一种油气微生物勘探方法与流程

本发明属于地质勘探领域，具体涉及一种根据丁烷氧化菌确定候选勘探区和候选井位的技术。特别涉及一种将微生物培养结果和微生物分子检测技术相结合勘探油气资源的方法。

背景技术：

油气微生物勘探法源于前苏联。早在1937年，前苏联地质微生物学家mogilewskii发现由于细菌繁殖引起的近地表土壤中烃气发生季节性的变化，进而提出了石油和天然气的微生物勘探方法，并在实践中运用甲烷氧化菌作为地下气藏的指示菌。50年代晚期，美国地质微生物学家hitzman博士为phillips石油公司开发了一种油气微生物勘测技术most(microbialoilsurveytechnique)技术。该技术利用丁烷氧化菌的高丁醇的特性来探测烃微渗漏现象。自1956年以来，德国m.wagner博士独立地开发了一项新型的地表勘探技术—油气微生物勘探技术mpog(microbialprospectionforoilandgas)，该技术利用甲烷氧化菌和丁烷氧化菌来探测烃微渗漏现象。90年代初，该技术应用开始从西北欧陆地拓展到北海区域内。到90年代末期，mpog技术的物理-化学和微生物学理论基础、方法技术和应用进入成熟阶段，形成了现代油气微生物勘探技术。我国从1955年开始，由中国科学院菌种保藏委员会(微生物研究所前身之一)与石油工业部合作进行了气态烃氧化菌和油气田微生物学勘探法的研究。

油气微生物勘探技术经历了半个多世纪的发展，进行了大量的现场应用，取得了很好的应用效果，在提供烃富集的直接证据方面，展示出了其他技术不具备的优势，已经成为一项被广泛认可的油气勘探技术。

现有的油气微生物勘探技术，主要包括以下几种：

1.微生物石油调查技术(microbialoilsurveytechnology，most)：由美国hitzman博士开发(hitzmando.prospectingforpetroleumdeposits:unitedstatespatent.1959,2,880142)。该技术使用选择性培养基作为烃氧化菌检测计数培养基，这种选择性培养基只有烃氧化菌才能在其中生长，对非烃氧化菌具有毒害和抑制作用，所以克服了微生物的驯化这一干扰，得到的结果相对更为可靠。该技术主要在常规微生物培养方法上进行了一定的改进，使得培养出来的烃氧化菌的数值更为可靠。

2.油气微生物勘探技术mpog(microbialprospectionforoilandgas，mpog)：德国wanger博士开发，其检测方法主要以微生物细胞培养为基础(wagnermanfred,wagnermartin,joachimpiske,etal.casehistoriesofmicrobialprospectionforoilandgasonshoreandoffshoreinnorth-westeurope//schumacherd,leschackla.aapgstudiesingeology,surfaceexplorationcasehistories:applicationsofgeochemistry,magnetic,andremotesensing.tulsa,ok:aapg,2002,48:453-479)。2000年，长江大学将该技术引入至中国，在华北油田做了先导性试验。在中国实践的mpog技术的检测方法主要为：利用气态烷烃作为碳源对烃氧化菌进行培养计数，并综合一些其他指标最后得出烃氧化菌的评价指标——mu值(measurementunit)。

3.微生物地球化学勘探技术(mgce)，由盎亿泰地质微生物技术(北京)有限公司开发(郝纯等.微生物地球化学勘探技术及其在南海深水勘探中的应用.中国石油勘探,2015,20(5):54-61)。该技术是在most检测基础上进行了一些调整，也是基于微生物细胞培养方法的检测实现的。

4.丁烷氧化菌定量技术(cn201510400854.3)：以丁烷氧化菌的总菌和活菌异常为指标进行石油勘探、油藏表征和异常判识的方法，通过定量检测石油勘探区和/或油藏区上方表层土壤和/或沉积物中丁烷氧化菌的总菌和活菌来获得丁烷氧化菌的总菌数量，或同时获得丁烷氧化菌的总菌异常和活菌数量。

现有的油气微生物勘探技术以单一的微生物培养技术或微生物分子定量技术为主，通过相对定量或者部分绝对定量某一类烃氧化菌的检测形式，实现对微生物异常的识别。

具体而言，微生物培养技术虽然相对成熟，但信息量低，分辨率有限，不能完全反映微生物对烃富集的响应过程和响应程度，难以真实反应该区域的烃氧化菌的数量；另外，在相等微生物异常区域面积大小或菌落群数相等情况下，无法区进一步区分两个相同微生物异常区域的等级和优劣。分子定量技术虽然在检测精度上有较大提升，但不能真实的反应所有烃烷氧化菌的状况，难以全面评估微生物对烃渗漏的响应特征；另外，分子定量技术成本高，大规模采样实施推广难度较大。

