诊断膀胱癌的方法

专利名称：：诊断膀胱癌的方法
技术领域：
：本发明涉及^r测和诊断膀胱癌的方法以及治疗和预防膀胱癌和膀胱癌转移的方法。本发明还涉及与膀胱癌相关的基因和多肽。
背景技术：
：膀胱癌是人类群体中第二常见的泌尿生殖器肿瘤，全世界每年约有261,000例的新发病例。这其中约有1/3很可能在诊断时已成为侵入性疾病或转移性疾病(ParkinDM,e,"/.,(1999)CACancerJClin;49:33-64)(非专利文献1)。虽然对于那些仅发生肌肉侵入性膀胱癌的患者的治疗，根治性膀胱切除术被视为"黄金标准"，然而这些患者中约有50%在接受膀胱切除术后2年出现转移，并随后死于该疾病(SternbergCN.,(1995)AnnOncol;6:113-26)(非专利文献2)。为了治疗微小转移和改善更大的新生物的可切除性，对于肌肉侵入性膀胱癌通常采取新辅助化疗(neoadjuvantchemotherapy)的方法(FaggSL，a/.,(1984)BrJUrol;56:296-300,RaghavanD,a/.,(1984)MedJAust;140:276-8)(非专利文献3和非专利文献4)。首先采取涉及氨曱喋呤、长春碱、多柔比星(doxombicin)和顺铂的治疗方案(M-VAC)然后再进行根治性膀胱切除术，与只进行根治性膀胱切除术相比，这样更可能彻底地除去残余癌，从而改善患有局部进行性膀胱癌患者的存活率((2003)Lancet;361:1927-34,GrossmanHB，"a/.，(2003)NEnglJMed;349:859-66)(非专利文献5和非专利文献6)。在一些临床试验中显示，在实施手术前采用药物延緩肿瘤的进展对于存活具有显著益处(GrossmanHB,"fl/.，(2003)NEnglJMed;349:859-66,SplinterTA,"a/.，(1992)JUrol;147:606-8)(非专利文献6和非专利文献7);而且，对新辅助化疗反应良好的患者可以维持膀胱功能和享受生活品质的改善。然而，尚没有一种方法能够预测每个患者对于M-VAC等化学疗法的反应，一些患者会遭受药物的副作用带来的痛苦而没有获得任何阳性效果的益处，而当患者的健康状况恶化时，常常失去了附加治疗的机会。因此，鉴定适用于膀胱癌患者的新型药物开发中的分子靶标是非常重要的。最近的一些研究证实，通过人类肿瘤中的cDNA微阵列分析产生的基因表达信息可以提供鉴别明确肿瘤分类的分子表型，而这些肿瘤分类采用传统的病理学方法是不容易阐明的(Armstrong,S.A,"a/.,(2002)NatGenet,30:41-47;Golub,T.R,"a/"(1999)Science,腐,531-537;Hofmann,W.K"a/"(2002)Lancet,，,481-486)(非专利文献8、9、10)。进一步，一些研究证实了这种方法对于鉴定新的癌症相关基因的有效性。这样的信息的希望在于改善肿瘤性疾病的临床战略的潜力。
发明内容因此，在本文报道的研究中，本发明人使用在由27,648个转录元件组成的cDNA微阵列上由33例侵入性膀胱癌病例获得的全基因组信息结合肿瘤的;敫光《鼓束显樣i角f"剖(lasermicrobeammicrodissection,LMM)进4亍了確斤分子靶标的鉴定，以获取用于分析的纯的癌细胞群体。这些结果显示这样的信息可最终通向我们的"个性化治疗"目标。以开发新的治疗靶标为目的，为了表征与膀胱癌相关的详细的分子机制，本发明人使用表示27,648个基因的cDNA微阵列结合激光微束显微解剖(LMM)分析了33例癌细胞的基因表达才莫式(gene-expressionprofile)。通过比较来自诊断的膀胱癌的患者的癌细胞与正常人膀胱细胞(用作普遍对照)的表达图式(expressionpattern),鉴定了在膀胱癌细胞中一般上调的(up-regulated)394个基因。这些基因中的288个是可以在功能上表征的(functionallycharacterized)在膀胱癌细胞中上调的基因，但余下的106个基因(包括51个EST)的功能至今不明。此外，鉴定了在膀胱癌细胞中一般下调的1272个基因，其中的1026个是可以在功能上表征的在膀胱癌细胞中下调的基因，而余下的246个基因(包括119个EST)的功能至今不明。代表性的44个上调基因的半定量RT-PCR实验中包含的基因支持我们微阵列分析的结果。因而，可以认为本说明书中的数据提供了寻找候选基因的有用信息，这些候选基因的产物可以作为用于治疗膀胱癌的分子靶标。本发明基于与膀胱癌(BLC)关联的基因表达图式的发现。在本说明书中，膀胱癌中差异性表达的基因统称为"BLC核S交"或"BLC多核苦酸"，对应的由其编码的多肽称为"BLC多肽"或"BLC蛋白质"。通过膀胱癌的表达模式，本发明人鉴定了2个在膀胱癌细胞中显著过表达的特异性基因，并将其分别标示为C2093、B5860N和C6055。此外，本发明人分离了B5860N和C6055基因的新的转录变体(transcriptionalvariant)。进一步证实了用siRNA处理膀胱癌细胞有效地抑制C2093、B5860N和C6055的表达、抑制膀胱癌的细胞/月中瘤生长。这些发现显示C2093、B5860N和C6055在肺瘤细胞生长中起重要作用，因此是用于开发抗癌药的有希望的靶标。C2093的全长mRNA序列包含6319个核苷酸(SEQIDNO:1)，其编码1780个氨基酸的多肽(SEQIDNO:2)。B5860N基因有两个不同的转录变体(图3b),它们分别由12个外显子和11个外显子组成并对应于B5860NV1(SEQIDNO:3、其编码SEQIDNO:4)和B5860NV2(SEQIDNO:5、其编码SEQIDNO:6)。VI的外显子8中存在可替换的变异(altemativevariations),而其余的外显子是两个变体共有的。V2变体没有VI的外显子8，但在最后的外显子内产生相同的终止密码子。B5860NV1和B5860NV2变体的全长cDNA序列分别由5318个核苷酸和4466个核香酸组成。这些变体的ORF在各自的外显子1中开始。V1和V2的转录物最终分别编码812个和528个氨基酸的多肽。因此，本说明书中使用的术语"B5860N"指B5860NV1和B5860NV2的转录物中的任一个或两者。即，在本发明的上下文中，显示B5860N基因可表达为至少两种转录变体。为了进一步确定膀胱癌细胞系和正常人体组织，包括膀胱、心、肺、肝、肾、脑及胰中各变体的表达图式，本发明人进ff了Northern印迹分析(Northernblotanalysis)。结果，发现两种变体均在膀胱癌细胞中高度过表达，而在正常人体组织中其不表达或表达无法检出(图2f、下部)。具体地，V2转录物仅在睾丸中表达。C6055基因有4个不同的剪接变体(图3c),它们由24个、25个、22个和22个外显子组成，对应于MGC34032(GeneBank登录号N0.NMJ52697,SEQIDNO:133，其编码SEQIDNO:134的多肽)、Genbank登录号No.AK128063(SEQIDNO:135,其编码SEQIDNO:136的多肽)、C6055V1(SEQIDNO:129，其编码SEQIDNO:130的多肽)和C6055V2(SEQIDNO:131，其编码SEQIDNO:132的多肽)(图3c)。MGC34032的外显子1、2、3和24存在可替换的变异，其它剩余的外显子是4个转录物共有的。C6055V1和C6055V2转录物中没有MGC34032的外显子1、2和3，但在最后的外显子内产生相同的终止密码子。而且，C6055V1、C6055V2和Genbank登录号No.AK128063转录物具有不同于MGC34032的外显子24。Genbank登录号No.AK128063具有新外显子即外显子4a。具体地，C6055V1和C6055V2转录物的ORF均始于各自的外显子4，这显示C6055V1和C6055V2转录物具有相同的ORF。MGC34032、Genbank登录号No.AK128063、C6055Vl和C6055V2转录物的全长cDNA序列分别由2302、3947、3851和3819个核苷酸组成。MGC34032、Genbank登录号No.AK128063、C6055V1和C6055V2转录物最终分別编码719、587、675和675个氨基酸的多肽。因此，本说明书中使用的术语"C6055s"指MGC34032、Genbank登录号No.AK128063、C6055V1和C6055V2的转录物中的一个或多个。即，在本发明的上下文中，显示C6055基因可表达为至少4种转录变体。为了进一步确定膀胱癌细胞系和正常人体组织，包括膀胱、心、肺、肝、肾、脑及胰中各变体的表达图式，我们进行了Northern印迹分析。结果，约3.9kb的转录物在一些膀胱癌细胞(HT-1376、SW780和RT4)中高度过表达，而在正常人体组织中不表达或表达无法检出(图2g)。而且，7.5kb的转录物仅在HT-1376细胞中特异性表达，但我们尚未鉴定该转录物的完整mRNA序列。此外，当使用这些转录物的共有区作为探针进行Northern印迹分析，仅在正常睾丸中检出对应于MGC34032的2.3kb的转录物(图2h)。因而，本发明人进一步进行了C6055V1基因产物的功能分析。许多抗癌药不仅对癌细胞而且对正常生长的细胞也是有毒的。然而，由于C2093、B5860Ns和C6055s的正常表达限于睾丸，抑制C2093、B5860Ns和C6055s的表达的物质(agent)不会给其它器官造成不良影响，由此可方便地用于膀胱癌的预防和治疗。因而，本发明提供新的转录变体B5860NV1,其可作为膀胱癌诊断标记的候选物，还可作为用于开发膀胱癌诊断的新策略和有效抗癌剂的有希望的潜在靶标。此外，本发明提供由该基因编码的多肽及其产生和使用方法。更具体地说，本发明提供在膀胱癌细胞中表达提高的新的人多肽即B5860NV1或其功能等同物。在优选的实施方案中，B5860NV1多肽包"l舌由SEQIDNO:3的开;j丈阅读框编码的811个氨基酸(SEQIDNO:4)的蛋白质。本发明还提供分离的蛋白质，其由B5860NV1多核苷酸序列的至少一部分或者与SEQIDNO:3所示的序列至少15%、更优选至少25%互补的多核苷酸序列编码，直到这些多核普酸序列编码B5860NV1蛋白质或其功能等同物的程度。