一种用于抑制冠状病毒感染的制剂的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，涉及一种用于抑制冠状病毒感染的制剂。
【背景技术】
[0002] 冠状病毒不仅可以引起许多动物疫情的暴发，同时，也是人类普通感冒的主要病 原之一，儿童感染率较高，主要是上呼吸道感染，一般很少波及下呼吸道，潜伏期2~5天，各 年龄组均有发病，儿童多见，以上呼吸道感染为特征，少数可致腹泻、支气管炎、肺炎和胸腔 积液等。近年来，尤其值得注意是病冠状病毒常常引起人类严重的呼吸系统感染，导致严重 急性呼吸综合征(SARS)和中东呼吸综合征(MERS)等烈性传染病的暴发，对全球公共卫生系 统造成极大的冲击。
[0003] 人类面临病毒性传染病的现实和潜在威胁日益严峻，人类应对突发传染病的防控 压力日感倍增，但愈来愈多的实际情况表明：当病毒发生突变或出现新型病毒而导致传染 病疫情暴发时，原来的特异性防治药物难以发挥应有防控效果，甚至毫无疗效，而人类认知 水平和科研周期的限制，又使具有显著疗效的新一代特异性预防和治疗药物难以在短时间 内推出，极易导致疫情的迅速扩散和局部地区的灾难性暴发，不仅对当地的公共卫生服务 造成极大的破坏，同时也对社会的政治和经济造成巨大的冲击。因此，依据病毒的基本生物 学特性，针对病毒侵染宿主细胞的共性靶点，研发新型病毒感染抑制剂，对于应对病毒性传 染病疫情的持续挑战具有重要意义。
[0004]植物化合物被称为"第七类营养素"，广泛存在于日常食物，是一类对人体健康具 有特殊作用的非营养性化学物质。相关研究发现部分植物化合物具有抑制病毒感染的生物 活性，并逐渐成为抗病毒研究的热点之一。初步的研究结果显示:植物化合物的生物学效应 主要表现在其对细胞膜生物学特性的影响和局部微环境平衡的改变等方面，部分植物化合 物通过直接嵌入细胞膜脂质双层结构，改变细胞膜正常的功能性流动和电势电位差，进而 发挥一定的生物学效应。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种抑制冠状病毒感染的制剂及其应用。
[0006] 本发明所提供的应用具体为一种制剂在如下（1)或(2)中的应用：
[0007] (1)制备用于抑制冠状病毒感染的产品；
[0008] (2)用于抑制冠状病毒感染；
[0009] 所述制剂主要由表没食子儿茶素没食子酸酯、单宁酸和黄芪多糖混合而成;所述 表没食子儿茶素没食子酸酯、所述单宁酸和所述黄芪多糖的质量配比为(〇. 5-1.0): (0.5- 1.0):(0.5-1.5)〇
[0010] 在本发明的一个实施例中，所述用于抑制病毒感染的制剂具体由表没食子儿茶素 没食子酸酯(EGCG)、单宁酸和黄芪多糖混合而成;所述表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)、 所述单宁酸和所述黄芪多糖的质量配比为1: 1:1.5。
[0011] 在本发明中，所述抑制冠状病毒感染为如下(a)或(b):
[0012] (a)预防冠状病毒感染；
[0013] (b)在与冠状病毒同时作用于宿主或宿主细胞时，抑制所述冠状病毒对所述宿主 或所述宿主细胞的感染。
[0014] 更加具体的，在本发明的实施例中，所述制剂对所述冠状病毒感染的抑制作用具 体体现为：以哺乳动物细胞作为冠状病毒感染对象，在冠状病毒感染细胞的同时或者在冠 状病毒感染细胞前施用所述制剂，所述制剂对冠状病毒的半数抑制浓度与抑制病毒感染的 阳性对照药物相比显著降低。所述阳性对照药物具体为利巴韦林(Ribavirin)。
[0015] 在本发明中，所述哺乳动物细胞(或(b)中所述的宿主细胞)具体为鼠成纤维细胞 (17C1-1 细胞）。
[0016] 在本发明中，所述冠状病毒为鼠肝炎冠状病毒。更加具体的，所述冠状病毒为鼠肝 炎冠状病毒A59株。
[0017] 本发明以冠状病毒(mouse hepatitis virus，MHV)为实验对象，采用观察细胞病 变的方法，在不同的感染条件下，分别分析了表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)、单宁酸和 黄芪多糖这三种植物化合物单体及其混合制剂抑制病毒感染的规律和特点。结果证实:本 发明所提供的三种植物化合物单体和复合配方混合物的细胞毒性均不高于已经获得安全 许可的对照样品利巴韦林，较为安全。在安全的使用浓度下，预防性使用EGCG和单宁酸等植 物化合物单体以及植物提取物复合配方混合物，可以有效的抑制冠状病毒的感染。本发明 所提供的制剂具有进一步研发为冠状病毒感染抑制剂的商业价值。
【具体实施方式】
[0018] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0019] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0020]下述实施例中涉及的定量实验数据以均数土标准差（土s)表示，采用SPSS 17.0统 计软件运用单因素水平方差分析的方法对组间比较数据进行统计处理。