技术实现要素：

针对现有技术的缺陷，本发明将微生物对低级烷烃渗漏响应特性和分子检测手段相结合，提供一种烃氧化菌覆盖面广、兼顾微生物可培养性和分子标记、成本可控、定位准确的油气资源勘探方法。

具体而言，本发明提供一种油气微生物勘探方法，其特征在于包括以下步骤：其包括：(1)设计采样点平面矩阵；(2)采集样品；(3)微生物培养法检测丁烷氧化菌含量；(4)荧光定量pcr检测低级烃氧化菌含量；(5)选择候选勘探区；(6)确定候选井位。

本发明所述油气微生物勘探方法，其特征在于包括：

(1)在勘探区内设置采样点平面矩阵，结合勘探区地形和平面矩阵确定采样点的坐标；

(2)采集样品，样品的采样量为10-100g，采样深度为20-60cm，所采集的样品在0至-20℃保存和运输；

(3)利用选择性培养基通过微生物培养法检测丁烷氧化菌的含量，绘制等值线，确定丁烷氧化菌培养异常区；

(4)对丁烷氧化菌培养异常区的样本进行实时荧光定量pcr检测，所述实时荧光定量pcr针对低级烃氧化菌特异性保守区进行检测，所述低级烃氧化菌包括甲烷氧化菌、乙烷氧化菌和丙烷氧化菌；

(5)根据实时荧光定量pcr的结果，选择候选勘探区；

(6)在微生物培养结果、荧光定量pcr结果的基础上，结合地表温度、土壤岩性、土壤ph值、土壤盐度、地表植被等因素，确定井位候选点。

本发明所述油气微生物勘探方法，其特征在于步骤(1)中勘探区域内平面矩阵的网格密度为200-500m×100-250m。

本发明所述油气微生物勘探方法，其特征在于步骤(2)中样品采样量为50g，采样深度为40cm，所采集的样品在-20℃保存和运输。

本发明所述油气微生物勘探方法，其特征在于步骤(3)中通过选择培养法检测丁烷氧化菌的含量，先采用以丁烷为唯一碳源的液体培养基进行富集，再以丁醇为唯一碳源的固体平板通过平板稀释法检测样本中丁烷氧化菌的含量。

本发明所述油气微生物勘探方法，其特征在于所述以丁烷为唯一碳源的富集方法如下：在无菌操作台上称取1g土壤样品置于盛有50ml液体培养基的150ml三角瓶中，向培养基液面以下充入丁烷气使培养液中丁烷气达到饱和，并使三角瓶中的气体空间充满丁烷气，封口，180rpm28℃震荡培养7d。

本发明所述油气微生物勘探方法，其特征在于所述以丁醇为唯一碳源的固体平板中含有5％的丁醇作为碳源。

本发明所述油气微生物勘探方法，其特征在于所述培养基中包括k2hpo41.75g，kh2po40.96g，nano32.0g，mgcl20.1g，(nh4)2so40.1g，微量元素0.2ml，ph为7.2；其中每升微量元素中含有cacl25.54g，zncl25.3g，mncl25.06g，feso44.99g，(nh4)6mo7o241.10g，cuso41.57g，cocl21.61g。

本发明所述油气微生物勘探方法，其特征在于步骤(4)中荧光定量pcr检测针对的靶基因为低级烷氧化酶基因。

本发明所述油气微生物勘探方法，其特征在于检索genbank数据库中各低级烃氧化菌中低级烷氧化酶基因序列，进行多重比对，针对保守区序列设计荧光定量pcr引物。

本发明所述低级烷氧化酶基因包括烷烃单加氧酶基因、烷烃双加氧酶基因，所述烷烃单加氧酶基因甲烷单加氧酶基因、乙烷单加氧酶基因、丙烷单加氧酶基因。

与现有技术相比，本发明取得了以下有益的技术效果：

(1)信息量全面。传统的微生物细胞培养方法只是对可培养烃氧化菌的半定量，而分子生物学检测方法是在分子级别对代谢低级烷烃的基因进行定量的技术。微生物培养和分子检测相结合，检测范围不仅包括了通过微生物培养方法获得烃氧化菌菌种库，而且还包括了相关文献提到的功能基因，因此在信息量方面更加全面，从而提高了油气勘探区及候选井位的精度和准确度。

(2)涉及了几乎所有的可挥发性烷烃。本申请的勘探方法不仅考虑单一功能的丁烷氧化菌或甲烷氧化菌。微生物培养法涉及对丁烷的响应，分子检测法涉及对其它可挥发性低级烷烃的响应。另外，本发明微生物培养法采用了丁烷富集、丁醇检测，相较于现有的丁烷培养法或丁醇培养法，即确保了微生物对丁烷的响应，又方便了固体平板检测。

