LncRNAGENENO.9的应用以及膀胱癌的诊断剂和治疗药剂的制作方法

本发明涉及肿瘤分子标志物和治疗靶点，更特别的，涉及lncrnageneno.9在诊断和治疗膀胱癌中的应用，以及根据lncrnageneno.9制备诊断剂和治疗剂。

背景技术：

研究表明，非编码rna(noncodingrnas，ncrnas)占据人类基因组主体，根据长度，小于200bp的称为smallncrnas，超过200bp的称为长链非编码rna(longnon-codingrna，lncrna)。目前，科研工作者已经将smallncrna的研究涉及到各个领域，但是对lncrna了解却不多。

有研究表明，一些lcnrna在基因组起到重要的表观遗传调控作用，在肿瘤中的发生、发展和转移中具有重要作用。h19作为最先被关注的lncrna，被发现与多种泌尿系统肿瘤的发生发展密切相关。h19与igf2(胰岛素样生长因子2，insulin-likegrowthfactor2)编码基因并共用同一个增强子，所以在同一个染色体上了这两个基因不能同时被表达。正常细胞中，父源的h19被甲基化，无法被转录调节器ctcf识别，igf2被表达翻译；母源性的h19基因没有被甲基化，ctcf识别h19并进行转录，igf2不能转录。在病理学发展进程中，一些细胞的母源h19也被甲基化，导致igf2过量表达，引起组织细胞异常增生，这便是肾胚细胞瘤(wilmstumours)成因之一。此外，双等位基因h19甲基化伴随igf2双等位基因异常表达在老龄男性中也是前列腺癌变易感因素之一。h19双等位基因甲基化水平降低引起的h19异常高表达，还参与并调控膀胱癌的多种生物代谢过程。

膀胱癌是世界第九大肿瘤，其中尿路上皮癌占90％。近年来，膀胱癌的早期诊断和外科手术治疗技术日益精进，但该病死亡率仍居高不下。对于无肌肉浸润的膀胱癌，经典的外科手术和膀胱内化疗是最主流的治疗方法，但是高复发率依然是这类膀胱癌治疗的难点。浸润性膀胱癌患者预后很差，五年生存率小于50％，而对于转移性膀胱癌即使进行积极的综合治疗，生存中位数也只有10个月。

因此，需要一种新的诊断标志物和治疗剂。

技术实现要素：

geneno.9(也称cancersusceptibilitycandidate9，casc9)的转录产物首次发现于食管癌中，曾用名esccal-1、linc00981。该基因可检测到三个转录本，长度为1300-1500bp，序列分别如seqidno：1、2和3所示，这三个转录本均未编码蛋白质，因此为lncrna。

发明人在对膀胱癌的研究过程中发现，73.7％肿瘤样本中geneno.9的表达量高于癌旁正常组织。并且，在随后的实验中还发现，敲低geneno.9的表达后，膀胱癌细胞的迁移和侵袭受到抑制。

基于以上发现，本发明提供了lncrnageneno.9在制备膀胱癌诊断剂中的应用，所述lncrnageneno.9的序列如seqidno:1、2或3所示。

本发明还提供了lncrnageneno.9在制备膀胱癌治疗药剂中的应用，所述lncrnageneno.9的序列如seqidno:1、2或3所示。

本发明还提供了一种用于检测膀胱癌的诊断试剂盒，其包括检测lncrnageneno.9表达量的试剂。

在一个实施方案中，所述检测lncrnageneno.9表达量的试剂为检测lncrnageneno.9表达量的rt-pcr试剂、northern检测试剂或rna检测探针。

在一个实施方案中，所述检测lncrnageneno.9表达量的试剂为rt-pcr试剂，包括序列如seqidno:4所示的正向扩增引物，以及序列如seqidno:5所示反向扩增引物。