这样的多核苷酸的例子是由SEQIDNO:3的序列编码的B5860NV1的简并突变体及等位基因突变体。如本说明书中使用的，分离的基因是指一类多核苷酸，该多核苷酸的结构不与任何天然存在的多核香酸的结构相同，也不与任何跨越3个以上独立基因的天然存在的基因组多核苷酸任何片段的结构相同。因此，该术语包括例如(a)在其天然存在的生物体基因组中具有天然基因组DNA分子基因组DNA中的多核苦酸，使得由此产生的分子不与任何天然存在载体或基因组DNA相同；(c)独立的分子，如cDNA、基因组片段、由聚合酶链式反应(PCR)产生的片段或限制性片段；(d)重组核苷酸序列，其为杂合基因即编码融合多肽的基因的一部分。的多核苷酸。优选地，分离的多核苷酸包含与SEQIDNO:3所示的核苷酸序列具有至少60%同一性的核苷酸序列。更优选地，分离的核酸分子与SEQIDNO:3所示的核普酸序列具有至少65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或以上的同一性。当分离的多核苷酸比参照序列，例如SEQIDNO:3更长或与之等长时，其与参照序列的全长进行比较。而当分离的多核苷酸比参照序列短，例如短于SEQIDNO:3时，其与等长(除去同源性计算所需的任何环)的参照序列片段进行比较。本发明还提供产生蛋白质的方法，该方法通过用编码B5860NV1蛋白质的多核苷酸序列转染或转化宿主细胞，并表达该多核苷酸序列。另外，本发明还提供含有编码B5860NV1蛋白质的核苷酸序列的载体，和携带编码B5860NV1蛋白质的多核苷酸的宿主细胞。这样的载体和宿主细胞可以用于产生B5860NV1蛋白质。本发明还提供特异性识别B5860NV1蛋白质的结合剂(bindingagent)。例如，结合剂可以是针对B5860NV1蛋白质产生的抗体。可选地，结合剂可以是蛋白质的特异性配体或与蛋白质特异性结合的合成多肽(参见例如WO2004/044011)。本发明还提供B5860NV1基因的反义多核香酸(例如反义DNA)、核酶和siRNA(小干扰RNA)。因而，本发明提供通过检测源自患者的生物样品，如组织样品中BLC相关基因的表达水平，来诊断或确定受试者患膀胱癌的素因(predisposition)的方法。术语"BLC相关基因"是指其特征在于表达水平在BLC细胞和正常细胞之间有差别的基因。正常细胞是来源于膀胱组织的细胞。在本发明的上下文中，BLC相关基因是表4-5中列出的基因(即基因BLCNos.1-1666)。与基因的正常对照水平相比，基因表达水平的改变例如上升或下降，表示该受试者患有BLC或处于发生BLC的危险中。在本发明的上下文中，术语"对照水平"是指在对照样品中检出的蛋白质表达水平，其包括正常对照水平和膀胱癌对照水平。对照水平可以是来自单个参照群体的单个表达图式，也可以是来自多个表达图式的值。例如，对照水平可以得自以前检测的细胞的表达图式数据库。"正常对照水平"是指在正常健康个体中、或者在已知未患膀胱癌的个体的群组中检出的基因表达水平。正常个体是没有膀胱癌临床症状的个体。另一方面，"BLC对照水平"是指在患有BLC的人群中发现的BLC相关基因的表达模式。与正常对照水平相比，在受试样品中检出的一个或多个表4中列出的BLC相关基因(即过表达或上调的基因BLCNos.l-394)的表达水平上升，表明(由其获得样品的)受试者患有膀胱癌或处于发生膀胱癌的危险中。相反，与正常对照水平相比，在受试样品中检出的一个或多个表5中列出的BLC相关基因(即低表达(underexpressed)或下调的基因BLCNos.395-1666)的表达水平下降，表明该受试者患有膀胱癌或处于发生膀胱癌的危险中。可选地，可以将样品中一系列BLC相关基因的表达与该系列基因的BLC对照水平相比较。样品表达与BLC对照表达之间的相似性表明(由其获得样品的)受试者患有BLC或处于发生BLC的危险中。根据本发明，当基因的表达与对照水平相比上升或下降至少10%、优选至少25%、更优选50%或以上时，可认为基因表达水平"发生改变"。可选地，当基因的表达与对照水平相比上升或下降至少0.1倍、至少0.2倍、至少1倍、至少2倍、至少5倍、至少10倍或以上时，可认为基因表达水平"上升"或"下降"。可以例如在阵列上检测BLC相关基因探针与源自患者的组织样品的基因转录物之间的杂交，从而确定基因表达。在本发明的上下文中，源自患者的组织样品可以是得自受试者，例如已知或怀疑患有BLC的患者的任何组织。例如，组织可以包含上皮细胞。更具体地，组织可以是来自膀胱导管癌(bladderductalcarcinoma)的上皮细胞。本发明还提供诊断膀胱癌的方法，该方法包括如下步骤在来自受试者的生物样品中测定C2093、B5860Ns或C6055s基因的表达水平，将该基因表达水平与正常样品中的表达水平相比4交，并定义样品中C2093、B5860Ns或C6055s基因的高表达水平表示该受试者患有膀胱癌或处于发生膀胱癌的危险中。本发明还提供BLC参照表达模式，其中包含两个或两个以上表4-5中列出的BLC相关基因的基因表达水平。可选地，BLC参照表达模式可以包含两个或两个以上表4中列出的BLC相关基因或表5中列出的BLC相关基因的表达水平。本发明还提供通过将表达BLC相关基因的受试细胞与受试化合物接触，并测定BLC相关基因的表达水平或其基因产物的活性来鉴定物质的方法，所述物质可抑制或增强BLC相关基因，例如表4-5中列出的BLC相关基因的表达或活性。受试细胞可以是上皮细胞，例如得自膀胱癌的上皮细胞。与上调的BLC相关基因或其基因产物的正常对照水平或活性相比，受试物质能够降低该基因的表达水平或其基因产物活性，则表明受试物质是BLC相关基因的抑制剂，可用于减轻BLC的症状，例如一个或多个表4中列出的BLC相关基因的表达。可选地，如果与下调的BLC相关基因或其基因产物的正常对照水平或活性相比，受试物质能够提高该基因的表达水平或其基因产物活性，则表明受试物质是BLC相关基因表达或功能的增强剂，可用于减轻BLC的症状，例如一个或多个表5中列出的BLC相关基因的低表达。进一步，本发明还提供筛选用于治疗或预防膀胱癌的化合物的方法。该方法包括使C2093、B5860Ns或C6055s多肽与受试化合物相接触；和选择与C2093、B5860Ns或C6055s多肽结合或改变其生物活性的受试化合物。本发明进一步提供筛选用于治疗或预防膀胱癌的化合物的方法。该方法包括使受试化合物与细胞相接触，所述细胞表达C2093、B5860Ns或C6055s多肽，或导入了在报告基因的上游含有C2093、B5860Ns或C6055s的转录调控区的载体；和选4奪抑制C2093、B5860Ns、C6055s多肽或才艮告基因产物的表达水平或活性的受试化合物。本发明还提供试剂盒，其含有与一个或多个BLC核酸或BLC多肽结合的检测试剂。本发明还提供与一个或多个BLC核酸结合的核酸阵列。本发明的治疗方法包括治疗或预防受试者中BLC的方法，该方法包括给受试者施用反义组合物的步骤。在本发明的上下文中，反义组合物能降低特定靶基因的表达。例如，反义组合物可以含有与BLC相关基因序列互补的核苷酸，所述BLC相关基因序列选自表4中列出的上调的BLC相关基因。可选地，本发明的方法可以包括给受试者施用小干护bRNA(siRNA)组合物的步骤。在本发明的上下文中，siRNA组合物可降低选自表4中列出的BLC相关基因的BLC核酸的表达。在另一个方法中，通过给受试者施用核酶组合物来治疗或预防受试者中的BLC。在本发明上下文中，核酸特异性核酶组合物可降低选自表4中列出的BLC相关基因的BLC核酸的表达。因此，在本发明中，表4中列出的BLC相关基因是膀胱癌的优选治疗靶标。其它治疗方法包括给受试者施用化合物，所述化合物可提高一个或多个表5中列出的下调的BLC相关基因的表达，或者提高由一个或多个表5中列出的BLC相关基因编码的多肽的活性。本发明还提供使用本发明提供的药物组合物治疗或预防膀胱癌的方法。而且，本发明提供治疗或预防癌症的方法，该方法包括施用C2093、B5860Ns或C6055s多肽的步骤。可以预期的是通过施用C2093、B5860Ns或C6055s多肽来诱导抗肺瘤免疫。因而，本发明还提供诱导抗肿瘤免疫的方法，该方法包括施用C2093、B5860Ns或C6055s多肽的步骤；本发明同时还4是供用于治疗或预防癌症的药物组合物，该药物组合物包含C2093、B5860Ns或C6055s多肽。本发明还包括疫苗和疫苗接种(vaccination)方法。例如，治疗或预防受试者中BLC的方法可包括给受试者施用疫苗，所述疫苗含有由选自表4中列出的BLC相关基因的核酸编码的多肽或所述多肽的免疫活性片段。在本其诱导的免疫应答与全长蛋白质所诱导的免疫应答相类似的多肽。例如，免疫活性片段的长度应为至少8个残基，并能够刺激免疫细胞，如T细胞或B细胞。可通过4全测细胞增殖、细胞因子(如IL-2)生成(elaboration)或抗体产生来测定免疫细胞刺激。本发明还提供用于治疗或预防膀胱癌的药物组合物。药物组合物例如可以是抗癌剂。药物组合物可包含针对分别在SEQIDNO:1、3、5、129、131、133和135所显示和描述的C2093、B5860Ns或C6055s多核香酸的反义S-寡核苷酸、siRNA或核酶的至少一部分。适合的siRNA以SEQIDNO:21、25或144的序列为靶标。因此，本发明的siRNA包含选自SEQIDNO:21、25或144的核苦酸序列。它们可优选作为根据本发明的用于治疗和预防膀胱癌的靶标。药物组合物还可以包含通过本发明方法选4奪的化合物，所述方法是筛选用于治疗或预防细胞增殖性疾病，如膀胱癌的化合物的方法。药物组合物的作用过程优选抑制癌细胞，如膀胱癌细胞的生长。可将药物组合物施用于哺乳动物，包括人类和家养的哺乳动物。除非另有说明，本文所用的所有技术和科学术语都与本发明所属
技术领域：
