lncRNA作为生物标志物在肝癌诊疗中的用途的制作方法

本发明属于生物医药领域，涉及lncrna作为生物标志物在肝癌诊疗中的用途，具体的涉及生物标志物loc101927480。

背景技术：

原发性肝癌是世界范围内最常见的恶性肿瘤之一，其发病率居所有癌症的第六位，死亡率居所有癌症的第二位。根据病理分型，原发性肝癌可分为肝细胞癌(hepatocellularcarcinoma，hcc)、肝内胆管细胞癌、肝细胞癌-肝内胆管细胞癌混合型等不同类型。原发性肝癌中超过90％为肝细胞癌。肝癌的发生是一个多步骤、复杂的过程，多是在肝脏既有慢性炎症及其改变了的肝脏微环境基础上，众多癌基因或抑癌基因发生突变，特别是其表达逐渐发生改变，最终诱发肝癌的发生。由于在肝癌的早期，患者多没有典型临床症状和体征，临床上难以发现，而一旦出现典型症状，多已是中、晚期肝癌，此时往往伴随着肝癌的肝内外转移，由于肝癌细胞对化疗的不敏感性，目前对全身播散的肝癌细胞尚无有效治疗方法。随着现代细胞分子生物学的进展，现已证明肝癌的形成多伴随一系列分子及信号通路的异常。因此，从分子水平探索肝癌发生发展的机制，并将特征性分子作为抗肿瘤靶点，可为临床预防和治疗肝癌开辟新的途径。

随着高通量测序技术的发展，对肝癌全基因组及转录组测序的结果表明肝癌具有显著的分子特征异质性，如有些肝癌样本中只存在少至5个基因的突变，也有些肝癌样本中存在多至121个基因的突变，但是肝癌中尚没有发现普遍存在的的基因突变。因此基因的表达调控，特别是表观遗传修饰，如dna甲基化、组蛋白修饰及非编码rna表达的异常，对肝癌中众多差异表达基因的调控作用值得深入探讨。

长链非编码rna(longnoncodingrna,1ncrna)是一类转录本长度超过200nt的，不具有蛋白质编码能力的rna分子。相对于蛋白编码序列及microrna，lncrna的研究还处于起步阶段，其功能有待进一步阐明。最近有研究表明在许多病理情况下，包括肿瘤中，lncrnas的表达水平发生改变，并且在生理及病理情况下lncrnas可有多种功能，如调节细胞增殖、凋亡、细胞周期、细胞迁移等。lncrnas参与基因组印记、染色质修饰、转录调控、mrna稳定性、蛋白质翻译调节、microrna功能调节、蛋白质功能调节等多种重要的信号转导调控过程。因此研究lncrna在肝癌中的作用，对于揭示肝癌发病的分子机制以及肝癌的治疗具有重要的意义。

技术实现要素：

为了弥补现有技术的不足，本发明的目的之一，提供一种诊断早期肝癌的产品，使患者在早期就得以治疗，进而提高生存率和生活质量。

本发明的目的之二，提供一种治疗手段和药物组合物，实现肝癌的精准分子治疗。

本发明的目的之三，提供一种筛选预防或治疗肝癌潜在物质的方法。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明提供了检测loc101927480的试剂在制备诊断肝癌的产品中的应用。所述试剂包括rt-pcr、实时定量pcr、原位杂交、northernblotting、芯片或高通量测序平台检测loc101927480表达水平用试剂。

进一步，所述试剂选自：

特异性识别loc101927480的探针；或

特异性扩增loc101927480的引物。

进一步，所述特异性扩增loc101927480的引物序列如seqidno.2和seqidno.3所示。

本发明提供了一种诊断肝癌的产品，所述产品所述产品包括检测样本中loc101927480表达水平的试剂。所述“样本”包括(但不限于)细胞、组织、脏器、体液(血液、淋巴液等)、消化液、咳痰、肺胞支气管清洗液、尿、粪便等。优选的，所述样本为组织、血液。