在一个实施方案中，所述诊断试剂盒还包括rna提取试剂。

在一个实施方案中，所述诊断试剂盒还包括正常膀胱组织样品作为阴性对照和已经被鉴定为高表达lncrnageneno.9的膀胱癌组织样品作为阳性对照。

本发明还提供了一种用于治疗膀胱癌的药剂，其包含抑制癌细胞中的lncrnageneno.9表达量的活性成分。

在一个优选实施方案中，所述抑制癌细胞中的lncrnageneno.9表达量的活性成分为抑制lncrnageneno.9表达的sirna，所述sirna的序列如seqidno:6、7或8所示。

对于患有膀胱肿瘤的患者，可使用本发明的提供的检测试剂检测肿瘤组织的lncrnageneno.9表达量，当检测发现lncrnageneno.9表达量显著高于肿瘤旁边的正常膀胱组织或试剂盒中提供的正常膀胱组织时，可作为判定其为恶性组织的依据以及治疗靶点选择依据。然后可施用lncrnageneno.9表达抑制剂，例如本发明提供的sirna来进行治疗。

附图说明

图1为38例膀胱癌组织样本中lncrnageneno.9表达量的统计图；

图2为显示膀胱癌组织和正常膀胱组织样本中lncrnageneno.9表达量的分布的散点图；

图3为显示膀胱癌组织和正常膀胱组织样本中lncrnageneno.9表达量平均数和标准偏差的柱状图；

图4为lncrnageneno.9在转化细胞系sv-huc1细胞和肿瘤细胞系(t24、tccsup、umuc3、j82和5637)中的表达量统计图；

图5为向5637中分别转入3中sirna后lncrnageneno.9的表达量统计图，*，p<0.05；**，p<0.01；***，p<0.001；

图6为向j82中分别转入3中sirna后lncrnageneno.9的表达量统计图，*，p<0.05；**，p<0.01；***，p<0.001；

图7为5637的划痕实验照片；

图8为根据图7的实验照片计算的5637的相对迁移能力；

图9为j82的划痕实验照片；

图10为根据图9的实验照片计算的j82的相对迁移能力；

图11为5637和j82的穿井实验照片；

图12为根据图11的实验照片计算的5637的相对迁移能力；

图13为根据图11的实验照片计算的j82的相对迁移能力；

图14为5637培养0-72小时的生长曲线；

图15为j82培养0-72小时的生长曲线。

具体实施方式

以下结合实例对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。

1.38例膀胱癌组织样本中的lncrnageneno.9表达量检测

1.1rna提取

①裂解：对于细胞样品，当细胞长满培养板的60-70％时弃上清，pbs洗两遍，加入trizol(ambion，life公司，货号15596026)，六孔板每孔加1ml；对于组织样品，采用液氮研磨，加入适量加入trizol；

②按比例每毫升trizol加入200μl的氯仿，上下用力混匀，静置5min，4℃10000g离心15min。取上层澄清液体400μl，加入等体积异丙醇混匀后室温放置5min，再次离心(4℃，10000g)；

③弃上清，75％乙醇重悬，再次离心弃上清，重复一次。

④弃乙醇溶液后放在通风柜橱干燥，加入适量的depc水溶解rna，测定浓度。

1.2rna反转录

根据公司rtregentkitwithgdnaeraser(rr047a)说明书操作

1.3rt-qpcr

总反应体系20μl：2×sybrgreenpcrmastermix(taraka公司)10μl，引物1.6μl，cdna1μl，双氧水7.4μl；

引物序列为：

esscal1-f：5’-ccagacagcagcaaagcaat-3’(seqidno:4)

esscal1-r：5’-ggaagcagcaaatgtgtccat-3’(seqidno:5)

该对引物扩增的序列是lncrnageneno.9的三个转录本的共有序列。使用lightcycler480荧光定量pcr仪进行扩增反应，程序设定如下：95℃2min；95℃10s，60℃10s，72℃10s，40循环；72℃5min；

结果如图1所示，38例确诊为膀胱癌组织样本中，有73.7％的肿瘤组织发生了lncrnageneno.9高表达，图2和3显示，lncrnageneno.9的表达量显著高于正常的膀胱组织(p＜0.05)，因此可认为，lncrnageneno.9可作为膀胱癌的诊断标志物之一。

