV多蛋白加工成天然gp53的精确的氨基酸。
本发明并不局限于保藏的细胞系或本文公开的实施方案所限定的范围，它们仅仅是对本发明一个方面的解释，任何功能上相当的细胞系或实施方案都在本发明的范围内。事实上，除了本文显示和描述的以外，根据上文描述对本发明的各种修改对本领域的技术人员而言是显而易见的。这种修改将落在所附权利要求的范围内。
还应明白的是给出的核苷酸和肽的所有碱基对和氨基酸残基数是近似值并用于描述之目的。
本文引用的全部文献列入以供参考。
遗传材料的保藏经过仅仅使用所给出的描述本领域的技术人员将能重新构建本发明的所有各种实施方案。然而为了完整起见，以确保可实施性并为制造和使用本发明的其它人提供各种机会，根据布达佩斯条约将本发明的某些遗传构建体保藏在认可的保藏单位。
一种病毒保藏在美国典型培养物保藏中心(12301 ParklownDrive，Rockville，Maryland，邮编20852，美国)。该保藏品由Vpjohn公司命名为UC VR-58并由保藏单位给出下面保藏号ATCC No.VR 2436，它与本文以“T11-6”(也称为“实施例2”)描述的病毒相对应。该保藏品于1993年10月28日被美国典型培养物保藏中心的保藏单位收到。
一些质粒保藏在农业研究服务社培养物保藏中心(NRRL)(美国农业部，1815 North University Street，Peoria，Illinois，邮编61604，美国)。一个质粒的Upjohn命名为pUC1564，它是大肠杆菌培养物UC15085，称为pBHVtKex-1∷gIII/p53，它与用于构建本文以“T11-3”(也称为“实施例3”)描述的病毒之质粒相对应。该质粒由保藏单位给出下面保藏号，NRRL B-21350。另一保藏品的Upjohn命名为pUC1565，它是大肠杆菌培养物UC15086，称为pBHVtKex-3∷gIII/p53，它与用于构建本文称为“T-11-8”(也称“实施例5”)的病毒的质粒相对应。该质粒由保藏单位给出下面的保藏号，NR-RL B-21351。农业研究服务社培养物保藏中心的保藏单位于1994年10月26日收到这两个质粒。
序列描述(1)一般资料(i)申请人The Upjohn Company发明人(仅适用于美国)Wardley，Richard c.and Haanes，Elizabeth J.
(ii)发明题目表达牛病毒性腹泻病毒(BVDV)被膜糖蛋白的复制型不致病毒病毒(iii)序列数2(iv)联系地址(A)联系人Thomas A Wootton(1920-32-1)，The UpjohnCompany(B)街道7000 Portage Road(C)城市Kalamazoo(D)州Michigan(E)国家美国(F)邮编49001—0199(V)计算机可读形式(A)媒体形式Floppy disk(B)计算机IBM PC兼容性(C)操作系统PC—DOS/MS—DOS(D)软件PatentIn Release#1.0，Version#1.25(vi)最近申请资料(A)申请号(B)申请日
(C)分类(viii)律师/代理人资料(A)姓名Wootton，Thomas A.