中的普通技术人员所常规理解的意思相同。尽管在实施或检验本发明时可使用与本文所述类似或等同的方法和材料，但适当的方法和材料如本i^明书下面的描述。本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其它参考文献都全文并入本文作为参考。在存在沖突的情况下，以包括定义的本说明书为准。另外，本文描述的材料、方法和实施例仅是为了说明而非限制本发明。本说明书记载的方法的一个优势是可以在检出膀胱癌的明显临床症状之前对疾病进行鉴定。在结合附图和实施例以及所附的权利要求书阅读以下的详细说明时，本发明的其它特点和优势将更加显而易见。图la为DNA琼脂糖凝胶照片，显示了使用由扩增RNA制备的cDNA通过半定量RT-PCR考察的代表性的44个基因以及GAPDH的表达情况。开始的10个泳道显示不同膀胱癌患者中的基因表达水平。接下来的2个泳道显示来自正常个体的膀胱的正常转移细胞和本体(bulk)中的基因表达水平。再接下来的4个泳道显示正常人体组织的心、肺、肝和肾中的基因表达水平。图lb和图lc显示来自21名膀胱癌患者的肿瘤细胞(IOOI,1009，1010,1012，1013，1014，1015,1016,1017,1018,1019，1020，1021，1022,1023，1024,2003，2014,3001,5001,5002)(上和中部)、膀胱癌细胞系(HT1197,UMUC3,J82,HT1376,SW780和RT4)(下部)及正常人体组织(正常本体；正常膀胱、TC;显微解剖的转移细胞、心、肺、肝、肾)中的C2093(b)和B5860N(c)。图2显示了膀胱癌细胞系和含有正常膀胱的正常人体组织的Northern印迹分析结果，所述Northern印迹分析使用DNA片段A0576N(a)、C5509(b)、F1653(c)、B9838(d)、C2093(e)、B5860N(f)和C6055(g,h)作为各自的探针。图3显示了(a)C2093、(b)B5860N和(c)C6055的基因组结构。B5860N具有称作VI和V2的两个不同的变体。C6055具有称作MGC34032、Genbank登录号No.AK128063、C6055V1和C6055V2的四个不同的变体。图4显示C2093、B5860Ns和C6055s的外源性表达和亚细胞定位。(a)在转染后24小时和48小时通过Western印迹检测的C2093蛋白质的外源性表达；(b)C2093蛋白质的亚细胞定位；(c)C2093的细胞周期依赖性定位；(d)在转染后24小时和48小时通过Western印迹分析的B5860NVI(左部)和B5860NV2(右部)蛋白质的外源性表达；(e)B5860NVl和(f)B5860NV2蛋白质的亚细胞定位；(g)B^60NVI和(h)BS860NV2蛋白质的细胞周期依赖性定位；(i)B5860NVI和B5860NV2共转染入C0S7细胞；(j)细胞周期进行过程中C2093的亚细胞定位；(k)细胞周期进行过程中B5860N的亚细胞定位；(l)在转染后36小时通过Western印迹4全测的C6055蛋白质的表达；(m)C6055蛋白质的翻译后修饰；(n)外源性C6O55蛋白质的亚细胞定位。图5显示小干扰RNA(siRNA)的生长抑制效果，所述小干扰RNA被"iS^计成可降低膀胱癌细胞中C2093的表达。(a)半定量RT-PCR，其结果显示膀胱癌细胞系UMUC3细胞中C2093的内源性表达的抑制，GAPDH用作内部对照，EGFP:作为对照的EGFP序列，和SCR:作为对照的置乱序列(scramblesequence)(参见材料与方法)(b)集落形成试验，该结果证实敲除UMUC3细胞中的C2093导致集落数减少；(c)MTT试验，该结果证实敲除UMUC3细胞中的C2093导致集落数减少；(d)半定量RT-PCR，该结果显示膀胱癌细胞系J82细胞中C2093的内源性表达的抑制，GAPDH用作内部对照；(e)集落形成试验，该结果证实敲除J82细胞中的C2093导致集落数减少；(f)MTT试验，该结果证实敲除J82细胞中的C2093导致集落数减少。图6显示小干扰RNA(siRNA)的生长抑制效果，所述小干扰RNA一皮设计成可降低膀胱癌细胞中B5860N的表达。(a)半定量RT-PCR,该结果显示膀胱癌细胞系J82细胞中B5860N的内源性表达的抑制，GAPDH用作内部对照，EGFP:作为对照的EGFP序列，SCR:作为对照的置乱序列(参见材料与方法)；(b)集落形成试验，该结果证实敲除J82细胞中的B5860N导致集落数减少；(c)MTT试验，该结果证实敲除J82细胞中的B5860N导致集落数减少。图7显示小干扰RNA(siRNA)的生长抑制效果，所述小干扰RNA被设计成可降低膀胱癌细胞中C6055的表达。(a)半定量RT-PCR，该结果显示膀胱癌细胞系SW780细胞中C6055的内源性表达的抑制，ACTB用作内部对照，SCR:作为对照的置乱序列(参见材料与方法)；(b)集落形成试验，该结果证实敲除SW780细胞中的C6055导致集落数减少；(c)MTT试验，该结果证实敲除SW780细胞中的C6055导致集落数减少。图8(a)由C2093-siRNA处理产生的多核(multi-nucleated)细胞；(b)使用抗-C2093抗体的Western印迹分析；(c)用显微镜方法得到的细胞形态。图9(a)膀胱癌组织切片中C2093的表达(右部x200,左部xlOO);(b)膀胱癌组织切片中B5860N的表达(右部x200,左部xlOO);正常膀胱组织(下部)。具体实施例方式除非另有特定的说明，本说明书中使用的词语"一个(a)"或"一种(an)"或"该(the)"是指至少一个或至少一种。膀胱癌细胞一般以实体(solidmass)的形式存在，其具有高度炎性反应并含有多种细胞组分。因此，先前公开的微阵列数据可能反映异源模式(heterogenousprofile)。考虑到这些问题，本发明人通过激光微束显微解剖法(LMM)制备纯化的膀胱癌细胞群，并使用表示27648个基因的cDNA微阵列分析了33例BLC的全基因组基因表达模式。这些数据不仅应提供与膀胱致癌作用相关的重要信息，而且还应该促进候选基因的鉴定，这些候选基因的产物可作为诊断标记和/或用于治疗膀胱癌患者的分子靶标，并提供临床相关的信息。本发明部分地基于BLC患者的上皮细胞和癌之间的多个核酸的表达图式变化的发现。基因表达的差异使用综合cDNA微阵列系统进行鉴定。使用与激光显微解剖联合的表示27,648个基因的cDNA微阵列分析了来自33例BLC的癌细胞的基因表达模式。通过比较用激光显微解剖完全选:泽的诊断为BLC的患者的癌细胞和正常导管上皮细胞之间的表达图式，鉴定出394个在BLC细胞中一般上调的基因(示于表4)。类似地，还可以鉴定出1272个在BLC细胞中一般下调的基因(示于表5)。此外，选择有可能在患者的血清或痰(sputum)中检测出癌症相关蛋白质的候选分子标记，并发现中，表4和5提供了在BLC和正常组织之间表达发生改变的基因的列表。的诊断用途，可改变所述BLC基因靶标的表达以治疗或减轻BLC的症状。在BLC患者中表达水平受到调节(即上升或下降)的基因列于表4-5，本说明书中将其统称为"BLC相关基因"、"BLC核酸'，或"BLC多核苷酸"；对应的由其编码的多肽称为"BLC多肽"或"BLC蛋白质"。除非另外说明，术语"BLC"是指本说明书公开的任何序歹'j(例如表4-5中列出的BLC相关基因)。对于先前已经描述的基因，同时给出其数据库登录号。通过测定细胞样品中各种基因的表达，可以诊断BLC。类似地，测定这些基因应答于各种物质的表达，可以鉴定用于治疗BLC的物质。本发明包括确定(例如测定)至少一种直至全部的表4-5中列出的BLC相关基因的表达。使用由已知序列的GenBankTM数据库登录项提供的序列信息，可使用本领域普通技术人员公知的技术检测和测定BLC相关基因。用于在例如Northern印迹杂交分析中检测对应于BLC相关基因的RNA序列。探针通常包括参照序列的至少10个、至少20个、至少50个、至少100个或至少200个核普酸。作为另一个例子，可以使用序列构建引物，用于在例如基于扩增的检测方法，如基于逆转录的聚合酶链式反应中特异性扩增一个或多个BLC核酸。然后，将受试细胞群体，例如源自患者的组织样品中的一个或多个BLC相关基因的表达水平与参照群体中相同基因的表达水平相比较。参照细胞群体包括一种或多种已知比较参数的细胞，即膀胱导管癌细胞(例如BLC细胞)或正常膀胱导管上皮细胞(例如非BLC细胞)。与参照细胞群体相比，受试细胞群体中的基因表达图式是否能表示BLC或其素因取决于参照细胞群体的组成。例如，如果参照细胞群体由非BLC细胞组成，受试细胞群体和参照细胞群体之间基因表达图式的相似性表示受试细胞群体是非BLC。反之，如果参照细胞群体由BLC细胞组成，受试细胞群体和参照细胞群体之间的基因表达模式的相似性表示受试细胞群体含有BLC细胞。如果受试细胞群体中BLC标记基因的表达水平与参照细胞群体中相应BLC标记基因的表达水平相差大于1.1倍、大于1.5倍、大于2.0倍、大于5.0倍、或大于10.0倍或更多，即可认为其"发生改变"。受试细胞群体和参照细胞群体之间的差异基因表达可以相对于对照核酸，例如持家基因(housekeepinggene)进行归一化。例如，对照核酸是已知在细胞的癌或非癌状态中不存在差异的核酸。可以利用对照核酸的表达水平对受试和参照群体中的信号水平进行归一化。例示性的对照基因包括但不限于例如(3-肌动蛋白、甘油醛3-磷酸脱氢酶和核糖体蛋白Pl。可以将受试细胞群体与多个参照细胞群体相比较。其中每个参照群体的已知参数可以不同。因此，可将受试细胞群体与已知含有例如BLC细胞的第一参照细胞群体和已知含有例如非BLC细胞(例如正常细胞)的第二参照细胞群体相比较。受试细胞可以包含在来自受试者的组织类型或细胞样品中，所述组织类型或细胞样品已知含有或疑似含有BLC细胞。受试细胞优选得自身体组织或体液，例如生物液体(如血液、痰或尿液)。例如，受试细胞可以纯化自膀胱组织。优选受试细胞群体含有上皮细胞。上皮细胞优选来自已知或疑似为膀胱导管癌的组织。参照细胞群体中的细胞应来自与受试细胞类似的组织类型。任选地，参照细胞群体是细胞系，例如BLC细胞系(即阳性对照)或正常非BLC细胞系(即阴性对照)。或者，对照细胞群体可源自分子信息数据库，所述分子信息来源于已知检测参数或条件的细胞。优选受试者为哺乳动物。例示性的哺乳动物包括但不限于人、非人灵长类动物、小鼠、大鼠、犬、猫、马或牛。可^f吏用本领域已知的方法，在蛋白质或核酸水平上测定本说明书公开的基因的表达。