一种治疗病毒性角膜炎的nk细胞滴剂及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物医学技术领域，具体涉及一种治疗病毒性角膜炎的NK细胞滴剂及 其制备方法和应用。
【背景技术】
[0002] 病毒性角膜炎是由单纯疱疹病毒I型病毒感染引起的，严重危害人类眼部健康的 常见多发性疾病，未经治愈者致盲率极高，当身体抵抗力减退时，如感冒或高热等，容易诱 发该病反复发作，每次发作视力就下降一点，我国每年有将近500万患者因感染病毒性角膜 炎而致盲或视力衰退。感染后可累及巩膜、结膜和葡萄膜，当眼部或全身其他部位受到反复 感染后，病毒迀移上行到三叉神经节，潜伏在感觉神经元上或直接潜伏在角膜内，在机体的 免疫状态发生改变，货收到了精神创伤、内分泌失调等原因刺激下经常复发，严重时使角膜 形成瘢痕而致盲，是主要的致盲原因之一。
[0003] 目前治疗病毒性角膜炎的方法主要以抗病毒药物为主，而更昔洛韦抗病毒眼药是 最有效的核苷类抗病毒药物之一，其主要是通过嘌呤核苷类抗病毒药，在体内转化为三磷 酸酯，作为错误的DNA复制底物干扰病毒DNA的复制达到抗病毒的作用，对宿主细胞的a-DNA 聚合酶也有抑制作用，但程度较轻。其抗单纯疱疹病毒的作用约为阿糖胞苷的2倍，碘苷的 10倍，阿糖腺苷的160倍，具有药效强，副作用小，耐受性良好的优点。然而，病毒性角膜炎的 复发率较高，临床上尚无能够有效控制病毒性角膜炎复发的药物。
[0004] 现有技术中应用的抗病毒眼药如阿昔洛韦、碘苷、阿糖胞苷和环胞苷等，都属于核 苷类眼用制剂，都是通过干扰病毒的核酸复制以达到治疗经的目的，该类药物的起效时间 长，使用次数越多则副作用越大，在病毒性角膜炎的治疗过程中需要长期使用抗病毒药物 治疗，反复使用也会出现病毒耐药毒株，疗效差。
[0005] 因此，应用免疫学原理和免疫学手段，增强患者的免疫功能的免疫疗法，例如，通 过直接给患者使用激活的免疫细胞达到治疗和清除微生物感染的过继免疫疗法日益受到 关注。
【发明内容】
[0006] 本发明针对现有技术中存在的问题，提供一种治疗病毒性角膜炎的NK细胞滴剂， 将具有快速高效清除病毒的自体自然杀伤细胞与阿昔洛韦制剂联用，不仅能够充分利用自 体自然杀伤细胞的固有免疫优势快速杀伤病毒，不会发生免疫排斥反应，达到稳定高效的 治疗病毒性角膜炎问题，而且起效快、不易复发，无刺激性、无过敏性、无不良反应，疗效好。
[0007] 本发明的另一目的是提供一种治疗病毒性角膜炎的NK细胞滴剂的制备方法。
[0008] 本发明的再一目的是提供一种NK细胞滴剂用于治疗病毒性角膜炎的用途。
[0009] 本发明通过以下技术方案实现该目的：
[0010] 一种治疗病毒性角膜炎的NK细胞滴剂，由NK细胞和更昔洛韦滴眼液组成。
[0011] 作为优选的，所述滴剂中含有的NK细胞密度为I X IO7~I X 108cell/mL。
[0012] 一种治疗病毒性角膜炎的NK细胞滴剂的制备方法，包括以下步骤：
[0013] NK细胞的分离纯化：
[0014] 1)采集外周血，并用Ficoll法分离外周血单个核细胞，用PBS洗涤细胞1次；
[0015] 2)向每5 X IO6~2 X IO7个外周血淋巴单核细胞中加入90yL磁珠分离缓冲液，重悬 后在细胞悬液中加入IOyL CD5 (Ly 1)磁珠，4°C下孵育15min;
[0016] 3)加入I mL缓冲液重悬，15 0 Or pm离心5m i η，弃上清；倒入经缓冲液润洗过的 MidiMACS分选器的LD分离柱中，收集从分选柱中流出的细胞，用ImL缓冲液洗柱，重复1次， 收集全部过柱液；
[0017] 4)细胞计数，1500rpm离心5min，弃上清，向每5 X IO6~2 X IO7细胞加入90yL缓冲液 重悬；
[0018] 5)在上述细胞悬液中按10μ!75Χ106~2X107个细胞的量加入CD49b(DX5)磁珠，充 分混匀，4°C~8°C孵育15分钟，以IO 7细胞/mL缓冲液重悬，1500r/min离心10分钟，弃上清 液，500yL缓冲液重悬，置MS分离柱于MidiMACS分选器中，2mL缓冲液润洗LD分离柱，将细胞 悬液加入分离柱中，收获从分选柱中流出的细胞，待悬液快流尽时，加入500yL缓冲液洗柱， 重复3次；