进一步，所述产品包括芯片、制剂或试剂盒；其中，所述芯片包括固相载体以及固定在固相载体的寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针包括用于检测loc101927480转录水平的针对loc101927480的寡核苷酸探针；所述试剂盒包括用于检测loc101927480转录水平的引物或芯片。

固相载体可采用基因芯片领域的各种常用材料，例如但不限于尼龙膜，经活性基团(如醛基、氨基等)修饰的玻片或硅片、未修饰的玻片、塑料片等。

“探针”指能与另一分子的特定序列或亚序列或其它部分结合的分子。除非另有指出，术语“探针”通常指能通过互补碱基配对与另一多核苷酸(往往称为“靶多核苷酸”)结合的多核苷酸探针。根据杂交条件的严谨性，探针能和与该探针缺乏完全序列互补性的靶多核苷酸结合。探针可作直接或间接的标记，其范围包括引物。杂交方式，包括，但不限于：溶液相、固相、混合相或原位杂交测定法。

所述探针具有与靶点基因的特定的碱基序列互补的碱基序列。这里，所谓“互补”，只要是杂交即可，可以不是完全互补。这些多核苷酸通常相对于该特定的碱基序列具有80％以上、优选90％以上、更优选95％以上、特别优选100％的同源性。这些探针可以是dna，也可以是rna，另外，可以为在其一部分或全部中核苷酸通过pna(polyamidenucleicacid，肽核酸)、lna(注册商标，lockednucleicacid，bridgednucleicacid，交联化核酸)、ena(注册商标，2′-o,4′-c-ethylene-bridgednucleicacids)、gna(glycerolnucleicacid，甘油核酸)、tna(threosenucleicacid，苏糖核酸)等人工核酸置换得到的多核苷酸。

本发明中基因检测试剂盒或基因芯片可用于检测包括loc101927480基因在内的多个基因(例如，与肝癌相关的多个基因)的表达水平，将肝癌的多个标志物同时进行检测，可大大提高肝癌诊断的准确率。

本发明提供了loc101927480在筛选预防或治疗肝癌潜在物质中的应用。

进一步，使用loc101927480筛选预防或治疗肝癌潜在物质的方法包括：

用候选物质处理表达或含有loc101927480基因的体系；和

检测所述体系中loc101927480基因的表达；

其中，若所述候选物质可降低loc101927480基因的表达水平(优选显著降低，如低20％以上，较佳的低50％以上；更佳的低80％以上)，则表明该候选物质是预防或治疗肝癌的潜在物质。所述体系选自：细胞体系、亚细胞体系、溶液体系、组织体系、器官体系或动物体系。

所述候选物质包括(但不限于)：针对loc101927480基因或其上游或下游基因设计的干扰分子、核酸抑制物、小分子化合物等。

本发明提供了loc101927480在制备治疗肝癌的药物组合物中的应用。

进一步，所述药物组合物包括loc101927480功能性表达的抑制剂，所述抑制剂能够抑制loc101927480或涉及loc101927480上游或下游途径的物质的表达。

进一步，所述抑制剂是针对loc101927480的sirna。

在本发明中，sirna可以包括部分纯化的rna、相当纯的rna、合成的rna、或重组产生的rna、以及通过添加、删除、替换和/或改变一个或多个核苷酸而与天然存在的rna不同的经改变了的rna。这样的改变可以包括添加非核苷酸材料至例如sirna的末端(一个或多个)或至sirna的一个或多个内部核苷酸，包括使sirna抵抗核酸酶消化的修饰。

本发明在筛选有效的sirna序列时，通过大量的比对分析，从而找出最佳的有效片段。在本发明的具体实施方式中，本发明人设计合成了多种sirna序列，并将它们分别通过转染试剂转染肝癌细胞系进行验证，结果检测出干扰效果较好的干扰分子，它们分别具有seqidno.6、seqidno.7所示的序列，进一步地在细胞水平实验，结果证明对于细胞实验而言抑制效率非常高。

本发明的核酸抑制物如sirna可以化学合成，也可以通过一个重组核酸结构里的表达盒转录成单链rna之后进行制备。sirna等核酸抑制物，可通过采用适当的转染试剂被输送到细胞内，或还可采用本领域已知的多种技术被输送到细胞内。