例如，可以使用Northern杂交分析测定基因表达，所述Northern杂交分析使用特异性识别这些核酸序列中的一个或多个序列的4笨针。可选地，可以使用例如差异表达基因序列的特异性引物，采用基于逆转录的PCR检测法测定基因表达。还可以在蛋白质水平上测定表达，即通过测定由本说明书所述基因编码的多肽水平或其生物活性来测定表达。这样的方法是本领域公知的，包括但不限于例如免疫测定法，该方法利用了针对所述基因编码的蛋白质的抗体。由这些基因编码的蛋白质的生物活性一般是公知的。为了阐明膀胱癌的机制并鉴定用于治疗和预防这些肿瘤的新诊断标记和/或药物靶标，本发明人使用全基因组cDNA微阵列结合激光微束显微解剖分析了膀胱癌中的基因表达模式。结果，鉴定出在膀胱癌细胞中特异性过表达的C2093、B5860N和C6055。此外，用小干扰RNA(siRNA)抑制C2093、B5860N和C6055基因的表达导致显著的癌细胞生长抑制。这些发现显示，C2093、B5860N和/或C6055爿武予癌细"包致癌活性，而抑制这些蛋白质中的一个或多个的活性可以成为治疗或预防增殖性疾病如膀胱癌的有希望的策略。脂6匿才艮据本发明，鉴定了具有相似序列的cDNA，它们编码B5860N的变体。较长的变体的cDNA由5318个核苷酸组成，其中包含2436个核苦酸的开放阅读框(SEQIDNO:3)。目前已知的B5860N的开放阅读框由1584个核苦酸组成，其编码527个氨基酸的蛋白质(GeneBank登录号NM—017779)。因此，由5318个核香酸组成的较长的变体是本发明最新发现的。而且，编码527个氨基酸的蛋白质的B5860NcDNA的已知序列由3338个核苷酸组成。然而，在本发明中，分离了由4466个核苦酸组成的B5860N的全长cDNA。与已知的核苷酸序列相比，这个较短的变体的核苷酸序列包含新的3'-UTR序列，但由此编码的两个氨基酸序列相同。本说明书中，编码已知的527个氨基酸的蛋白质的较短的变体和编码新的811个氨基酸的蛋白质的较长的变体的4争录物分别描述为B5860NV2和B5860NV1。B5860NV2和B5860NV1的核芬酸序列及由其编码的氨基酸序列列于以下的SEQIDNOs。核苷酸序列氨基酸序列B5860NV1SEQIDNO:3SEQIDNO:4B5860NV2SEQIDNO:5SEQIDNO:6因此，本发明提供由较长的变体B5860NV1以及其其功能等同物(以它们编码B5860NV1蛋白质为P艮)编码的基本上纯的多肽，其包括含有SEQIDNO:4的氨基酸序列的多肽。与B5860NV1在功能上等同的多肽的例子包括例如对应于人B5860NV1蛋白质的其它生物体的同源蛋白质，以及人B5860NV1蛋白质的突变体。C柳5根据本发明，鉴定了具有相似序列的cDNA,它们编码C6055的变体。根据NCBI^:据库，C6055位于染色体lp31.3,由24个外显子组成，称作MGC34032。由于C6055不包含在数据库中的MGC34032的最后一个外显子(外显子24)中，所以本发明人使用膀胱癌细胞系SW780作为^^莫板完成RT-PCR,从而进行EST-步移(EST-walking)、5'RACE和3，RACE实验，以获得C6055的全长cDNA序列(参见材料与方法)。结果，本发明人发现了》个新转录物即C6055V1和C6055V2。最后，该基因具有4个不同的剪接突变体，它们分别由24、25、22和22个外显子组成，对应于MGC34032、Genbank登录号No.AK128063、C6055V1和C6055V2(图3c)。MGC34032的外显子l、2、3、4和24存在可替换的剪接，其余的外显子是4个转录物共有的。C6055V1和C6055V2转录物中没有MGC34032的外显子1、2和3，但在最后的外显子内产生相同的终止密码子。具体地，C6055V1和C6055V2转录物的ORF均始于各自的外显子4,这显示C6055V1和C6055V2转录物具有相同的ORF。MGC34032、Genbank登录号No.AK128063、C6055V1和C6055V2转录物的全长cDNA序列分别由2302、3947、3851和3819个核芬酸组成。最终，MGC34032、Genbank登录号No.AK128063、C6055V1和C6055V2转录物分别编码719、587、675和675个氨基酸的多肽。C6055V1和C6055V2的核苷酸序列及由其编码的氨基酸序列列于以下的SEQIDNOs。核芬酸序列氨基酸序列C6055V1SEQIDNO:129SEQIDNO:130C6055V2SEQIDNO:131SEQIDNO:132因此，本发明提供由较长的变体C6055V1或C6055V2以及其功能等同物(以它们编码Genbank登录号No.AK128063的蛋白质为限)编码的基本上纯的多肽，其包括含有SEQIDNO:130和SEQIDNO:132的氨基酸序列的多肽。与C6055V1或C6055V2在功能上等同的多肽的例子包括例如对应于人C6055V1或C6055V2蛋白质的其它生物体的同源蛋白质及人C6055V1或C6055V2蛋白质的突变体。在本发明中，术语"功能上等同的"是指对象多肽具有如B5860NV1蛋白的促进细胞增殖的活性及赋予癌细胞致癌活性的活性。将编码对象多肽的DNA导入细胞并表达各种多肽，然后检测细胞增殖的促进或集落形成活性的提高，可以判断对象多肽是否具有细胞增殖活性。这样的细胞例如包括NIH3T3，COS7和HEK293。用于制备与给定的蛋白质功能上等同的多肽的方法是本领域技术人员公知的，并且包括在蛋白质中导入突变的已知方法。例如，本领域技术人员可通过定点诱变(Hashimoto-Gotohetal.,Gene152:271-275(1995);ZollerandSmith,MethodsEnzymol100:468-500(1983);Krameretal.,NucleicAcidsRes.12:9441-9456(1984);KramerandFritz,MethodsEnzymol154:350-367(1987);Kunkel,ProcNatlAcadSciUSA82:488-492(1985);Kunkel,MethodsEnzymol,204:125-39)在人B5860NV1蛋白质的氨基酸序列中导入适当的突变，从而制备与所述的蛋白质功能上等同的多肽。氨基酸突变也可自然发生。只要获得的突变多肽与人B5860NV1蛋白质功能上等同，本发明的多肽包括具有一个或多个氨基酸发生了突变的人B5860NV1蛋白质的氨基酸序列的蛋白质。本发明中，突变数一般为全部氨基酸的35%以下，优选30%以下，更优选为25%、20%、10%、5%、2%或1%以下。具体地，这样的突变体中发生突变的氨基酸的数目一般为200个或100个氨基酸或更少，通常为10个氨基酸或更少，优选6个氨基酸或更少，更优选3个氨基酸或更少。已知经突变或修饰的蛋白质能保留原始的生物活性，其中所述蛋白质具有通过在某一氨基酸序列中取代、缺失、插入和/或添加一个或多个氨基酸残基而修饰的氨基酸序歹寸(Mark"a/.,ProcNatlAcadSciUSA81:5662-5666(1984);ZollerandSmith,NucleicAcidsRes10:6487-6500(1982);Dalbadie-McFarlandetal.,ProcNatlAcadSciUSA79:6409-6413(1982))。因此，优选将待突变的氨基酸残基突变为保留氨基酸侧链性质的不同氨基酸(该过程称为保守氨基酸取代)。氨基酸侧链性质的例子为疏水氨基酸(A,I，L,M,F,P,W，Y,V)、亲水氨基酸(R,D，N,C,E，Q,G,H，K,S,T)以及具有以下官能团或共有特性的侧链脂肪族侧链(GA，V，L,I,P);含羟基侧链(S，T,Y);含硫原子侧链(C，M);含羧酸和酰胺侧链(D,N,E，Q);含碱性基团侧链(R,K,H)和含芳香族侧链(H，F,Y，W)。需说明的是括号中的字母表示氨基酸的单字母符号。在人B5860NV1蛋白质的氨基酸序列中添加一个或多个氨基酸残基所得多肽的例子是含有人B5860NV1蛋白质的融合蛋白。本发明包括人B5860NV1蛋白质与其它肽或蛋白质的融合物即融合蛋白。通过本领域技术人员公知的技术可制备融合蛋白，例如可以将编码本发明的人B5860NV1蛋白质的DNA与编码其它肽或蛋白质的DNA连接以使读码框匹配，将融合DNA插入表达载体并在宿主中表达所述融合DNA。对于可与本发明的蛋白质融合的肽或蛋白质没有限制。可以用作与本发明的蛋白质融合的已知肽包括例如FLAG(Hoppetal.,(1988)Biotechnology6:1204-10)、含有6个His(组氨酸)残基的6xHis、10xHis、流感病毒凝集素(HA)、人c-myc片段、VSP-GP片段、pl8HIV片段、T7-标签、HSV-标签、E-标签、SV40T抗原片段、lck标签、a-微管蛋白片段、B-标签、蛋白C片段等。可以与本发明的蛋白质融合的蛋白质实例包括GST(谷胱甘肽-S-转移酶)、流感病毒凝集素(HA)、免疫球蛋白恒定区、(3-半乳糖苷酶、MBP(麦芽糖-结合蛋白)等。通过将编码上述融合肽或蛋白质的商业上可得到的DNA与编码本发明的多肽的DNA融合，并表达所制备的融合DNA,即可制备出融合蛋白。可选地，可以采用本领域公知的方法，例如使用杂交技术来分离功能上等同的多肽(Sambrook"a/"(1989)MolecularCloning2nded.9,47-9.58，ColdSpringHarborLab.Press)。本领域技术人员能够容易地分离出与编码人B5860NV1蛋白质的DNA序列(即SEQIDNO:3)的全部或部分具有高度同源性的DNA,并且由分离的DNA分离与人B5860NV1蛋白质功能上等同的多肽。本发明的多肽包括由DNA编码的多肽，所述DNA与编码人B5860NV1蛋白的DNA序列的全部或部分杂交，并且本发明的多肽功能上等同于人B5860NV1蛋白。这些多肽包括对应于源自人的蛋白质的哺乳动物同源物(例如由猴、大鼠、兔和牛基因编码的多肽)。在从动物中分离与编码人B5860NV1蛋白质的DNA高度同源的cDNA时，特别优选使用来自睾丸的组织或膀胱癌组织。本领域技术人员可以按常规选择杂交条件，用于分离编码与人B5860NV1蛋白质功能上等同的多肽的DNA。