2.膀胱癌细胞系中的lncrnageneno.9表达量检测

采用上文的方法，对五种膀胱上皮癌细胞系t24、tccsup、umuc3、j82和5637中的lncrnageneno.9表达量进行检测，并与移形上皮转化细胞系sv-huc1中的表达量进行比较。

结果如图4所示，五种膀胱癌细胞系中lncrnageneno.9表达量均高于移形上皮转化细胞系sv-huc1，尤其是umuc3、j82和5637中，lncrnageneno.9表达量是sv-huc1的30倍以上，在5637甚至高达80倍。

3.lncrnageneno.9的敲低

根据上文的实验结果，选择j82和5637细胞系用来做lncrnageneno.9的敲低实验，并检测敲低后的相关基因表达和细胞迁移能力。

3.1lncrnageneno.9的敲低

lncrnageneno.9的敲低使用sirna的方法来实现，具体方法如下：六孔板铺上细胞，第二天长满培养板50％时，用opti-mem(gibco，life公司，货号31985-070)饥饿30min；

取2.5nmolsirna/nc用125μldepc水溶解，每个孔的取量为10μl。取两个管标号a、b，每管加入100μlopti-mem；a管加入10μllipofectamine3000(life公司)，b管中加入sirna或者nc10μl，分别混匀室温静置5min。将ab两管充分混匀，静置15min加入到六孔板中，转染6-8h。

发明人在研究中使用了三种sirna，序列如下：

5’-caacuggauuccaacuuuauu-3’

sirna-1：3’-uuguugaccuaagguugaaau-5’(核心序列为caacuggauuccaacuuua，seqidno：6)

5’-caagaaguuuaguaaaccauu-3’

sirna-2：3’-uuguucuucaaaucauuugg-5’(核心序列为caagaaguuuaguaaacca，seqidno：7)

5’-gagaucauuaagcccagaauu-3’

sirna-3：3’-uucucuaguaauucggguc-5’(核心序列为gagaucauuaagcccag，seqidno：8)

这三种sirna均与lncrnageneno.9的三个转录本的序列具有同源性。

图5和6显示，将以上三种sirna分别转入j82和5637细胞系后，两种细胞系中的lncrnageneno.9表达量均发生降低。

3.2肿瘤细胞的迁移能力测试

对肿瘤细胞进行划痕实验(图7-10)和穿井实验(图11-13)。

划痕实验的具体方法如下：转染后的细胞长满培养板80-90％，用合适大小的枪头划出两条垂直的划痕。无血清培养液培养，观察24h、48h、72h后划痕的愈合情况(细胞向中间迁移情况)；

穿井实验的具体方法如下：转染后的细胞稳定培养，以胰酶酰化，将不同转染组的细胞按10000-20000个细胞/小室加入小室(corningincorporatedtranswell(ref：3422，8.0μm))中。小室中使用无血清培养液，小室所在的24孔板的各孔中加入完全培养基，32-48h后以4％多聚甲醛固定15min。采用结晶紫染色法观察小室底部由小室内穿过来的细胞数(显微镜leicaomirbolympusdp70)。

结果如图所示，与未被敲低的肿瘤细胞相比，转入了sirna的j82和5637细胞迁移能力降低。

3.3肿瘤细胞的增殖能力测试

对敲低后的肿瘤细胞进行增殖能力测试，方法如下：细胞转染后立即消化下来，铺在96孔板中，每孔加入4000细胞，分别在0h、24h、48h和72h时加入cck-8试剂(货号c-60050，useverbrightinc)，孵育1h后酶标仪(波长为630nm及450nm)检测吸光度。

结果如图14和15所示，肿瘤细胞的增殖能力显著降低。

由上述实验结果显示，lncrnageneno.9的表达抑制剂可有效抑制高表达该非编码rna的膀胱癌细胞的迁移和增殖，从而可作为这类膀胱癌的治疗剂或辅助治疗剂。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110>深圳市龙华区人民医院

<120>lncrnageneno.9的应用以及膀胱癌的诊断剂和治疗药剂

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