本发明提供了一种治疗肝癌的药物组合物，所述药物组合物包括loc101927480功能性表达的抑制剂，所述抑制剂可以在dna水平或rna(即基因产物)水平上起作用。

进一步，所述药物组合物还包括与loc101927480功能性表达的抑制剂配伍的其他药类以及药学上可接受的载体和/或辅料。

进一步，所述载体包括(但并不限于)：稀释剂、赋形剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、致湿剂、吸附载体、润滑剂等。

在本发明中，药物组合物可以使用不同的添加剂进行制备，例如缓冲剂、稳定剂、抑菌剂、等渗剂、螯合剂、ph控制剂。

本发明的药物还可包括药学上可接受的涂层材料包括(但不限于)，快速分解涂层材料、染色剂、肠溶性聚合物、增塑剂、水溶性聚合物、水不溶性聚合物、染料、色素、其他崩散剂。常见快速分解涂层材料包括opadry；肠溶性聚合物包括甲基内烯酸聚合物、磷羟丙甲基纤维素苯二甲酸酯、羟丙甲基纤维素乙酸酯、羟丙甲基纤维素琥珀酸酯、羟甲乙基纤维素、乙酰磷苯二甲酸纤维素；增塑剂包括聚乙二醇(peg)、丙二醇等。

本发明所述的药物组合物可口服给药、非胃肠道给药、通过吸入喷雾给药、局部给药、直肠给药、鼻给药、颊给药、阴道给药或通过植入的贮药装置给药。优选口服给药或注射给药。

本发明的药物组合物可含有任何常用的无毒可药用载体、辅料或赋形剂。在某些情况下，药用酸、碱或缓冲剂可用来调节制剂的ph以提高所配制的化合物或其给药剂型的稳定性。本文所用术语非胃肠道包括皮下、皮内、静脉内、肌内、关节内、动脉内、滑膜内、胸骨内、鞠内、损伤部位内、和颅内注射或输注技术。只要能达到目标组织，本发明所述药物组合物可以通过任何途径给予受体。

本发明药物组合物可以以任何口服剂型的形式口服给药，包括但不限于胶囊、片剂、乳剂和水悬浮液、分散剂和溶液。对于口服片剂，常用载体包括乳糖和玉米淀粉。一般还加入润滑剂例如硬脂酸镁。为了以胶囊形式口服给药，适用的稀释剂包括乳糖和无水玉米淀粉。当口服施用水悬浮液和/或乳液时，可将活性组分悬浮或溶解在油相中，并与乳化剂和/或悬浮剂合并。如果需要的话，可加入一些甜味剂和/或矫味剂和/或着色剂。适当时，可将用于口服给药的剂量单位制剂包微囊。例如，通过在聚合物、蜡等中将颗粒物质包衣或包埋，也可制备所述制剂已延长或维持释放。本发明的药物组合物可以用于降低内源性的loc101927480过表达，通过降低loc101927480的表达，从而治疗因loc101927480表达上调导致的肝癌。

在本发明中，可将抑制loc101927480表达的化合物作为裸rna与递送试剂一起作为核酸(如重组质粒或病毒载体)给受试者施用，所述核酸包含抑制loc101927480表达的序列。递送试剂可以是亲脂试剂、聚阳离子、脂质体等。

本发明的药物还可与其他治疗肝癌的药物联用，其他治疗性化合物可以与主要的活性成分同时给药，甚至在同一组合物中同时给药。还可以以单独的组合物或与主要的活性成分不同的剂量形式单独给予其它治疗性化合物。主要成分的部分剂量可以与其它治疗性化合物同时给药，而其它剂量可以单独给药。在治疗过程中，可以根据症状的严重程度、复发的频率和治疗方案的生理应答，调整本发明药物组合物的剂量。