例如杂交可通过如下方式进或更长时间，加入标记的探针，并在68。C保温1小时或更长时间。其后的洗涤步骤，例如可以在低度严紧条件下进行。低度严紧条件为，例如42Tl、2xSSC、0.1%SDS,或优选50。C、2xSSC、0.1%SDS。更优选使用高严紧条件。高严紧条件为，例如室温下用2xSSC、0.01。/。SDS洗涤3次、每次20分钟，然后于37。C用lxSSC、0.1。/。SDS洗涤3次，每次20分钟，再于50。C用lxSSC、0.1。/。SDS洗涤2次、每次20分钟。然而，几种因素，如温度和盐浓度会影响可以采用基因扩增法，例如聚合酶链反应(PCR)法代替杂交来分离编码与人B5860NV1蛋白质功能上等同的多肽的DNA，所述基因扩增法使用基于编码蛋白质的DNA的序列信息(SEQIDNO:3)合成的引物。由通过上述杂交技术或基因扩增技术分离的DNA编码的、与人B5860NV1蛋白质功能上等同的多肽一般与人B5860NV1蛋白质的氨基酸序列具有高度同源性。本说明书中使用的术语"高同源性"一般指多肽或多核苷酸序列与其参照序列之间的同源性为40%或更高，优选为60%或更高，更优选为80%或更高，甚至更优选85%、90%、93%、95%、98%、99%或更高。百分比同源性(百分比同一性)通常在两个最优比对的序列之间测定。为较可例如叶吏用"WilburandLipman，(1983)ProcNatlAcadSciUSA80:726-30"中的算法进行。本发明的多肽在氨基酸序列、分子量、等电点、存在或不存在糖链或形式等方面可以存在差异，这取决于用于产生所述多肽的细胞或宿主或者采用的纯化方法。无论如何，只要该多肽具有等同于本发明的人B5860NV1蛋白质的功能，就落入本发明的范围。采用本领域技术人员公知的方法可以以重组蛋白质或天然蛋白质的形式制备本发明的多肽。采用下述方法可以制备重组蛋白质将编码本发明多肽的DNA(例如含有核苷酸序列SEQIDNO:3的DNA)插入适当的表达载体，将载体导入适当的宿主细胞，获得提取物，然后对提取物进行层析以纯化多肽，所述层析包括例如离子交换层析、反相层析、凝胶过滤、或利用固定有抗本发明蛋白质抗体的柱子的亲和层析，或多于一种所述柱的组合。此外，当在宿主细胞(例如动物细胞和大肠杆菌)中以与谷胱甘肽-S-转移酶的融合蛋白的形式、或者以添加了多个组氨酸的重组蛋白的形式表达本发明的多肽时，可以使用谷胱甘肽柱或镍柱纯化所表达的重组蛋白质。或者，当以用c-myc、多个组氨酸或FLAG标记的蛋白质的形式表达本发明的多肽时，可以分別使用针对c-myc、His或FLAG的抗体进行检测和纯化。纯化融合蛋白之后，根据需要也可以通过用凝血酶或Xa因子切割融合蛋白来除去目的多肽之外的区域。可以采用本领域技术人员公知的方法分离出天然蛋白质，所述方法例如使下述的结合有可与B5860NV1蛋白质结合的抗体的亲和柱与表达本发明的多肽的组织或细胞的提取物接触。本发明还包括本发明的多肽的部分肽。优选地，本发明的部分肽包含选自氨基酸序列SEQIDNO:4的304-588位的氨基酸序列或其部分。与B5860NV2相比较，304-588位之间延伸的氨基酸序列是B5860NV1特异性区域。部分多肽具有本发明的多肽特有的氨基酸序列，并由至少7个、优选至少8个或更多、更优选至少9个或更多氨基酸组成。部分肽例如可以用于制备抗本发明的多肽的抗体、筛选与本发明的多肽结合的化合物以及筛选本发明的多肽的抑制剂。通过基因工程操作、通过已知的肽合成法或通过用适当的肽酶消化本发明的多肽，均可以产生本发明的部分肽。例如，肽合成可以采取固相合成或液相合成。本发明还提供编码上述B5860NV1多肽的多核苷酸。本发明的多核苷酸可以用于体内或体外产生上述本发明的多肽，或者可以用于由编码本发明的蛋白质的基因的基因异常所致疾病的基因治疗。可以使用本发明的多核苷酸的任何形式，只要其编码本发明的多肽，其包括mRNA、RNA、cDNA、基因组DNA和化学合成的多核苷酸。本发明的多核苷酸包括含有给定核苷酸序列及其简并序列的DNA,只要所得的DNA能够编码本发明的多肽。可以采用本领域技术人员公知的方法制备本发明的多核香酸。例如可以采用以下方法制备本发明的多核苷酸由表达本发明的多肽的细胞制备cDNA文库，然后以本发明的DNA(例如SEQIDNO:3)的部分序列为探针进行杂交。采用Sambrookea/"MolecularCloning,ColdSpringHarborLaboratoryPress(1989)中所述的方法可以制备cDNA文库；或者可以使用商业上可得到的cDNA文库。还可以采用下述方法制备cDNA文库从表达本发明的多肽的细胞中提取RNA，基于本发明DNA的序列(例如SEQIDNO:3)合成寡聚DNA,以寡聚DNA为引物进行PCR，并扩增编码本发明的蛋白质的cDNA。另夕卜，通过对所得cDNA的核普酸进行测序，可以常规地确定由cDNA编码的翻译区，这样就可以容易地获得本发明的多肽的氨基酸序列。而且，通过以所得cDNA或其部分作为.'探针筛选基因组DNA文库，可以分离出基因组DNA。更具体地，可以从表达本发明的对象多肽的细胞、组织、器官(例如睾丸)或膀胱癌细胞系中首次制备mRNA。可以采用公知的方法分离mRNA。例如，总RNA的制备可以采用胍超离心法(Chirgwin"a/.,(1979)Biochemistry18:5294-9)或AGPC法(ChomczynskiandSacchi,(1987)AnalBiochem162:156-9)。另外，可以使用mRNA纯化试剂盒(Pharmacia)等由总RNA纯化mRNA。或者，可以使用QuickPrepmRNA纯化试剂盒(Pharmacia)直接纯化mRNA。获得的mRNA可用于使用逆转录酶合成cDNA。可以使用商业上可得到的试剂盒，如AMV逆转录酶cDNA第一链合成试剂盒(SeikagakuKogyo)等合成cDNA。或者，可以采用使用本说明书所述引物等、5，-AmpliFINDERRACE试剂盒(Clontech)和聚合酶链反应(PCR)，按照5，-RACE法(Frohman"a/.,ProcNatlAcadSciUSA85:8998-9002(1988);Belyavsky"a/.,NucleicAcidsRes17:2919-2932(1989))合成和扩增cDNA。由PCR产物制备所需DNA片段，并与载体DNA连接。使用重组载体转化大肠杆菌等，由选出的菌落制备所需的重组载体。采用常规方法，如双脱氧核芬酸链终止法验证所需DNA的核苷酸序列。考虑到待用于表达的宿主中密码子使用的频率，本发明的多核苷酸的核苷酸序列可以设计成能够更有效地表达的形式(Grantham"/.，NucleicAcidsRes9:43-74(1981))。可以使用商业上可得到的试剂盒或常规方法改变本发明的多核苷酸的序列。例如，可以通过用限制性酶消化、插入合成的寡核苷酸或适当的多核苦酸片段、添加接头或插入起始密码子(ATG)和/或终止密码子(TAA,TGA或TAG)的方式改变序列。具体地说，本发明的多核苦酸包括含有SEQIDNO:3的核苷酸序列的DNA。此外，本发明提供可在严紧条件下与具有SEQIDNO:3的核苷酸序列的多核苷酸杂交、并且编码上述本发明的与B5860NV1蛋白质功能上等同的多肽的多核苷酸。本领域技术人员可以适宜地选择合适的严紧条件。例如，可以采用低严紧条件。优选采用高严紧条件。这些条件与前述的条件相同。上述的杂交DNA优选为cDNA或染色体DNA。本发明还提供与编码人B5860NV1蛋白质的多核苷酸(SEQIDNO:3)或其互补链互补的、并含有至少15个核苷酸的多核苦酸，其中所述多核苷酸可与SEQIDNO:3的988-1842位之间延伸的核苷酸序列杂交。本发明的多核苦酸优选与编码本发明的B5860NV1多肽的DNA特异性杂交的多核苷酸。如本文使用的术语"特异性杂交"指在通常的杂交条件下、优选在严紧的杂交条件下不与编码其它蛋白质的DNA发生明显的交叉杂交(cross-hybridization)。这样的多核苷酸包括与编码本发明的多肽的DNA或其互补链特异性杂交的探针、引物、核苷酸和核苷酸衍生物(例如，反义寡核苷酸和核酶)。此外，这样的多核苷酸可以用于制备DNA芯片。载体和宿主细胞本发明还提供导入了本发明的多核苷酸的载体和宿主细胞。本发明的载体可以用于在宿主细胞中维持本发明的多核苷酸、尤其是DNA,以表达本发明的多肽，或者施用本发明的多核苷酸用于基因治疗。当宿主细胞为大肠杆菌，并且在大肠杆菌(如JM109,DH5a,HB101或XLlBlue)中大量扩增和制备载体时，载体应具有用于在大肠杆菌中扩增的"ori"和用于选择转化大肠杆菌的标记基因(例如通过药物，如氨千青霉素、四环素、卡那霉素、氯霉素等选择的药物抗性基因)。例如，可以使用M13系列载体、pUC系列载体、pBR322、pBluescript、pCR-Script等。另夕卜，与上述载体相同，pGEM-T、pDIRECT和pT7也可以用于亚克隆和提耳又cDNA。当使用载体制备本发明的蛋白质时，表达载体是特别有用的。例如，在大肠杆菌中表达的表达载体须具备上述特征，以便在大肠杆菌中扩增。当将大肠杆菌，如JM109,DH5ot,HB101或XLlBlue用作宿主细胞时，载体应具有在大肠杆菌中有效表达所需基因的启动子，例如lacZ启动子(Wardetal.，Nature341:544-546(1989);FASEBJ6:2422-2427(1992))、araB启动子(Betteretal.,Science240:1041-1043(1988))、T7启动子等。在这方面，可以使用例如pGEX-5X-1(Pharmacia)、"QIAexpress系统，，(Qiagen)、pEGFP和pET(此时，宿主优选为表达T7RNA聚合酶的BL21)来替代上述载体。另外，载体也可以含有用于多肽分泌的信号序列。指导多肽分泌至大肠杆菌周质的例示性信号序列为pe旧信号序列(Leiefa/.，JBacteriol169:4379(1987))。将载体导入耙宿主细胞的方法包括例如氯化4丐法和电穿孔法。