(3)分阶段定位，实现了微生物培养法和分子检测方法的优势互补。首先利用微生物培养方法对工区内丁烷氧化菌丰度进行判别，识别出微生物异常发育的构造，然后对识别出的微生物异常用分子检测技术对烃氧化菌的绝对数量进行精确定量。这种分批分指标的检测方式，大幅度减少了分子检测的样品量，在满足检测精度和检测信息量的基础上降低了检测成本。

附图说明

图1：勘探区采样平面矩阵设计图。

图2：微生物培养法获得的丁烷氧化菌评价指标等值线图。

图3：常规微生物培养法鉴定的三个微生物培养异常区。

具体实施方式

以下结合具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。

实施例

针对一个陆域勘探新区。主要的地质任务：在前期地质勘探的基础上，对识别出的有利圈闭应用微生物油气勘探技术进行含油气性评价，优选勘探目标，充分发挥综合勘探的优势，对勘探目标进行钻前风险评估，为预探井的井位优选和布设，发现油气藏提供可靠依据，并为圈闭勘探后期的评价井部署、油气藏扩展和滚动勘探提供技术支撑。具体的操作步如下：

1.方案设计：本工区以勘探区域地质背景及前期研究成果为基础，针对勘探现状中存在的问题和难点进行技术服务方案定制。本工区为圈闭勘探，根据识别出的不同层位的圈闭设计样点间距，确定的网格密度为200-500m×100-250m。采样点195个。平面矩阵设计图如图1所示。

2.根据设计方案，测绘人员计算出各个站点的坐标。

3.根据勘探区域的地表特征及人类活动情况，确定样品的采集深度。确定的采样深度40cm。

4.根据需要检测的指标确定样品的采集量。确定的采样量为10g。

5.根据需要检测的指标确定样品的保存和运输方式，将样品-20℃保存，冷藏运输。

6.用常规微生物细胞培养法通过贫营养的培养基检测丁烷氧化菌的总量，得出丁烷氧化菌的评价指标。具体而言，先采用以丁烷为唯一碳源的液体培养基进行富集，再以丁醇为唯一碳源的固体平板通过平板稀释法检测样本中丁烷氧化菌的含量。具体数据见表1。

以丁烷为唯一碳源的富集方法如下：在无菌操作台上称取1g土壤样品置于盛有50ml液体培养基的150ml三角瓶中，向培养基液面以下充入丁烷气使培养液中丁烷气达到饱和，并使三角瓶中的气体空间充满丁烷气，封口，180rpm28℃震荡培养7d。

以丁醇为唯一碳源的固体平板中含有5％的丁醇作为碳源。

所述贫营养的培养基中包括k2hpo41.75g，kh2po40.96g，nano32.0g，mgcl20.1g，(nh4)2so40.1g，微量元素0.2ml，ph为7.2；其中每升微量元素中含有cacl25.54g，zncl25.3g，mncl25.06g，feso44.99g，(nh4)6mo7o241.10g，cuso41.57g，cocl21.61g。

7.将获得的丁烷氧化菌的评价指标与采样点坐标绘在地质图上，并用地质软件绘制成等值线，初步判别微生物异常。见图2。

8.在常规微生物培养方法中识别出了三个异常区，分别为ⅰ号异常区，ⅱ号异常区，ⅲ号异常区。见图3。

9.在ⅰ号异常区，ⅱ号异常区，ⅲ号异常区的样品进行荧光定量pcr检测，对烃氧化菌的绝对数量进行精确定量。

检索genbank数据库中各低级烃氧化菌中低级烷氧化酶基因序列，进行多重比对，针对保守区序列设计荧光定量pcr引物，采用sybrgreeni荧光染料进行定量。设计并合成的引物序列如下：

p1：5’-ggngactgggacttctgg-3’

p2:5’-ccggmgcaacgtcyttacc-3’

对于ⅰ号异常区内异常点14个，ⅱ号异常区异常点19个，ⅲ号异常区异常点7个，共对40个样品进行荧光定量pcr检测。数据表见表2。

10.结合微生物，地球物理和石油地质等资料，多学科、多领域的技术研究表明，三个异常区的微生物异常评级为ⅰ号异常区>ⅱ号异常区>ⅲ号异常区。

这种综合评价方法，能够实现微生物异常构造的高分辨率微生物勘探评价，为圈闭优选和井位建议提供有效支撑。

表1：平面矩阵中各点位的丁烷氧化菌评价指标

表2：三个异常区内各点位分子定量检测结果

上述说明并非对本发明的限制，本发明也并不限于上述举例。本技术领域的普通技术人员在本发明的实质范围内，作出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明的保护范围，本发明的保护范围以权利要求书为准。