(B)登记号35004(C)参考/目录号4748(ix)电信资料(A)电话616 385—7914(B)传真616 385—6897(C)电传224 401 VPJOHN(2)SEQ ID NO1资料(i)序列特征(A)长度8083碱基对(B)类型核酸(C)链型双链(D)拓扑线型(ii)分子类型DNA(基因组)(iii)假定的非(iv)反义非(vi)原始来源(A)生物体牛病毒性腹泻病毒(B)病毒株2724(C)单个分离物pBHVtkex—3∷p53(xi)序列描述SEQ ID NO1GCGCCCAATA CGCAAACCGC CTCTCCCCGC GCGTTGGCCG ATTCATTAAT GCAGCTGGCA 60CGACAGGTTT CCCGACTGGA AAGCGGGCAG TGAGCGCAAC GCAATTAATG TGAGTTAGCT 120CACTCATTAG GCACCCCAGG CTTTACACTT TATGCTTCCG GCTCGTATGT TGTGTGGAAT 180TGTGAGCGGA TAACAATTTC ACACAGGAAA CAGCTATGAC CATGATTACG CCAAGCTAGC 240TTGCATGCCT GCAGGTCGAC TTCCGCGCCC GCGGCGTCTG CCTTCGCCAG CAGGTTGTCC 300GCGGCCGCTG CCGGCCTGGT TCCGCGCCCG CCGCCTCGCG GCCAGCTCCC GCGCGGGCGC 360GTCCGCGTCC CCAACTCCGC GCGAAGACGG GCTCGTCCCA GAAGCGCAGC GGAAAGGCCG 420GCGTATAAAA TTTCGCTCGT CCGGTACAAA GACGCGGTCC GCGACTGCGT GGATGTCCAC 480GCCCAGGCAA GCAAACTCTA AACGCCCGAG CGCCATGGCC CCGATGCCGC CACAAAGAGC 540GCCGAAATTT CGCCCAGGCA CGCCGCGCCG CCCGACGCGT CTTTAGCGCA CCCGCCGGCG 600CTGTTGCCCG CGTGCCTGCT GGCCGCCCAC CGGCGGCCGC TGTCCCCGGC CTCAGCAGGG 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(iv)反义非(vi)原始来源(A)生物体牛病毒性腹泻病毒(B)病毒株2724(C)单个分离物pBHVtkex—3∷BGH/p53(xi)序列描述SEQ ID NO4GCGCCCAATA CGCAAACCGC CTCTCCCCGC GCGTTGGCCG ATTCATTAAT GCAGCTGGCA 60CGACAGGTTT CCCGACTGGA AAGCGGGCAG TGAGCGCAAC GCAATTAATG TGAGTTAGCT120CACTCATTAG GCACCCCAGG CTTTACACTT TATGCTTCCG GCTCGTATGT TGTGTGGAAT180TGTGAGCGGA TAACAATTTC ACACAGGAAA CAGCTATGAC CATGATTACG CCAAGCTAGC240TTGCATGCCT GCAGGTCGAC TTCCGCGCCC GCGGCGTCTG CCTTCGCCAG CAGGTTGTCC300GCGGCCGCTG CCGGCCTGGT TCCGCGCCCG CCGCCTCGCG GCCAGCTCCC GCGCGGGCGC360GTCCGCGTCC CCAACTCCGC GCGAAGACGG GCTCGTCCCA GAAGCGCAGC GGAAAGGCCG420GCGTATAAAA TTTCGCTCGT CCGGTACAAA GACGCGGTCC GCGACTGCGT GGATGTCCAC480GCCCAGGCAA GCAAACTCTA AACGCCCGAG CGCCATGGCC CCGATGCCGC CACAAAGAGC540GCCGAAATTT CGCCCAGGCA CGCCGCGCCG CCCGACGCGT CTTTAGCGCA CCCGCCGGCG600CTGTTGCCCG CGTGCCTGCT GGCCGCCCAC CGGCGGCCGC TGTCCCCGGC CTCAGCAGGG660CCGGGGTCGC CGGCGGGCGG CCGCGGGGTG CGGCCACAGC CGCCCTTTTG CCCGTAGCCA720GGGGAAGCGG CTGCCCCTTC TGCCGCCGCG GCCGCGGTTG CTCGGCTTTG CGTTTGCCCC780GCGGCGATCG CCCCGCTCGC CGCGAACGCG 