除大肠杆菌外，可以使用下述载体制备本发明的多肽例如源自哺乳动物的表达载体(例如pcDNA3(Invitrogen)和pEF-BOS(MizushimaSandNagataS,(1990)NucleicAcidsRes18(17):5322)、pEF、pCDM8),源自昆虫细胞的表达载体(例如"Bac-to-BAC杆状病毒表达系统"(GIBCOBRL),pBacPAK8)，源自植物的表达载体(例如pMHl，pMH2)，源自动物病毒的表达载体(例如pHSV,pMV,pAdexLcw),源自逆转录病毒的表达载体(例如pZIpneo),源自酵母的表达载体(例如"毕赤酵母表达试剂盒"(Invitrogen),pNVll,SP-Q01)以及源自枯草芽孢杆菌的表达载体(如pPL608，pKTH50)。为了在动物细胞，如CHO,COS或NIH3T3细胞中表达载体，载体应具有在所述细胞中进行表达所必需的启动子，例如SV40启动子(Mulligan"Nature277:108(1979))、MMLV-LTR启动子、EFlot启动子(Mizushima"a/.,NucleicAcidsRes18:5322(1990))、CMV启动子等，和优选用于选4奪转化子的标记基因(例如通过药物(例如新霉素、G418)进行选择的药物抗性基因)。具有这些特征的已知载体的例子包括例如pMAM、pDR2、pBK-RSV、pBK-CMV、pOPRSV和pOP13。产生多肽另外，本发明提供产生本发明多肽的方法。通过培养携带表达载体的宿主细胞可以制备多肽，其中所述表达载体含有编码所述多肽的基因。根据需要，可以采用一些方法稳定地表达基因的同时在细胞内扩增基因的拷贝数。例如，可以将含有补偿性(complementary)DHFR基因的载体(例如pCHOI)导入核酸合成途径缺陷的CHO细胞，然后利用氨曱蝶呤(MTX)扩增该载体。另外，当瞬时表达基因时，可以采用如下方法用含有SV40复制起点的载体(pcD等)转化入染色体上含有SV40T抗原表达基因的COS细胞。按上述方法获得的本发明多肽可分离自宿主细胞的内部或外部(如培养基)，并被纯化成基本上纯的均质多肽。本说明书中使用的与给定多肽有关的术语"基本上纯的"是指多肽基本上不含有其它生物大分子。基本上纯的多肽是以干重表示的至少75%(例如至少80%、85%、95%或99%)的纯度。可采用任何适当的标准方法来测定纯度，所述方法例如柱层析、聚丙烯酰胺凝胶电泳或HPLC分析。多肽的分离和纯化方法并不局限于任何特定的方法，实际上可以采用任何标准方法。例如，可以适当选择和组合柱层析、过滤、超滤、盐析、溶剂沉淀、溶剂提取、蒸馏、免疫沉淀、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电点电泳、透析和重结晶等方法，进行多肽的分离与纯化。层析的例子包括例如亲和层析、离子交换层析、疏水层析、凝胶过滤、反相层析、吸附层析等(StrategiesforProteinPurificationandCharacterization:ALaboratoryCourseManual.Ed.DanielR.Marshaketal"ColdSpringHarborLaboratoryPress(1996)》通过液相色谦，如HPLC和FPLC即可进行这些层析。因此，本发明提供通过上述方法制备的高纯度多肽。在纯化前和/或纯化后用适当的蛋白质修饰酶处理本发明的多肽，可对其进行任意修饰或部分缺失。有用的蛋白质修饰酶包括但不限于胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶(chymotrypsin)、赖氨酰内肽酶、蛋白激酶、葡糖苷酶等。膀胱癌的诊断在本发明的上下文中，通过测定受试细胞群体(即源自患者的生物样品)中一种或多种BLC核酸的表达水平来诊断BLC。优选受试细胞群体含有上皮细胞，例如由膀胱组织获得的细胞。还可以由血液或其它体液(如尿液)测定基因表达。其它生物样品可用于测定蛋白质水平。例如，可采用免疫测定法或其它常规生物学试验测定来自待诊断受试者的血液或血清中的蛋白质水平。在受试细胞或生物样品中测定一种或多种BLC相关基因，例如表4-5中所列基因的表达，并将其与受试的一种或多种BLC相关基因有关的正常对照表达水平进行比较。正常对照水平是通常在已知未患BLC的人群中存在的BLC相关基因的表达模式。在源自患者的组织样品中，一种或多种BLC相关基因表达水平的改变(例如上升或下降)表示该受试者患有膀胱癌或处于发生膀胱癌的危险中。例如，与正常对照水平相比，受试群体中一种或多种列于表4中的上调的BLC相关基因的表达上升，表示该受试者患有膀胱癌或处于发生膀胱癌的危险中。与之相对，与正常对照水平相比，受试群体中一种或多种列于表5中的下调的BLC相关基因的表达下降，表示该受试者患有膀胱癌或处于发生膀胱癌的危险中。与正常对照水平相比，受试群体中一种或多种BLC相关基因表达水平的改变表示该受试者患有膀胱癌或处于发生膀胱癌的危险中。例如，一系列BLC相关基因(表4-5列出的基因)的至少1%、至少5%、至少25%、至少50%、至少60%、至少80%、至少90%或更多发生改变，表示该受试者患有膀胱癌或处于发生膀胱癌的危险中。而且，本发明提供使用本发明的基因表达水平为诊断标记，诊断细胞增殖性疾病如膀胱癌的方法。该诊断方法包括如下步骤(a)检测C2093、B5860N和C6055基因中的一个或多个的表达水平；和(b)将表达水平的上升与膀胱癌相联系。在本发明的上下文中，B5860N基因的转录物包括B5860NV1和B5860NV2。在本发明的上下文中，C6055基因的转录物包括MGC34032、Genbank登录号No.AK128063、C6055V1和C6055V2。通过定量分析对应于C2093、B5860Ns或C6055s基因的mRNA或者由这些基因编码的蛋白质，可以评估生物样品中C2093、B5860Ns或C6055s基因的表达水平。mRNA的定量分析方法是本领域技术人员公知的。例如，可以通过Northern印迹分析或RT-PCR来评估对应于C2093、B5860Ns或C6055s基因的mRNA的水平。C2093基因的全长核苦酸序列示于SEQIDNO:1。可选地，B5860N基因转录物的2个变体形式的全长核苷酸序列也示于SEQIDNO:3和5。可选地，C6055基因转录物的4个变体形式的全长核苷酸序列也示于SEQIDNO:129、131、133和135。因此，任4可本领域技术人员能够设计出用于定量分析C2093、B5860N或C6055基因的4笨针或引物的核芬酸序列。此外，基于由C2093、B5860Ns或C6055s基因编码的蛋白质的活性或量(quantity),可以分析这些基因的表达水平。测定C2093、B5860N或C6055蛋白质的量的方法显示如下。例如，免疫测定法在测定生物材料中的蛋白质方面是十分有效的。只要膀胱癌患者的样品中表达标记基因(即C2093、B5860Ns或C6055s基因)，可以将任何生物材料用作测定蛋白质或其活性的生物样品。例如，在本发明的上下文中，膀胱组织是优选的生物样品，而体液，如血液及尿液同样可以用于分析。另一方面，为了测定由C2093、B5860Ns或C6055s基因编码的蛋白质的活性，可根据待分析的蛋白质的活性选择适当的方法。对生物样品中的C2093、B5860Ns或C6055s基因的表达水平进行评估，并与正常样品(例如源自非患病受试者的样品)中的表达水平相比较。当这样的比较显示目标基因的表达水平比正常样品中的表达水平高，则可以判定该受试者患有膀胱癌。可以同时测定来自正常受试者和待诊断受试者的生物样品中C2093、B5860Ns或C6055s基因的表达水平。或者可以采用统计学方法，基于通过分析从对照组预先采集的样品中基因表达水平获得的结果，确定出表达水平的正常范围。通过将受试者样品获得的结果与正常范围进行比较而获得结果，当该结果未落入正常范围时，可以判定受试者患有(affectedwith)膀胱癌或处于发生膀胱癌的危险中。在本发明中，还提供诊断细胞增殖性疾病，如膀胱癌的诊断试剂。本发明的诊断试剂包括与C2093、B5860Ns或C6055s基因转录物或由其编码的多肽结合的化合物。优选地，可与含有选自SEQIDNO:l、3、5、129、131、133和135的核苷酸序列的多核苦酸杂交的寡核普酸，或者可与由选自SEQIDNO:2、4、6、130、132、134和136的氨基酸序列组成的多肽结合的抗体可用作这样的化合物。鉴定抑制或增强BLC相关基因表达的物质使表达BLC相关的上调基因的受试细胞群与受试物质接触，然后测定BLC相关基因的表达水平或其基因产物的活性，可以鉴定抑制BLC相关基因的表达或其基因产物的活性的物质。与不存在受试物质条件下的表达或物的活性水平下降，表明该物质是BLC相关的上调基因的抑制剂并可用于抑制BLC。或者，使表达BLC相关的基因的受试细胞群与受试物质接触，然后测定BLC相关的下调基因的表达水平或其基因产物的活性，可以鉴定增强BLC相关基因的表达或其基因产物活性的物质。与不存在受试物质条件下的表达或活性水平相比，存在受试物质条件下BLC相关基因的表达水平或其基因产物的活性水平上升，表明该受试物质可增加(augment)BLC相关的下调基因的表达或其基因产物的活性。受试细胞群可以是表达BLC相关基因的任何细胞。例如，受试细胞群可包含上皮细胞，如源自膀胱组织的细胞。而且，受试细胞还可以是源自癌细胞的无限增殖细胞系。或者，受试细胞还可以是用BLC相关基因转染的细胞，或者是用来自BLC相关基因的、与报告基因可操作相连的调控序列(例如启动子序列)转染的细胞。评价受试者中BLC治疗的有效性在本说明书中鉴定的差异表达的BLC相关基因，用于监测BLC的治疗过程。在该方法中，由接受BLC治疗的受试者提供受试细胞群体。必要时，在治疗前、治疗中和/或治疗后的不同时间点由受试者获取受试细胞群体。然后测定细胞群体中一种或多种BLC相关基因的表达，并与包含BLC状态已知的细胞的参照细胞群体相比较。在本发明的上下文中，参照细胞应未接受所述的治疗。如果参照细胞群体不含有BLC细胞，那么受试细胞群体和参照细胞群体中BLC相关基因表达的相似性表示所述的治疗是有效的。而受试细胞群体和正常对照参照细胞群体中BLC相关基因表达的差异，表示临床效果或预后较不理想。类似地，如果参照细胞群体含有BLC细胞，那么受试细胞群体和参照细胞群体中BLC相关基因表达之间的差异表示所述的治疗是有效的，而受试细胞群体和膀胱癌对照参照细胞群体中BLC相关基因表达的相似性则表示临床效果或预后较不理想。