[0019] 6)将MS柱移出磁场，加入ImL缓冲液，快速打下NK(CD3-DX5+)细胞，1500r/min离心 10分钟，弃上清液，lOOyL/lO6缓冲液重悬，纯化得到外周血NK细胞；
[0020] NK细胞的扩增培养：
[0021] 7)向纯化后的外周血NK细胞中添加细胞培养液进行培养，细胞密度为I X IO6AiL; 同时向培养液中添加终浓度分别为lOOU/mL的IL-2和200U/mL的IL-12;
[0022] 8)置于5%C02培养箱内，37°C下培养扩增14天，每隔2-3天补充上述细胞因子；
[0023] 9)待细胞生长至总数为5 X IO6~2 X IO7个细胞时，用流式细胞术鉴定NK细胞和台 盼蓝计数测试NK细胞活力；
[0024] NK细胞滴剂的制备：
[0025] 10)选取经过流式细胞术鉴定和台盼蓝染色，纯度超过90%、并且总数达到5 X IO6 ~2 X IO7的NK细胞，离心去除上清液，利用注射用生理盐水清洗卜2遍，400g离心5min，收集 NK细胞；
[0026] 11)用更昔洛韦滴眼液重悬细胞，调整细胞浓度为5 X IO6~2 X 107cell/mL，制成NK 细胞滴剂。
[0027] 一种NK细胞滴剂用于治疗病毒性角膜炎的用途。
[0028]相对于现有技术，本发明的有益效果为:本发明的治疗病毒性角膜炎的NK细胞滴 剂，由NK细胞和更昔洛韦滴眼液组成，不仅能够充分利用自体自然杀伤细胞的固有免疫优 势快速杀伤病毒，不会发生免疫排斥反应，达到稳定高效的治疗病毒性角膜炎问题，而且起 效快、不易复发，无刺激性、无过敏性、无不良反应，疗效好，制备方法简单、成本低，本发明 的NK细胞滴剂在治疗病毒性角膜炎的应用中具有显著的效果，且不易复发。
【具体实施方式】
[0029]以下结合具体实施例对本发明进行详细描述。
[0030] 实施例1。
[0031]本实施例提供一种治疗病毒性角膜炎的NK细胞滴剂的制备方法，包括以下步骤： [0032] NK细胞的分离纯化：
[0033] 1)采集外周血，并用Ficoll法分离外周血单个核细胞，用PBS洗涤细胞1次；
[0034] 2)向每5 X IO6个外周血淋巴单核细胞中加入90yL磁珠分离缓冲液，重悬后在细胞 悬液中加入IOyL CD5(Lyl)磁珠，4°C下孵育15min;
[0035] 3)加入I mL缓冲液重悬，15 0 Or pm离心5m i η，弃上清；倒入经缓冲液润洗过的 MidiMACS分选器的LD分离柱中，收集从分选柱中流出的细胞，用ImL缓冲液洗柱，重复1次， 收集全部过柱液；
[0036] 4)细胞计数，1500rpm离心5min，弃上清，向每5乂106细胞加入9(^缓冲液重悬；
[0037] 5)在上述细胞悬液中按10yL/5X106个细胞的量加入CD49b(DX5)磁珠，充分混匀， 4°C~8°C孵育15分钟，以IO7细胞/mL缓冲液重悬，1500r/min离心10分钟，弃上清液，500yL 缓冲液重悬，置MS分离柱于MidiMACS分选器中，2mL缓冲液润洗LD分离柱，将细胞悬液加入 分离柱中，收获从分选柱中流出的细胞，待悬液快流尽时，加入500yL缓冲液洗柱，重复3次； [0038] 6)将MS柱移出磁场，加入ImL缓冲液，快速打下NK(CD3-DX5+)细胞，1500r/min离心 10分钟，弃上清液，lOOyL/lO6缓冲液重悬，纯化得到外周血NK细胞；
[0039] NK细胞的扩增培养：
[0040] 7)向纯化后的外周血NK细胞中添加细胞培养液进行培养，细胞密度为I X IO6AiL; 同时向培养液中添加终浓度分别为lOOU/mL的IL-2和200U/mL的IL-12;
[00411 8)置于5 % CO2培养箱内，37 °C下培养扩增14天，每隔2-3天补充上述细胞因子；
[0042] 9)待细胞生长至总数为4 X IO7个细胞时，用流式细胞术鉴定NK细胞和台盼蓝计数 测试NK细胞活力；
[0043] NK细胞滴