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7620CCAGTGGCGA TAAGTCGTGT CTTACCGGGT TGGACTCAAG ACGATAGTTA CCGGATAAGG 7680CGCAGCGGTC GGGCTGAACG GGGGGTTCGT GCACACAGCC CAGCTTGGAG CGAACGACCT 7740ACACCGAACT GAGATACCTA CAGCGTGAGC TATGAGAAAG CGCCACGCTT CCCGAAGGGA 7800GAAAGGCGGA CAGGTATCCG GTAAGCGGCA GGGTCGGAAC AGGAGAGCGC ACGAGGGAGC 7860TTCCAGGGGG AAACGCCTGG TATCTTTATA GTCCTGTCGG GTTTCGCCAC CTCTGACTTG 7920AGCGTCGATT TTTGTGATGC TCGTCAGGGG GGCGGAGCCT ATGGAAAAAC GCCAGCAACG 7980CGGCCTTTTT ACGGTTCCTG GCCTTTTGCT GGCCTTTTGC TCACATGTTC TTTCCTGCGT 8040TATCCCCTGA TTCTGTGGAT AACCGTATTA CCGCCTTTGA GTGAGCTGAT ACCGCTCGCC 8100GCAGCCGAAC GACCGAGCGC AGCGAGTCAG TGAGCGAGGA AGCGGAAGA 8149(2)SEQ ID NO5资料(i)序列特征(A)长度8135个碱基对(B)类型核酸(C)链型双链(D)拓扑线型(ii)分子类型DNA(基因组)(iii)假定的非(iv)反义非(vi)原始来源
(A)生物体牛病毒性腹泻病毒(B)病毒株2724(C)单个分离物pBHVtkex—3∷gIII/p53(xi)序列描述SEQ ID NO5GCGCCCAATA CGCAAACCGC CTCTCCCCGC GCGTTGGCCG ATTCATTAAT GCAGCTGGCA 60CGACAGGTTT CCCGACTGGA AAGCGGGCAG TGAGCGCAAC GCAATTAATG TGAGTTAGCT120CACTCATTAG GCACCCCAGG CTTTACACTT TATGCTTCCG GCTCGTATGT TGTGTGGAAT180TGTGAGCGGA TAACAATTTC ACACAGGAAA CAGCTATGAC CATGATTACG CCAAGCTAGC240TTGCATGCCT GCAGGTCGAC TTCCGCGCCC GCGGCGTCTG CCTTCGCCAG CAGGTTGTCC300GCGGCCGCTG CCGGCCTGGT TCCGCGCCCG CCGCCTCGCG GCCAGCTCCC GCGCGGGCGC360GTCCGCGTCC CCAACTCCGC GCGAAGACGG GCTCGTCCCA GAAGCGCAGC GGAAAGGCCG420GCGTATAAAA TTTCGCTCGT CCGGTACAAA GACGCGGTCC GCGACTGCGT GGATGTCCAC480GCCCAGGCAA GCAAACTCTA AACGCCCGAG CGCCATGGCC CCGATGCCGC CACAAAGAGC540GCCGAAATTT CGCCCAGGCA CGCCGCGCCG CCCGACGCGT CTTTAGCGCA CCCGCCGGCG600CTGTTGCCCG CGTGCCTGCT GGCCGCCCAC CGGCGGCCGC TGTCCCCGGC CTCAGCAGGG660CCGGGGTCGC CGGCGGGCGG CCGCGGGGTG CGGCCACAGC CGCCCTTTTG CCCGTAGCCA720GGGGAAGCGG CTGCCCCTTC TGCCGCCGCG GCCGCGGTTG CTCGGCTTTG CGTTTGCCCC780GCGGCGATCG CCCCGCTCGC CGCGAACGCG CGCGCGCGAA 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1680GCGGCCCCGT ACTTAATTTT GCACGCGCGT GTCCGCGCTG CTGCGCCGCC TGGGCCGGCG 1740CCGGGCGGCG AGCTGGTGGA CCCTCGTGTT CGACCGCCAC CCCGTGGCGC GCGTGCCTCT 1800GCTACCCCTT CGCCCGCTAC TGCCTCCGCG AGATCAACGC GGAAGATCCG AATTCCTCGA 1860CCTGCAGTGA ATAATAAAAT