本发明所述的药物组合物也可以脂质体输送系统形式给药，如小单层囊泡、大单层囊泡和多层囊泡。脂质体可有多种磷脂形成，如胆甾醇、硬脂基胺或磷脂酰胆碱。脂质体可以增加基因产物或核酸的血液半衰期。可从标准的形成小囊泡的脂质(其通常包括中性或带负电荷的磷脂和固醇例如胆固醇)形成用于本发明的合适的脂质体。通常，通过考虑入目的脂质体的大小和血流中直追半衰期等因素，指导脂质的选择。

用于本方法的脂质体可包含将脂质体靶向细胞的配体分子。结合癌细胞中普遍存在的受体的配体例如结合肿瘤细胞抗原的单克隆抗体是优选的。还可对用于本发明的脂质体进行修饰，以避免被单核巨噬细胞系统和网状内皮系统清除。此类修饰的脂质体具有存在于表面上或整合入脂质体结构中的调理作用抑制部分。优选的，脂质体可包含调理作用抑制部分和配体两者。

本发明药物组合物可以局部给药的药物组合物，可以配制成软膏、乳膏剂、混悬剂、洗剂、散剂、溶液剂、糊剂、凝胶剂、喷雾剂、气雾剂或油剂。

本发明的药物组合物可以按药剂学上有效的量进行给药，本发明的用语“药剂学上有效的量”指的是以可适用于医学治疗或预防的合理的受惠/危险比率足以治疗或预防疾病的量，可根据包括疾病的严重程度、药物的活性、患者的年龄、体重、健康、性别、患者对药物的敏感度、所使用的本发明组合物的给药时间、给药途径及排出比率、治疗时间、与所使用的本发明的组合物配合或同时使用的药物的要素及其它医学领域中公知的要素来决定有效用量水平。本发明的药物组合物可作为单独的治疗剂进行给药，或是与其它治疗剂并用地进行给药，可以与以往的治疗剂依次地或同时地进行给药。此外，可单次或多次地进行给药。重要的是，需要对上述要素均加以考虑，并且以无副作用的最少的量可取得最大效果的量进行给药。

本领域技术人员将认识到，本发明的实用性并不局限于对本发明的标志物基因的任何特定变体的基因表达进行定量。作为非限制性的实例，标志物基因可具有seqidno.1指定的cdna序列。

在本发明中，关于loc101927480的“功能性表达”，意指功能性基因产物的转录和/或翻译。对于像loc101927480的非蛋白编码基因，“功能性表达”可以在至少两个水平上失调。第一，在dna水平上，例如通过基因的缺失或破坏，或者是没有转录发生(在两种情况下都阻止相关基因产物的合成)。转录的缺失可以例如由表观遗传的变化(例如dna甲基化)或由功能缺失性突变导致。。如本文中所使用的“功能缺失”或“lof”突变是，相对于赋予蛋白质增强的或新的活性的功能获得性突变而言，阻止、减少或消除基因产物的功能的突变。功能性缺失可由广泛的突变类型引起，包括但不限于整个基因或基因部分的删除、剪接位点突变、由小的插入和删除引起的移码突变、无义突变、取代了必需氨基酸的错义突变、和阻止产物的正确细胞定位的突变。该定义也包括loc101927480基因的启动子或调控区域的突变----如果这些突变干扰了基因的功能。无效突变是完全破坏基因产物功能的lof突变。一个等位基因中的无效突变通常将使表达水平降低50％，但可能对基因产物的功能具有严重影响。值得注意的是，功能性表达也可以因为功能获得性突变而失调：通过赋予蛋白质新的活性，蛋白质的正常功能失调，表达的功能活性蛋白减少。反之亦然，功能性表达可以例如通过基因复制或通过缺乏dna甲基化而增加。功能性表达也可以因为功能获得性突变而失调：通过赋予蛋白质新的活性，蛋白质的正常功能失调，表达的功能活性蛋白减少。反之亦然，功能性表达可以例如通过基因复制或通过缺乏dna甲基化而增加。

第二，在rna水平上，例如通过缺乏有效的翻译—例如因为mrna的不稳定(例如通过utr变体)，可以导致在转录物翻译之前mrna被降解。或者通过缺乏有效的转录，例如因为突变诱导了新的剪接变体。