另外，可将在治疗后得到的源自受试者的生物样品中测定的一种或多种BLC相关基因的表达水平(即治疗后的水平)与在治疗开始之前得到的源自受试者的生物样品中测定的一种或多种BLC相关基因的表达水平(即治疗前的水平)相比较。如果BLC-相关基因是上调基因，那么治疗后样品中表达水平的降低表示所述的治疗是有效的，而治疗后样品中表达水平的增加或维持则表示临床效果或预后较不理想。相反地，如果BLC-相关基因是下调基因，那么治疗后样品中表达水平的上升表示所述的治疗是有效的，而治疗后样品中表达水平的下降或维持则表示临床效果或预后较不理想。如本文中所使用的，术语"有效的"表示治疗引起受试者体内病理性上调的基因的表达下降，病理性下调的基因的表达上升或膀胱导管癌妁大小、流行性(prevalence)或转移潜力降低。当预防性施用所述的治疗时，术语"有效的，，指治疗能够延迟或防止膀胱肿瘤的形成，或者能延迟、防止或减轻BLC的临床症状。膀胱肿瘤的评价可以使用标准的临床规程进行。此外，可以与任何.已知的诊断或治疗BLC的方法相关4关来判别有效性。例如，通过确定症状性异常(symptomaticanomalies)可以进行BLC的诊断，所述症状性异常例如体重减轻、腹痛、背痛、食欲减退、恶心、呕吐和全身不适(generalizedmalaise)、虚弱和黄疰。诊断膀胱癌的本方法可以用于评价受试者中膀胱癌治疗的有效性。根据本方法，由接受膀胱癌治疗的受试者获得生物样品，如受试细胞群。评价方法可以按诊断膀胱癌的常规方法进行。必要时，在治疗前、治疗中和/或治疗后的不同时间点由受试者获取生物样品。然后测定生物样品中C2093、B5860Ns或C6055s基因的表达水平，并与对照水平进行比较，所述对照水平源自例如包含膀胱癌状态(即癌细胞或非癌细胞)已知的细胞的参照细胞群体。所述对照水平在未接受所述治疗的生物样品中进行测定。当对照水平源自不含癌细胞的生物样品时，源自受试者的生物样品中的表达水平与对照水平之间的相似性，表明治疗是有效的。而在源自受试者的生物样品中C2093、B5860Ns或C6055s基因的表达水平与对照水平的差异，表示临床效果或预后较不理想。术语"有效的，，指治疗引起受试者体内病理性上调的基因(例如C2093、B5860Ns或C6055s基因)的表达下降，或者膀胱癌细胞的大小、流行性或增殖潜力降^f氐。当预防性地施用治疗时，术语"有效的"表示治疗可延迟或防止膀胱癌的发生。膀胱癌的评价可以使用标准的临床规程进行。此外，可以采用诊断或治疗膀胱癌的任何已知方法来确定治疗的有效性。此外，通过将源自患者的生物样品，如受试细胞群中C2093、B5860Ns或C6055s基因的表达水平与对照水平进行比较，诊断膀胱癌的本方法还用于评价膀胱癌患者的预后。或者，可在疾病阶段谱(spectrumofdiseasestage)中测定源自患者的生物样品中C2093、B5860Ns或C6055s基因的表达水平，以评价患者的预后。与正常对照水平相比，C2093、B5860Ns或C6055s基因的表达水平上升，则表示预后较不理想；而C2093、B5860Ns或C6055s基因的表达水平与正常对照水平相似，则表示患者预后良好。选j奪适于具体个体的用于治疗BLC的治疗剂个体基因组成(geneticmakeup)的差异可导致其代谢多种药物的相对能力出现差异。在受试者体内代谢从而起到抗BLC剂作用的物质，可以通过在受试者的细胞内诱导癌症状态特征性基因表达图式向非癌症状态特征性基因表达图式的转变而自己显现出来。因此，本说明书公开的差异表达的BLC相关基因用于在来自选定受试者的受试细胞群体中测试推定的具有治疗效果或预防效果的BLC抑制剂，从而确定该物质在所述受试者中是否是合适的BLC抑制剂。为了鉴定出适于具体受试者的BLC抑制剂，可将来自受试者的受试细胞群体暴露于治疗剂中，然后测定一种或多种表4-5的BLC相关基因的表达。在本发明方法的上下文中，受试细胞群体含有表达BLC相关基因的BLC细胞。优选受试细胞是上皮细胞。例如，可以在存在候选物质的条件下保温受试细胞群体，测定受试细胞群体的基因表达图式，并与一种或多种参照模式，例如BLC参照表达模式或非BLC参照表达模式进行比较。相对于含有BLC的参照细胞群体而言，一种或多种表4中所列的BLC相关基因表达下降，或者一种或多种表5中所列的BLC相关基因表达上升，表示该物质具有治疗的潜力。在本发明的上下文中，受试物质可以是任何化合物或组合物。例示性的受试物质包括但不限于免疫调节剂。鉴定治疗剂的筛选试验本说明书公开的差异表达的BLC相关基因也可以用于鉴定治疗BLC的候选治疗剂。本发明的方法包括筛选候选治疗剂，以确定该候选治疗剂是否能够将BLC状态特征性的一种或多种表4-5中所列的BLC相关基因的表达模式转变非BLC状态特征性基因表达图式。在本发明的方法中，将细胞暴露于一种或多种受试物质(依次或组合)，并测定细胞中一种或多种表4-5中所列的BLC相关基因的表达。将在受试群体中测定的BLC相关基因的表达模式与未暴露于受试物质的参照细胞群体中相同BLC相关基因的表达水平进行比较。的临床益处。可以在动物或受试者中进一步验证该物质防止膀胱导管癌生长的能力。在另一个实施方案中，本发明提供筛选候选物质的方法，所述候选物质在BLC治疗中作用于潜在靶标。正如上文所详细讨论的，控制标记基因的表达水平或其基因产物的活性，可以控制BLC的发生和发展。因此，通过采用将所述表达水平和活性作为癌或非癌状态指标的筛选方法，可以鉴定出在BLC治疗中作用于潜在靶标的候选物质。在本发明的上下文中，所述筛选可包括例如下述步骤a)使受试化合物与多肽接触，其中所述多肽由选自表4或5中所列的基因的多核苷酸编码；c)选择与多肽结合的受试化合物。或者，本发明的筛选方法可以包括下述步骤a)使候选化合物与细胞接触，其中所述细胞表达选自表4或5中所列的基因的一个或多个标记基因；和b)选择降低选自表4中所列的基因的一个或多个标记基因的表达水平、或者提高选自表5中所列的基因的一个或多个标记基因的表达水平的候选化合物。表达标记基因的细胞包括例如由BLC建立的细胞系；所述细胞可以用于本发明的上述筛选。或者，本发明的筛选方法可包括下述步骤a)使受试化合物与多肽接触，其中所述多肽由选自表4或5中所列的基因的多核苷酸编码；b^全测步骤a)的多肽的生物活性；和c)与在不存在受试化合物时检出的生物活性相比，选择抑制多肽的生物活性的化合物，所述多肽由选自表4中所列的基因的多核苷酸编码；或者选择增强多肽的生物活性的化合物，所述多肽由选自表5中所列的基因的多核苷酸编码。可以使用标记基因的核苷酸序列，以重组蛋白质的形式获得可用于本发明的薛选方法的蛋白质。基于与标记基因及其编码的蛋白质有关的信息，本领域技术人员可以选择蛋白质的任何生物活性作为筛选指标，并可以选择任何适当的测定方法来检测选择的生物活性。或者，本发明的筛选方法可以包括以下步骤a)使候选化合物与导入了载体的细胞接触，其中所述载体含有选自表4或5中所列的基因的一个或多个标记基因的转录调控区及在该转录调控区的调控下表达的报告基因；b)测定该报告基因的表达或活性；和c)与在不存在受试化合物时检出的该报告基因的表达水平或活性相比，当该报告基因为选自表4中所列的基因的上调标记基因时，选择降低该报告基因的表达水平或活性的候选化合物；或者当该报告基因为选自表5中所列的下调标记基因时，选择增强该报告基因的表达水平或活性的候选化合物。合适的报告基因和宿主细胞是本领域公知的。通过使用标记基因的转人员已知标记基因的转录调控区时，可通过使用先前的序列信息来制备报告子构建体。当标记基因的转录调控区仍未鉴定时，可以基于标记基因的核苷酸序列信息从基因组文库中分离含有转录调控区的核苷酸区段。利用C2093、B5860Ns或C6055s基因和/或由这些基因编码的蛋白质、或者利用这些基因的转录调控区，可以筛选能够改变所述基因的表达或者能够改变由所述基因编码的多肽的生物活性的化合物。因此，本发明提供利用本发明的多肽筛选用于治疗或预防膀胱癌的化合物的方法。该筛选方法的实施方案包括下列步骤a)使受试化合物与多肽或其等同物接触，其中所述多肽由C2093、B5860N或C6055编码；b)才企测多肽与受试化合物之间的结合活性；和c)选择与多肽结合的化合物。在本发明中，由C2093、B5860Ns或C6055s编码的多肽或其等同物可选自下组(l)包含选自下组的氨基酸序列的多肽SEQIDN0:2、4、6、130、132、134和136;(2)多肽，其包含选自下组的氨基酸序列SEQIDNO:2、4、6、130、132、134和136，或者与所述序列具有至少约80%同源性的序列；和(3)由多核普酸编码的多肽，所述多核苷酸在严格条件下与由选自下组的核苷酸序列组成的多核苷酸杂交SEQIDNO:l、3、5、129、131、133和135，其中所述多肽具有与由选自下组的氨基酸序列组成的多肽等同的生物活性SEQIDNO:2、4、6、130、132、134和136;用于筛选的本发明的多肽可以是重组多肽，也可以是源自天然的蛋白质，或其部分肽。与受试化合物相接触的本发明的多肽例如可以是纯化的多肽、可溶性蛋白质、与载体结合的形态或与其它多肽融合的融合蛋白。作为蛋白质的筛选方法，例如使用本发明的由C2093、B5860Ns或C6055s编码的多肽筛选与本发明的多肽结合的蛋白质的方法，可使用本领域冲支术人员公知的许多方法。这样的筛选可通过，例如免疫沉淀法，具体地以下述方式进行。通过将编码本发明的多肽的C2093、B5860Ns或C6055s基因插入外源基因表达载体，如pSV2neo，pcDNAI,pcDNA3.1，pCAGGS和pCD8，使之在宿主(例如动物)纟田胞等中表达。用于表达的启动子可以是通常使用的任何启动子，并包括，例如SV40早期启动子(RigbyinWilliamson(ed.),(1982)GeneticEngineering,vol.3.AcademicPress,London,83-141)、EF-a启动子(Kim"a/"Gene91:217-23(1990))、CAG启动子(NiwaW"/，(1991)Gene108:193-9)、RSVLTR启动子(Cullen，(1987)MethodsinEnzymology152:684-704)、SRa启动子(TakebeWa/.