GTGTGTTTGT CCGAAATACG CGTTTGAGAT TTCTGTCCCG 1920ACTAAATTCA TGTCGCGCGA TAGTGGTGTT TATCGCCGAT AGAGATGGCG ATATTGGAAA 1980AATCGATATT TGAAAATATG GCATATTGAA AATGTCGCCG ATGTGAGTTT CTGTGTAACT 2040GATATCGCCA TTTTTCCAAA AGTTGATTTT TGGGCATACG CGATATCTGG CGATACGCTT 2100ATATCGTTTA CGGGGGATGG CGATAGACGC CTTTGGTGAC TTGGGCGATT CTGTGTGTCG 2160CAAATATCGC AGTTTCGATA TAGGTGACAG ACGATATGAG GCTATATCGC CGATAGAGGC 2220GACATCAAGC TGGCACATGG CCAATGCATA TCGATCTATA CATTGAATCA ATATTGGCCA 2280TTAGCCATAT TATTCATTGG TTATATAGCA TAAATCAATA TTGGCTATTG GCCATTGCAT 2340ACGTTGTATC CATATCATAA TATGTACATT TATATTGGCT CATGTCCAAC ATTACCGCCA 2400TGTTGACATT GATTATTGAC TAGTTATTAA TAGTAATCAA TTACGGGGTC ATTAGTTCAT 2460AGCCCATATA TGGAGTTCCG CGTTACATAA CTTACGGTAA ATGGCCCGCC TGGCTGACCG 2520CCCAACGACC CCCGCCCATT GACGTCAATA ATGACGTATG TTCCCATAGT AACGCCAATA 2580GGGACTTTCC ATTGACGTCA ATGGGTGGAG TATTTACGGT AAACTGCCCA CTTGGCAGTA 2640CATCAAGTGT ATCATATGCC AAGTACGCCC CCTATTGACG TCAATGACGG TAAATGGCCC 2700GCCTGGCATT ATGCCCAGTA CATGACCTTA TGGGACTTTC CTACTTGGCA GTACATCTAC 2760GTATTAGTCA TCGCTATTAC CATGGTGATG CGGTTTTGGC AGTACATCAA TGGGCGTGGA 2820TAGCGGTTTG ACTCACGGGG ATTTCCAAGT CTCCACCCCA TTGACGTCAA TGGGAGTTTG 2880TTTTGGCACC AAAATCAACG GGACTTTCCA AAATGTCGTA ACAACTCCGC CCCATTGACG 2940CAAATGGGCG GTAGGCGTGT ACGGTGGGAG GTCTATATAA GCAGAGCTCG TTTAGTGAAC 3000CGTCAGATCG CCTGGAGACG CCATCCACGC TGTTTTGACC TCCATAGAAG ACACCGGGAC 3060CGATCCAGCC TCCGCGGCAA GCTTCGACCA TGGCCTCGCT CGCGCGTGCG ATGCTCGCTC 3120TGCTGGCGCT CTACGCGGCG GCCATCGCCG CGGCGCCGTC GGGGATCCTA TGGCTACTAC 3180TGATAACAGG GGTACAAGGG GACATTGACT GCAAACCTGA ACACTCATAC GCCATAGCCA 3240GGAATGATAG AATTGGCCCA TTAGGAGCTG AAGGCCTCAC CACTGTTTGG AAGGATTACT 3300CACATGAAAT GAAGCTGGAA GACACAATGG TCATAGCTTG GTGCAAAGAC GGTAAGTTTA 3360CATACCTCTC AAGGTGCACA 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TATTGGTGGT GGTGGTAGCT TTACTGGGTG 4260GAAGATACGT GCTCTGGTTA CTGGTAACAT ACATGGTCCT ATCAGAACAA AAGGCCTTGG 4320GGACCCAATA TGGGGCAGGG GAAGTGGTGA TGATGGGTAA CTTGCTAACA CATGACAGTA 4380TTGAAGTGGT GACATATTTC TTGTTGTTAT ACCTACTGCT AAGAGAGGAG GCTGTAAAGA 4440AGTGGGTCTT