在本发明中，术语“治疗”是指不以治愈为目的，而是减缓(减少)靶定的病理状况或病症或防止复发。如果接受治疗有效量的治疗剂之后，患者成功地被“治疗”，患者显示出可观测到的和/或可度量的一种或多种特定疾病的迹象和症状的减少或消失。例如，癌细胞数目显著减少或癌细胞消失，减少肿瘤尺寸；抑制(即，在某种程度上减缓，及优选地停止)肿瘤转移；某种程度上抑制肿瘤生长；使在一定程度上减少和/或减轻与特定癌症相关联的一种或多种症状的时间增加；减少的发病率和死亡率，以及改善生活质量。疾病的迹象或症状的减轻能够为患者感知。治疗可以实现完全反应—定义为癌症的所有迹象消失，或部分反应—肿瘤尺寸减小，优选减小的比例超过50％、更优选75％。如果患者感受到疾病稳定，患者也被视为得到治疗。

在本发明的具体实施例中，实验都是按照至少重复3次来完成的，结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，采用spss18.0统计软件来进行统计分析的，两者之间的差异采用t检验，认为当p<0.05时具有统计学意义。

附图说明

图1示利用qpcr检测loc101927480在肝癌患者中的表达情况图；

图2示利用qpcr检测loc101927480在肝癌细胞中的表达情况图；

图3是利用qpcr检测转染sirna对在肝癌细胞中loc101927480的表达影响图；

图4是利用cck8检测loc101927480对细胞增殖的影响图；

图5是loc101927480对细胞的克隆形成集落的影响图。

具体的实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如sambrook等人，分子克隆：实验室手册(newyork:coldspringharborlaboratorypress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1筛选与肝癌相关的基因标志物

1、样品收集

各收集10例肝癌患者的癌组织以及癌旁组织，患者均知情同意，上述所有标本的取得均通过组织伦理委员会的同意。

2、rna样品的制备

利用qiagen的组织rna提取试剂盒进行组织rna的提取，按说明书的具体步骤进行操作。

3、逆转录和标记

用lowrnainputlinearamplificationkit将mrna逆转录成cdna，同时用cy3分别标记实验组和对照组。

4、杂交

基因芯片采用康城生物-humanlncrnaarray，按芯片使用说明书的步骤进行杂交。

5、数据处理

杂交后芯片用agilent扫描仪扫描,分辨率为5μm，扫描仪自动以100％和10％pmt各扫描1次，2次结果agilent软件自动合并。扫描图像数据采用featureextraction进行处理分析，得到的原始数据应用bioconductor程序包进行后续数据处理。最后ratio值为实验组和对照组。差异基因筛选标准：fdr<0.01，abs(log2fc)>1.5。

6、结果

与癌旁组织相比，loc101927480在肝癌组织中的表达水平显著上调。

实施例2qpcr测序验证loc101927480基因的差异表达

1、对loc101927480基因差异表达进行大样本qpcr验证。按照实施例1中的样本收集方式收集肝癌组织和癌旁组织样本各60例。

2、rna提取步骤同实施例1。

3、逆转录：

采用25μl反应体系，每个样品取1μg总rna作为模板rna，在pcr管中分别加入以下组分：depc水，5×逆转录缓冲液，10mmdntp，0.1mmdtt，30μmoligodt，200u/μlm-mlv，模板rna。42℃孵育1h，72℃10min，短暂离心。

(3)qpcr扩增检验

引物设计：

loc101927480基因的引物序列为：

正向引物：5’-aatctaggacttacgctctt-3’(seqidno.2)

反向引物：5’-cactgaatggcttgtctg-3’(seqidno.3)

管家基因gapdh的引物序列为：

正向引物：5’-ccgggaaactgtggcgtgatgg-3’(seqidno.4)

反向引物：5’-aggtggaggagtgggtgtcgctgtt-3’(seqidno.5)

采用25μl反应体系，每个样本设置3个平行管，所有扩增反应均重复三次以上以保证结果的可靠性。

配制以下反应体系：sybrgreen聚合酶链式反应体系12.5μl，正反向引物(5μm)各1μl，模板cdna2.0μl，无酶水8.5μl。各项操作均于冰上进行。

