细胞因子；
[0092] 9)待细胞生长至总数为5 X IO8个细胞时，用流式细胞术鉴定NK细胞和台盼蓝计数 测试NK细胞活力，具体的：
[0093] 在IOOyL上述细胞悬液中各加入相应体积的PE-Ly5抗小鼠 CD3、FITC抗小鼠 Pan- NKCDX5荧光抗体，4°C避光孵育45分钟后用I3BS洗涤两次，加500yL预冷1%多聚甲醛-PBS重 悬，采用FAC-SAria流式细胞仪，用前向散射角（FCS)及侧向散射角（SSC)确定淋巴细胞群 (R1)，再以PE-Ly5-CD3和FITC-DX5双标记设门来分析纯化出小鼠肝脏NK(CD3-DX5+)细胞纯 度。分离纯化后的小鼠外周血NK细胞经台盼蓝染色，表明其活性可以达到92%~95%，双色 荧光染色后经流式细胞仪检测，证实分离纯化扩增的外周血NK细胞的纯度可高达(94.81 土 1.04)%〇
[0094] NK细胞滴剂的制备：
[0095] 10)经过流式细胞术鉴定和台盼蓝染色，纯度超过90%、并且总数达到IO7的NK细 胞，可用于NK细胞滴剂的制备，离心去除上清液，加注射用生理盐水清洗1 -2遍，400g离心 5min，收集细胞；
[0096] 11)用更昔洛韦滴眼液重悬细胞，调整细胞浓度为I X IO8AiL制成4~6ml的NK细胞 滴剂。
[0097]实施例5、治疗病毒性角膜炎的NK细胞滴剂的眼部刺激性试验 [0098] 1.1眼部刺激实验
[0099] 单次给药试验:Balb/c小鼠30只，小鼠接种病毒前用10g/L荧光素钠对小鼠角膜进 行染色，并在裂隙灯显微镜下检查角膜情况，排除存在角膜或结膜病变者。分为3组，10只一 组，分别为NK细胞滴剂（I X IO7个/mL、5 X IO7个/mL、l X IO8个/mL)组、更昔洛韦眼液组、生理 盐水组，右眼滴受试药0.1 mL，给药后1，3，24，72h时做眼科裂隙灯检查(结膜、角膜、虹膜、分 泌物）。
[0100] 给药Hd试验:小鼠饲养1周，经眼科检查双眼完全正常后，左眼滴入受试物4次/d， 连续14cL14d后作眼科裂隙灯检查(结膜、角膜、虹膜、分泌物），参照国家食品药品监督管理 局"化学药物刺激性、过敏性和溶血性研究技术指导原则"进行评分，结合表1、表2的分值标 准和评价标准对各组刺激性结果进行评价。
[0101] 表1眼刺激反应分值标准
[0106] 表3不同浓度的抗病毒滴剂单次给药后眼刺激性结果(?，η = 5)
[0109] 1.2结果评价
[0110] 按表1的要求，将每一个观察时间每一动物的眼角膜、虹膜和结膜的刺激反应分值 相加得总积分，将一组的积分总和除以动物数，即得最后分值，结合表2的评价标准、表3的 眼刺激性结果对刺激性结果进行评价。
[0111] 试验结果表明：ΝΚ细胞滴剂点眼后，小鼠眼结膜轻度充血，个别有少量分泌物，无 水肿，角膜透明，虹膜纹理清晰，瞳孔对光反应灵敏，刺激性评价结果最优，表明本发明的NK 细胞滴剂对眼粘膜无刺激性。
[0112] 实施例6、治疗病毒性角膜炎的NK细胞滴剂的治疗效果试验
[0113] 1.1给药方法：
[0114]分别用I X 107、5 X 107、1 X IO8Cel 1/mL的自然杀伤细胞抗病毒滴剂治疗小鼠实验 性单纯疱疹病毒性角膜炎，与阳性对照组更昔洛韦治疗组进行对比，每日滴眼3次，每次给 药约0· ImL，间隔4h(8am、12am、16am)，双眼接受同样治疗，共12天。每次给药前生理盐水冲 洗5min，水的流量和流速都不会导致眼损伤。
[0115] 1.2裂隙灯显微镜观察：
[0116] 2%荧光素钠分别滴入各组小鼠双眼结膜囊内，闭合眼睑1分钟，30min内固定头部 用裂隙灯观察。每隔3天观察一次并评分、纪录，共12天。
[0117] 1.3结果评价：
[0118] 结合裂隙灯观察结果，根据表4的评分标准对各组进行疗效评分，评分结果如表5 所示。
[0119] 表4裂隙灯观察小鼠眼的评分标准
[0122] 表5各组疗效评分(f±S,n = l〇)
[0124] 试验结果表明：本发明的各组NK细胞滴剂的治疗效果均优于单纯使用更昔洛韦滴 剂组，够充分利用自体自然杀伤细胞的固有免疫优势快速杀伤病毒，不会发生免疫排斥反 应，达到稳定高效的治疗病毒性角膜炎问题，而且起效快、不易复发，无刺激性、无过敏性、 无不良反应，疗效好。