ACTCTTATAC CACCTTGATT GATTGAGGAT CAGCTTATCC AGGGTCGACC 4500TCAGGCATGC AAGCTCAGAT CCGCTGTGCC TTCTAGTTGC CAGCCATCTG TTGTTTGCCC 4560CTCCCCCGTG CCTTCCTTGA CCCTGGAAGG TGCCACTCCC ACTGTCCTTT CCTAATAAAA 4620TGAGGAAATT GCATCGCATT GTCTGAGTAG GTGTCATTCT ATTCTGGGGG GTGGGGTGGG 4680GCAGGACAGC AAGGGGGAGG ATTGGGAAGA CAATAGCAGG CATGCTGGGG ATGCGGTGGG 4740CTCTATGGGT ACCCAGGTGC TGAAGAATTG ACCCGGTTCC TCCTGGGCCA GAAAGAAGCA 4800GGCACATCCC CTTCTCTGTG ACACACCCTG TCCACGCCCC TGGTTCTTAG TTCCAGCCCC 4860ACTCATAGGA CACTCATAGC TCAGGAGGGC TCCGCTTCAA TCCCACCCGC TAAAGTACTT 4920GGAGCGGTCT CTCCCTCCCT CATCAGCCCA CCAAACCAAA CCTAGCCTCC AAGAGTGGGA 4980AGAAATTAAA GCAAGATAGG CTATTAAGTG CAGAGGGAGA GAAAATGCCT CCAACATGTG 5040AGGAAGTAAT GATAGAAATC ATAGAATTGA GATCTCGAGG TGTTCGTGCT GGACGTGTCC 5100GCGGCGCCAG ACGCGTGCGC GGCCGCCGTA CTGGACATGC GGCCCGCCAT GCAGGCCGCT 5160TGCGCGGACG GGGCGGCGGG CGCGACGCTG GCGACCCTGG CGCGTCAGTT CGCGCTAGAG 5220ATGGCGGGGG AGGCCACGGC GGGCCCTAGG GGACTATAAA GCTGCCCCTG CGCTCGCTCG 5280CTCGCTGCAT TTGCGCCCCG ATCGCCTTAC GGGGACTCGG CGCTCGGCGG ATCCCCTCCC 5340GGCCCCGCCG CGAAGCAGGC CGCCAGACAA AAAAATGCGG CGCCCGCTCT GCGCGGCGCT 5400ATTGGCAGCG GCTGTCCTCG CGCTCGCCGC GGGCGCCCCC GCCGCCGCCC GCGGCGGGGG 5460CGCCGAAGCC AGGGCAGCAC AGAGACGCCC GATACGAAAT CGAAGAGTGG GAAATGGTGG 5520TCGGAGCCGG GCCGGCCGTG CACACGTTCA CCATCCGCTG CCTCGGGCCG CGGGGCATTG 5580AGCGCGTGGC CCACATTGCA AACCTCAGCC GGCTGCTGGA CGGGTACATA GCGGTCCACG 5640TTGACGTTGC GCGCACCTCT GGCCTGCGGG ACGCCATGTT TTTCCTGCCG CGCGCGGCCG 5700TCGACTCTAG AGGATCCCCG GGTACCGAGC TCGAATTCAC TGGCCGTCGT TTTACAACGT 5760CGTGACTGGG AAAACCCTGG CGTTACCCAA CTTAATCGCC TTGCAGCACA TCCCCCTTTC 5820GCCAGCTGGC GTAATAGCGA AGAGGCCCGC ACCGATCGCC CTTCCCAACA GTTGCGCAGC 5880CTGAATGGCG AATGGCGCCT GATGCGGTAT TTTCTCCTTA CGCATCTGTG 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6780TTGCACAACA TGGGGGATCA TGTAACTCGC CTTGATCGTT GGGAACCGGA GCTGAATGAA 6840GCCATACCAA ACGACGAGCG TGACACCACG ATGCCTGTAG CAATGGCAAC AACGTTGCGC 6900AAACTATTAA CTGGCGAACT ACTTACTCTA GCTTCCCGGC AACAATTAAT AGACTGGATG 6960GAGGCGGATA AAGTTGCAGG ACCACTTCTG CGCTCGGCCC TTCCGGCTGG CTGGTTTATT 