扩增程序为：95℃60s，(95℃15s，60℃15s，72℃45s)×35个循环。

以sybrgreen作为荧光标记物，在lightcycler荧光实时定量pcr仪上进行pcr反应，通过融解曲线分析和电泳确定目的条带，δδct法进行相对定量。

3、结果

结果如图1所示，与癌旁组织相比，loc101927480基因在肝癌组织中表达上调，差异具有统计学意义(p<0.05)，同rna-sep结果一致。

实施例3loc101927480基因在肝癌细胞系中的差异表达

1、细胞培养

人肝癌细胞株hepg2、huh7和正常肝细胞系hl-7702，以含10％胎牛血清和1％p/s的培养基dmem在37℃、5％co2、相对湿度为90％的培养箱中培养。2-3天换液1次，使用0.25％含edta的胰蛋白酶常规消化传代。

2、rna的提取

1)当细胞达80-90％融合时终止培养，0.25％胰蛋白酶消化收集细胞于1.5m1ep管中，每管中加入lm1trizol缓慢摇动破碎细胞，冰上放置10min。

2)去蛋白，去dna：每个1.5m1ep管加入0.2ml三氯甲烷，摇晃15s，室温放置10min。4℃，12000rpm离心15min。

剩余操作步骤同组织中rna提取过程。

3、逆转录

具体步骤同实施例2.

4、结果

结果如图2所示，与正常肝细胞系相比，loc101927480基因在肝癌细胞hepg2、huh7中表达均上调，差异具有统计学意义(p<0.05)，同rna-sep结果一致。

实施例4loc101927480基因的沉默

1、细胞培养

人肝癌细胞株hepg2，以含10％胎牛血清和1％p/s的培养基dmem在37℃、5％co2、相对湿度为90％的培养箱中培养。2-3天换液1次，使用0.25％含edta的胰蛋白酶常规消化传代。

2、sirna设计

针对loc101927480基因的sirna序列：

阴性对照sirna序列(sirna-nc)：

正义链为5’-uucuccgaacgugucacgu-3’(seqidno.6)，

反义链为5’-acgugacacguucggagaa-3’(seqidno.7)；

sirna1：

正义链为5’-auguugauggcguguauggua-3’(seqidno.8)，

反义链为5’-ccauacacgccaucaacauuu-3’(seqidno.9)；

sirna2：

正义链为5’-aauauccuaucuacaagagac-3’(seqidno.10)，

反义链为5’-cucuuguagauaggauauuuu-3’(seqidno.11)；

sirna3：

正义链为5’-aguaguacauuucaaagaguc-3’(seqidno.12)，

反义链为5’-cucuuugaaauguacuacuuc-3’(seqidno.13)

将细胞按2×10⁵/孔接种到六孔细胞培养板中，在37℃、5％co2培养箱中细胞培养24h；

在无双抗、含10％fbs的dmem培养基中，转染按照脂质体转染试剂2000(购自于invitrogen公司)的说明书转染。

实验分为空白对照组(hepg2)阴性对照组(sirna-nc)和实验组(20nm)(sirna1、sirna2、sirna3)，其中阴性对照组的sirna与loc101927480基因的序列无同源性，浓度为20nm/孔，同时分别进行转染。

3、qpcr检测loc101927480基因的表达水平

3.1细胞总rna的提取

具体步骤同实施例3。

3.2逆转录步骤同实施例2。

3.3qpcr扩增步骤同实施例2。

4、统计学方法

实验都是按照重复3次来完成的，结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，采用spss18.0统计软件来进行统计分析的，干扰loc101927480基因表达组与对照组之间的差异采用t检验，认为当p<0.05时具有统计学意义。

5、结果

结果如图3显示，相比hepg2、转染空载sirna-nc、sirna2、sirna3组，sirna1组能够显著降低loc101927480的表达，差异具有统计学意义(p<0.05)。