[0125] 以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并 不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员 来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保 护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
【主权项】
1. 一种治疗病毒性角膜炎的NK细胞滴剂，由NK细胞和更昔洛韦滴眼液组成。2. 如权利要求1所述的治疗病毒性角膜炎的NK细胞滴剂，所述滴剂中含有的NK细胞密 度为 1 X 107~1 X 108cell/mL。3. -种治疗病毒性角膜炎的NK细胞滴剂的制备方法，包括以下步骤： NK细胞的分离纯化： 1) 采集外周血，并用Ficoll法分离外周血单个核细胞，用PBS洗涤细胞1次； 2) 向每5X106~2X107个外周血淋巴单核细胞中加入90yL磁珠分离缓冲液，重悬后在 细胞悬液中加入1 OyL CD5 (Ly 1)磁珠，4°C下孵育15min; 3) 加入lmL缓冲液重悬，1500rpm离心5min，弃上清;倒入经缓冲液润洗过的MidiMACS分 选器的LD分离柱中，收集从分选柱中流出的细胞，用lmL缓冲液洗柱，重复1次，收集全部过 柱液； 4) 细胞计数，1500rpm离心5min，弃上清，向每107细胞加入90yL缓冲液重悬； 5) 在上述细胞悬液中按10yL/5 X 106~2 X 107个细胞的量加入CD49b(DX5)磁珠，充分混 匀，4°C~8°C孵育15分钟，以107细胞/mL缓冲液重悬，1500r/min离心10分钟，弃上清液，500 yL缓冲液重悬，置MS分离柱于MidiMACS分选器中，2mL缓冲液润洗LD分离柱，将细胞悬液加 入分离柱中，收获从分选柱中流出的细胞，待悬液快流尽时，加入500yL缓冲液洗柱，重复3 次； 6) 将MS柱移出磁场，加入lmL缓冲液，快速打下NK(CD3-DX5+)细胞，1500r/min离心10分 钟，弃上清液，ιοομL?ο 6缓冲液重悬，纯化得到外周血NK细胞； ΝΚ细胞的扩增培养： 7) 向纯化后的外周血ΝΚ细胞中添加细胞培养液进行培养，细胞密度为1 X 106/mL;同时 向培养液中添加终浓度分别为l〇〇U/mL的IL-2和200U/mL的IL-12; 8) 置于5%C02培养箱内，37°C下培养扩增14天，每隔2-3天补充上述细胞因子； 9) 待细胞生长至总数为4 X 107~5 X 108个细胞时，用流式细胞术鉴定NK细胞和台盼蓝 计数测试NK细胞活力； NK细胞滴剂的制备： 10) 选取经过流式细胞术鉴定和台盼蓝染色，纯度超过90 %、并且总数达到4 X107~5 X 108的NK细胞，离心去除上清液，利用注射用生理盐水清洗卜2遍，400g离心5min，收集NK细 胞； 11) 用更昔洛韦滴眼液重悬细胞，调整细胞浓度为1X107~lX108cell/mL，制成NK细胞 滴剂。4. 一种NK细胞滴剂用于治疗病毒性角膜炎的用途。
【专利摘要】本发明涉及生物医学技术领域，具体涉及一种治疗病毒性角膜炎的NK细胞滴剂及其制备方法和应用，本发明的治疗病毒性角膜炎的NK细胞滴剂，由NK细胞和更昔洛韦滴眼液组成，不仅能够充分利用自体自然杀伤细胞的固有免疫优势快速杀伤病毒，不会发生免疫排斥反应，达到稳定高效的治疗病毒性角膜炎问题，而且起效快、不易复发，无刺激性、无过敏性、无不良反应，疗效好，制备方法简单、成本低，本发明的NK细胞滴剂在治疗病毒性角膜炎的应用中具有显著的效果，且不易复发。
【IPC分类】A61P27/02, A61K35/17, A61K31/522, C12N5/0783, A61K9/08, A61P31/22
【公开号】CN105687238
【申请号】CN201610087832
【发明人】王一飞, 陈海佳, 葛啸虎, 黄新珠
【申请人】广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司
【公开日】2016年6月22日
【申请日】2016年2月16日