7020GCTGATAAAT CTGGAGCCGG TGAGCGTGGG TCTCGCGGTA TCATTGCAGC ACTGGGGCCA 7080GATGGTAAGC CCTCCCGTAT CGTAGTTATC TACACGACGG GGAGTCAGGC AACTATGGAT 7140GAACGAAATA GACAGATCGC TGAGATAGGT GCCTCACTGA TTAAGCATTG GTAACTGTCA 7200GACCAAGTTT ACTCATATAT ACTTTAGATT GATTTAAAAC TTCATTTTTA ATTTAAAAGG 7260ATCTAGGTGA AGATCCTTTT TGATAATCTC ATGACCAAAA TCCCTTAACG TGAGTTTTCG 7320TTCCACTGAG CGTCAGACCC CGTAGAAAAG ATCAAAGGAT CTTCTTGAGA TCCTTTTTTT 7380CTGCGCGTAA TCTGCTGCTT GCAAACAAAA AAACCACCGC TACCAGCGGT GGTTTGTTTG 7440CCGGATCAAG AGCTACCAAC TCTTTTTCCG AAGGTAACTG GCTTCAGCAG AGCGCAGATA 7500CCAAATACTG TCCTTCTAGT GTAGCCGTAG TTAGGCCACC ACTTCAAGAA CTCTGTAGCA 7560CCGCCTACAT ACCTCGCTCT GCTAATCCTG TTACCAGTGG CTGCTGCCAG TGGCGATAAG 7620TCGTGTCTTA CCGGGTTGGA CTCAAGACGA TAGTTACCGG ATAAGGCGCA GCGGTCGGGC 7680TGAACGGGGG GTTCGTGCAC ACAGCCCAGC TTGGAGCGAA CGACCTACAC CGAACTGAGA 7740TACCTACAGC GTGAGCTATG AGAAAGCGCC ACGCTTCCCG AAGGGAGAAA GGCGGACAGG 7800TATCCGGTAA GCGGCAGGGT CGGAACAGGA GAGCGCACGA GGGAGCTTCC AGGGGGAAAC 7860GCCTGGTATC TTTATAGTCC TGTCGGGTTT CGCCACCTCT GACTTGAGCG TCGATTTTTG 7920TGATGCTCGT CAGGGGGGCG GAGCCTATGG AAAAACGCCA GCAACGCGGC CTTTTTACGG 7980TTCCTGGCCT TTTGCTGGCC TTTTGCTCAC ATGTTCTTTC CTGCGTTATC CCCTGATTCT 8040GTGGATAACC GTATTACCGC CTTTGAGTGA GCTGATACCG CTCGCCGCAG CCGAACGACC 8100GAGCGCAGCG AGTCAGTGAG CGAGGAAGCG GAAGA 813权利要求
1.一种复制型不致病病毒，用于预防由牛病毒性腹泻病毒(BVDV)引起的疾病，其中所说的复制型不致病病毒包含取自BVDV病毒的基因或基因组合，所说的复制型不致病病毒在功能上表达所说的基因或基因组合。
2.权利要求1的病毒，其中所说的复制型不致病病毒是减毒的。
3.权利要求2的病毒，其中所说的复制型不致病病毒选自减毒的牛泡疹病毒1型(BHV-1)，减毒的腺病毒，减毒的牛乳头炎病毒，减毒的牛乳头状瘤病毒或减毒的假狂犬病病毒。
4.权利要求2的病毒，其中所说的复制型不致病病毒是减毒的并含有和表达下列基因的任意组合编码gp48，gp25，p14衣壳蛋白质，p20N-末端蛋白酶和p125/p80蛋白质的基因。
5.权利要求3的病毒，其中所说的复制型非致病病毒是减毒的并含有和表达下列基因的任意组合编码gp48，gp25，p14衣壳蛋白质，p20N-末端蛋白酶和p125/p80蛋白质。
6.权利要求2的病毒，其中所说的减毒是经过使胸苷激酶(tK)基因失去功能造成的。
7.权利要求3的病毒，其中所说的减毒是经过使胸苷激酶(tK)基因失去功能造成的。
8.权利要求4的病毒，其中所说的减毒是经过使胸苷激酶(tK)基因失去功能造成的。
9.权利要求5的病毒，其中所说的减毒是经过使胸苷激酶(tK)基因失去功能造成的。
10.权利要求9的病毒，其中所说的复制型不致病病毒是减毒的牛泡疹病毒1型(BHV-1)
11.权利要求10的病毒，其中所说的复制型不致病病毒含有并表达编码牛病毒性腹泻病毒(BVDV)糖蛋白gp53的基因。
12.权利要求11的病毒，其中在所说的牛泡疹病毒1型(BHV-1)中将信号肽插入编码gp53的基因或基因组合之前。
13.权利要求12的病毒，其中所说的编码gp53的基因插入到灭活的肠苷激酶(tK)基因位点。