实施例5cck8检测细胞增殖实验

1、细胞培养与转染步骤同实施例4

2、cck8检测细胞增殖

1)将对数增殖期的hepg2细胞接种于96孔板，每孔2×10³个细胞；

2)实验分三组，分别是空白对照组、转染sirna-nc组和转染sirna2-loc101927480，每组设6个复孔；

3)分别在转染24h、48h、72h后加入10μl/孔cck8试剂；

4)2h后使用酶标仪检测a450的吸光值。

3、结果

结果如图4所示：空白对照组同空载组无明显差异，而转染sirna1组的细胞生长速度明显低对照组的细胞生长速度，差异具有统计学意义(p<0.05)，上述结果表明loc101927480的表达能够促进肝癌细胞的生长。

实施例6软琼脂克隆形成实验

1、用0.25％胰蛋白酶消化处于对数生长期的细胞，轻轻吹打使之成为单细胞悬液，离心收集细胞沉淀。

2、用含20％胎牛血清的dmem完全培养基重悬，适当稀释后计数，调整细胞浓度为5×10³个/ml。

3、制备两个浓度分别为1.2％和0.7％的低溶点琼脂糖液，高压灭菌后，维持在40℃水浴中。

4、1.2％的琼脂糖和2×dmem培养基1:1混合，加入2×抗生素和20％的小牛血清，取3ml混合液注入直径6cm平皿中放置5min冷却凝固，作为底层琼脂置于co2温箱中备用。

5、在无菌试管中1:1混合0.7％的琼脂糖和2×dmem培养基，再向管中加入0.2ml浓度为5×10³个/ml的稳定感染细胞悬液，充分混匀，注入上述平皿中，逐渐形成双琼脂层，每个实验组重复4个样本。

6、待上层琼脂凝固后，置入37℃、5％co2温箱中培养，每3天加培养基1.5ml。

7、培养14天后取出培养皿，用1ml浓度为0.005％的龙胆紫染色90min。把平皿放置在倒置显微镜下观察，每组细胞随机选取10个低倍视野，镜下技术形成的细胞克隆数。

8、结果

结果如图5所示，与对照组相比，转染sirna1的细胞组单细胞克隆集落形成数显著降低。

上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

sequencelisting

<110>王冬国

<120>lncrna作为生物标志物在肝癌诊疗中的用途

<160>13

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>418

<212>dna

<213>人源

<400>1

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accatacacgccatcaacatttaggacagtatgacaaaggagaatgaaagctgtctcttg120

tagataggatattttcagccgtcatcaccatggactctttgaaatgtactacttcagaaa180

agccacagtgactccctctgggcctcacccacctgagatgacatcacgacgcaaatctag240

gacttacgctcttcatacggatggaatggttggttcacttggctttcagagtgcagacaa300

gccattcagtggagggcatgcctcagcctgcactcttctgactcatgacatgacttctcc360

atggagagccaggatttttctcaagtgtaacaatattaattatcaagtcactttaaaa418

<210>2

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>2

aatctaggacttacgctctt20

<210>3

<211>18

<212>dna

<213>人工序列

<400>3

cactgaatggcttgtctg18

<210>4

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<400>4

ccgggaaactgtggcgtgatgg22

<210>5

<211>25

<212>dna

<213>人工序列

<400>5

aggtggaggagtgggtgtcgctgtt25

<210>6

<211>19

<212>rna

<213>人工序列

<400>6

uucuccgaacgugucacgu19

<210>7

<211>19

<212>rna

<213>人工序列

<400>7

acgugacacguucggagaa19

<210>8

<211>21

<212>rna

<213>人工序列

<400>8

auguugauggcguguauggua21

<210>9

<211>21

<212>rna

<213>人工序列

<400>9

ccauacacgccaucaacauuu21

<210>10

<211>21

<212>rna

<213>人工序列

<400>10

aauauccuaucuacaagagac21

<210>11

<211>21

<212>rna

<213>人工序列

<400>11

cucuuguagauaggauauuuu21

<210>12

<211>21

<212>rna

<213>人工序列

<400>12

aguaguacauuucaaagaguc21

<210>13

<211>21

<212>rna

<213>人工序列

<400>13

cucuuugaaauguacuacuuc21