[0021] 细胞株：鼠成纤维细胞（17C1-1细胞），由英国布里斯托大学Stuart Siddell教授 馈赠，记载于"Lin Lei1Sun Ying1Wu Xiaoyan1Sun Zounan1Yang Yi,Su Wenli1Hu Yi1Zhu Qingyu,Guo Deyin,Liu Jingmei,Chang Guohui·Attenuation of Mouse Hepatitis Virus by Deletion of the LLRKxGxKG Region of Nspl.PLoS ONE,2013 8(4) :e61166.，> 一文，公众可从申请人处获得，仅用于重复本发明实验使用。细胞按常规方法传代培养。 [0022] 病毒：冠状病毒（鼠肝炎冠状病毒A59株，简称MHV-A59)记载于"Lin Lei，Sun Ying1Wu Xiaoyan,Sun Zounan1Yang Yi,Su WenIi,Hu Yi,Zhu Qingyu,Guo Deyin1Liu Jingmei,Chang Guohui.Attenuation of Mouse Hepatitis Virus by Deletion of the LLRKxGxKG Region of Nspl.PLoS 0NE，2013 8(4) :e61166."一文，公众可从申请人处获 得，仅用于重复本发明实验使用。
[0023] 培养液：1 )、细胞生长培养液：以DMEM培养基(G1 ibo公司产品）为母液，分别加入 10 % (体积分数)胎牛血清(Sigma公司产品），0 · 2mg/ml谷氨酰胺(G1 ibo公司产品），100U/ml 青霉素，链霉素。2)、细胞维持培养液，胎牛血清含量为2% (体积分数），其余与1)均相同。 3)、病毒增殖培养液:与细胞生长培养液相同。
[0024] 表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG) :Sigma公司产品（分析纯度>95%)，产品编号 为E4143，CAS#989-51-5。
[0025] 单宁酸（Tannin):Sigma公司产品（分析纯度>99%)，产品编号为V900190;CAS# 1401-55-4。
[0026] 黄芪多糖（APS):上海金穗生物科技有限公司产品（2-(Chl〇r〇methyl )-4-(4-nitrophenyl)-l，3-thiazole)(分析纯度 >70%)，产品编号为 JS11328;CAS#89250-26-0。
[0027] 阳性对照药物:利巴韦林(Ribavirin)，美仑生物公司产品。因目前还未有通过改 变宿主细胞膜特性抑制病毒感染的标准阳性对照药物。本研究以目前抗病毒最常用药物利 巴韦林作为对照。实验前以PBS缓冲液溶解，制成2560μg/ml过滤，除菌后，-20 °C保存。
[0028] 倒置相差显微镜：日本Olympus公司产品。
[0029] 细胞培养箱:美国Thermo公司产品。
[0030] 多功能酶仪:美国Molecular Devices公司SpectraMax M5型多功能酶标仪。
[0031] 1、细胞复苏与传代
[0032] 液氮中取出17C1-1细胞，37°C水浴，融化后，以1000 rpm离心5min，弃上清，加入适 当的细胞生长培养液，反复吹打均匀，使细胞密度约为2 X IO5个/ml，以IOml/瓶，于T25细胞 培养瓶中，细胞培养箱中常规培养。24h后于镜下观察，细胞的贴壁情况，48-72h后，或待细 胞生长到密度大约为95%时，弃原培养液，加入PBS缓冲液，漂洗两次，0.5ml 0.25% (0.25g/100ml)EDTA，于37°C培养箱中温育消化，当细胞收缩变圆时，迅速加入细胞生长培 养液，终止消化，反复吹打均匀后，以1000 rpm离心，5min，弃上清，使悬浮细胞浓度约为I X IO5个/ml，IOml/每瓶，移入T25细胞培养瓶，放置细胞培养箱，进行常规传代培养。
[0033] 2、病毒增殖
[0034] 取细胞生长密度约为80%的T25细胞培养瓶，弃原液，以roS，漂洗两次，以去除血 清残留，加入已稀释病毒(稀释液为PBS缓冲液），接种量MOI = O.01，以及Iml培养基，晃匀， 置于细胞培养箱中吸附lh，弃上清，每瓶加入IOml相应病毒增殖培养液。观察细胞病变，48-72h后，或待细胞病变达75 %以上时，收毒，取上清，反复冻融3次，以3000rpm，4°C，离心 5min，分装上清，并测定病毒滴度TCID50。
[0035] 3、病毒滴度TCID5q测定
[0036]采用致细胞病变法(CPE)测定，以单细胞悬液，加入96孔微量培养板中，每孔200μ 1，使细胞量达到2 X IO5个/ml，细胞培养箱中培养48-72h，直至细胞单层密度约为80 %时， 取出，弃培养基，以PBS漂洗两遍，利用病毒增殖培养液将病毒原液10倍梯度稀释为10 3~ 1〇_13,每浓度梯度8孔一列，每