14.权利要求13的病毒，其中用于产生该病毒，在功能上表达的基因或基因组合包含具有完整病毒DNA的重组质粒，所说的质粒包含a)含有胸苷激酶(tK)基因且在胸苷激酶(tK)基因上具有缺失的BHV-1基因组DNA片段，b)插入到胸苷激酶(tK)基因缺失处的启动子/多聚腺苷酸化信号，c)位于gp53基因或基因组合之前的信号肽基因序列，其全部插入到启动子和多聚腺苷酸化信号之间。
15.权利要求14的病毒，其中所说的信号肽基因序列取自任何充分鉴定的信号肽序列，如见于Perlman，D.，et al.，J.Mol.Biol.Vol.167pp.391-409(1983)的39个充分鉴定的信号肽序列中的任何一个。
16.权利要求15的病毒，其中所说的信号肽基因序列取自假狂犬病病毒gIII基因(PRV)和/或牛生长激素(BGH)。
17.权利要求16的病毒，其中的质粒选自下列质粒，a)pBHVtKex-1∷BGH/P53；b)pBHVtKex-1∷gIII/P53；c)pBHVtKex-3∷BGH/P53或d)pBHVtKex-3∷gIII/p53。
18.权利要求17的病毒，其中所说的产生在功能上表达的基因或基因组合的产物的病毒是选自下列之一的病毒T11-3，T11-6或T11-8。
19.权利要求18的病毒，其中所说的编码gp53的基因插入到灭活的胸苷激酶(tK)基因位点。
20.权利要求11病毒，其中所说的编码gp53的基因插入到灭活的胸苷激酶(tK)基因位点。
21.权利要求20的病毒，其中用于产生病毒的功能上表达的基因或基因组合包含具有完整病毒DNA的重组质粒，所说的质粒包含a)含胸苷激酶(tK)基因且在胸苷激酶(tK)基因上具有缺失的BHV-1基因组DNA片段，b)在胸苷激酶(tK)基因缺失处插入的启动子/多聚腺苷酸化信号。c)在启动子和多聚腺苷酸化信号之间插入的gp53基因或基因组合。
22.权利要求21的病毒，其中所说的质粒由具有质粒pHAS4特征的质粒构成。
23.权利要求22的病毒，其中所说的质粒是pBHVtKex-3∷P53。
24.权利要求23的病毒，其中所说的病毒选自下列病毒之一T2-3#3或T2-2#5。
25.一种用于预防由牛病毒性腹泻病毒(BDVD)引起的疾病的疫苗，包含权利要求1的药用上有效量的病毒和一种载体。
26.权利要求25中要求的用于预防由牛病毒性腹泻病毒(BD-VD)引起的疾病的疫苗，包含权利要求1的药用上有效量的病毒和一种载体，所说的载体包含任何生理缓冲介质，即含有大约2.5到15％的无抗BHV抗体的血清的pH大约为7.0到7.4的缓冲介质。
27.一种免疫动物抗由牛病毒性腹泻病毒(BDVD)引起的感染性疾病的方法，包含给动物施用药用上有效量的权利要求1的病毒。
28.一种制备权利要求1的病毒的方法，包含a)分离产生BVDV的功能上表达的基因或基因组合，b)将所说的基因或基因组合插入复制型不致病病毒中，c)选择功能上表达所说的基因或基因组合的产物的活病毒。
29.制备权利要求11的病毒的方法，其中用于产生该病毒的功能上表达的基因或基因组合以包括重组具有完整病毒DNA的质粒的方法来生产，所说的质粒包含a)含有胸苷激酶(tK)基因且胸苷激酶(tK)基因具有缺失的BHV-1基因组DNA片段，b)将启动子/多聚腺苷酸化信号插入到所说质粒的胸苷激酶(tK)基因的缺失处，c)在启动子和多聚腺苷酸化信号之间插入gp53基因或基因组合，d)用所说的质粒转染细胞以产生重组病毒，该病毒含有插入到活病毒中的功能性基因或基因组合，该活病毒在通常的宿主中不引起免疫抑制并且表达所说的功能性基因或基因组合。
30.制备权利要求12的病毒的方法，其中用于产生病毒的功能上表达的基因或基因组合由包括重组具有完整病毒DNA的质粒的方法来生产，所说的质粒包含a)含有胸苷激酶(tK)基因且在胸苷激酶基因上具有缺失的BHV-1基因组DNA片段，b)将启动子/多聚腺苷酸化信号插入到所说质粒的胸苷激酶(tK)基因缺失处，c)将前面具有信号肽基因序列的gp53基因或基因组合插入到启动子和多聚腺苷酸化信号之间，d)用所说的质粒转染细胞以产生含有插入到活病毒中的所说的功能性基因或基因组合的重组病毒，该活病毒在通常的宿主中不引起免疫抑制并表达所说的功能性基因或基因组合。
全文摘要
本发明涉及牛病毒性腹泻病毒(BVDV)及用于其治疗之疫苗的领域。本发明描述了制备活的、减毒的中泡疹病毒1型(BHV-1)作为表达BVDV抗原的病毒、疫苗和载体。含有与糖蛋白gp53相对应的序列的BVDVcDNA克隆插入到灭活的BHV-1病毒中。
文档编号C07K14/18GK1134175SQ94193978
公开日1996年10月23日 申请日期1994年10月31日 优先权日1993年11月5日
发明者E·J·哈尼斯, R·C·瓦尔德雷 申请人:厄普约翰公司