，(1988)MolCellBiol8:466-72)、CMV立即早期启动子(CMVimmediateearlypromoter)(SeedandAruffo,(1987)ProcNatlAcadSciUSA84:3365-9)、SV40后期启动子(GheysenandFiers,(1982)JMolApplGenet1:385-94)、月泉病毒后期启动子(Adenoviruslatepromoter)(Kaufmanez1a/.,(1989)MolCellBiol9:946-58)、HSVTK启动子等。可以根据任何方法将基因导入欲表达外源基因的宿主细胞，这些方法例如电穿孔法(Chu"a/.,(1987)NucleicAcidsRes15:1311-26)、磷酸钓法(ChenandOkayama,(1987)MolCellBiol7:2745-52)、DEAE葡聚糖法(Lopata&a/.,(1984)NucleicAcidsRes12:5707-17;SussmanandMilman,(1984)MolCellBiol4:1641-3)、月旨质转染(Lipofectin)法(DerijardB,"a/.，(1994)Cell76:1025-37;Lamb"a/.,(1993)NatureGenetics5:22-30:Rabindrane/^/.,(1993)Science259:230-4)等。通过将特异性已知的单克隆抗体的表位导入本发明的多肽的N末端或C末端，可以以包含单克隆抗体的识别位点的融合蛋白的形式表达用于本发明的筛选的多肽。也可以使用商业上可得到的表位-抗体系统(ExperimentalMedicine13:85-90(1995))。可以利用其多克隆位点表达与，例如P-半乳糖苷酶、麦芽糖-结合蛋白、谷胱甘肽-S-转移酶、绿色荧光蛋白(GFP)等的融合蛋白的载体是商业上可得到的。还报道了通过仅引入由几个到十几个氨基酸组成的小表位而制备的融合蛋白，其中本发明的用于筛选的多肽的特性不会因融合而改变。表位，如聚组氨酸(His标签)、流感病毒聚集体(influenzaaggregate)HA、人c-myc、FLAG、7K泡'1"生口月莫炎病毒4唐蛋白(Vesicularstomatitisvimsglycoprotein)(VSV-GP)、T7基因10蛋白(T7标签)、人单纯疱渗病毒糖蛋白(humansimpleherpesvimsglycoprotein)(HSV标签)、E标签(单克隆噬菌体上的表位)等，以及识别它们的单克隆抗体都可以用作表位-抗体系统来筛选能结合用于本发明的筛选的多肽的蛋白质(ExperimentalMedicine13:85-90(1995))。在免疫沉淀法中，向用合适的洗涤剂(detergent)制备的细月包裂解物中添加这些抗体，可以形成免疫复合物。所述免疫复合物由用于本发明的筛选的多肽、具有与该多肽结合的能力的多肽和抗体组成。除使用抗上迷表位的抗体之外，还可以使用抗用于本发明的筛选的多肽的抗体进行免疫沉淀，所述抗体可以如上所述制备。当所述抗体是一种小鼠IgG抗体时，可以通过例如蛋白ASepharose或蛋白GSepharose沉淀免疫复合物。如果将用于本发明的筛选的多肽制备成带有表位，如GST的融合蛋白，可使用与这些表位特异性结合的物质，例如谷胱甘肽-Sepharose4B,按照与使用抗用于本发明的筛选的多肽的抗体相同的方式形成免疫复合物。免疫沉淀可以根据或遵照，例如文献(HarlowandLane,Antibodies,511-52,ColdSpringHarborLaboratorypublications,NewYork(1988))中的方法进行。通常使用SDS-PAGE对免疫沉淀的蛋白进行分析，可以使用合适浓度的凝胶通过蛋白的分子量来分析结合的蛋白。由于采用常规染色法例如考马斯(Coomassie)染色或银染色难以检测与用于本发明的筛选的多肽结合的蛋白，因而可以通过下述方法改进所述蛋白的检测灵敏度在含有放射性同位素"S-曱硫氨酸或"S-半胱氨酸的培养基中培养细胞，在细胞中标记蛋白，和检测蛋白。在已知蛋白的分子量时，可以从SDS-聚丙烯酰胺凝胶直接纯化目标蛋白并测定其序列。作为使用多肽来筛选与本发明的多肽结合的蛋白质的方法，可以采用例如West-Western印迹分析(Skolnik&a/，Cell65:83-90(1991))。具体地i兌，可以通过下述方法获得能够结合用于本发明的筛选的多肽的蛋白质使用噬菌体载体(例如ZAP),由期望表达与本发明的多肽结合的蛋白质的细胞、组织、器官(例如，组织如睾丸)或者培养的细胞(例如HT1197、UMUC3、J82、HT1376、SW780、RT4PC3、DU145或HT1376)制备cDNA文库；使该蛋白在LB-琼脂糖(LB-agarose)上表达，将表达的蛋白固定在滤膜(filter)上，再使经纯化和标记的本发明的多肽与上述滤膜反应，然后根据标记来片全测表达与本发明的多肽结合的蛋白质的噬菌斑。利用生物素与抗生物素蛋白之间的结合，或者利用与用于本发明的筛选的多肽或融合于本发明的多肽的肽或多肽(例如GST)特异性结合的抗体，均可以对用于本发明的筛选的多肽进行标记。也可以采用使用放射性同位素或荧光等的方法。或者，在本发明的筛选方法的另一实施方案中，可以使用利用细胞的双杂合系统(two-hybridsystem)("MATCHMAKER双杂合系统'，、"哺乳动物MATCHMAKER双杂合测定试剂盒，，、"MATCHMAKER单杂合系统"(Clontech);"HybriZAP双杂合载体系统"(Stratagene);参照"DaltonandTreisman，Cell68:597-612(1992)","FieldsandSternglanz，TrendsGenet10:286-92(1994)")。在双杂合系统中，将用于本发明的筛选的多肽与SRF-结合区或GAL4-结合区融合，并在酵母细胞中表达。由预期表达与用于本发明的筛选的多肽结合的蛋白质的细胞制备cDNA文库，并使该文库在表达时与VP16或GAL4转录活化区i或(transcriptionalactivationregion)融合。然后将cDNA文库导入上述酵母细胞，并从检测为阳性的克隆分离出源自所述文库的cDNA(当在酵母细胞中表达可与用于本发明的筛选的多肽结合的蛋白质时，两者的结合能够激活报告基因，可以检出阳性克隆)。通过将上述分离的cDNA导入大肠杆菌并表达蛋白质，可以制备由该cDNA编码的蛋白质。就报告基因而言，除HIS3基因外，还可以使用例如Ade2基因、lacZ基因、CAT基因、萤光素酶基因等。合物。例如，可以将用于本发明的筛选的多肽固定于亲和层析柱的载体上，并将受试化合物加于该层析柱，所述受试化合物包含能与用于本发明的筛选的多肽结合的蛋白质。本说明书中的受试化合物可以是例如细胞提取物、细胞裂解物等。在将所述受试化合物上样后，对层析柱进行洗涤，并可制备出已与用于本发明的筛选的多肽结合的化合物。当受试化合物是一种蛋白时，分析获得的蛋白的氨基酸序列，基于该序列合成寡聚DNA，以该寡聚DNA为探针筛选cDNA文库，从而获得编码所述蛋白的DNA。在本发明中，可以将利用表面等离子体共振现象(surfaceplasmonresonancsphenomenon)的生物传感器(biosensor)用作对结合的化合物进行检测或定量的手段。当使用这类生物传感器时，而且只使用极少量的多肽且不需标记(例如BIAcore,Pharmacia),可将用于本发明的筛选的多肽和受试化合物之间的相互作用实时观察为表面等离子体共振信号。因此，可以使用生物传感器诸如BIAcore来评价用于本发明的筛选的多肽和受试化合物之间的结合。当固定化的用于本发明的筛选的多肽暴露于合成化合物、天然物质库或随机噬菌体肽展示文库时，筛选与之结合的分子的方法，以及基于组合化学技术使用高通量的筛选方法(Wrighton等，Science273:458-64(1996);Verdine,Nature384:11-13(1996);Hogan,Nature384:17-9(1996))，从而分离与用于本发明的筛选的蛋白质结合的蛋白质和化合物(包括激动剂和拮抗剂)是本领域技术人员公知的。或者，本发明—提供使用由C2093、B5860Ns或C6055s编码的本发明的多肽或其等同物筛选用于治疗或预防膀胱癌的化合物的方法，该方法包括以下步骤(a)使受试化合物与多肽或其等同物接触；(b)才全测步骤(a)的多肽或其等同物的生物活性；和(c)与不存在受试化合物的条件下测得的生物活性相比较，选择抑制所述多肽或其等同物的生物活性的化合物。本发明的C2093、B5860Ns或C6055s蛋白质具有促进膀胱癌细胞的细胞增殖的活性，因而可以使用该活性为指标，筛选抑制该活性的化合物。只要具有C2093、B5860Ns或C6055s蛋白质的生物活性，任何多肽均可用于筛选。所述生物活性包括人C2093、B5860Ns或C6055s蛋白质的细胞增殖活性。例如，可以使用人C2093、B5860Ns或C6055s蛋白质，也可以使用与这些蛋白质在功能上等同的多肽。因细胞的不同，所述多肽可以内源性或外源性表达。通过这种筛选分离的化合物是本发明的C2093、B5860Ns或C6055s多肽的激动剂或拮抗剂的候选物。术语"激动剂"指通过与本发明的多肽结合而活化其功能的分子。同样地，术语"拮抗剂"指通过与本发明的多肽结合而抑制其功能的分子。而且，通过这种筛选作为"拮抗剂"而分离的化合物是抑制用于本发明的筛选的多肽与分子(包括DNA和蛋白)在体内的相互作用的候选化合物。通过如下方法进行检测制备表达用于本发明的筛选的多肽的细胞，在存在受试化合物的条件下培养所述细胞，测定细胞增殖速度，测定细胞周期等，以及测定集落形成活性。在另一个实施方案中，本发明提供筛选用于治疗或预防膀胱癌的化合物的方法。如上详细描述，通过控制C2093、B5860Ns和/或C6055s基因的表达水平，可以控制膀胱癌的发病和进展。因而，通过以C2093、B5860Ns或C6055s基因的表达水平为指标进行筛选，可以鉴定能够用于治疗或预防膀胱癌的化合物。在本发明的上下文中，这样的筛选可包括例如以下步骤(aM吏受试化合物与细胞接触，其中所述细胞表达C2093、B5860Ns或C6055s基因中的一个或多个；和(b)与不存在受试化合物时检出的表达水平相比，选择降4氐C2093、B5860Ns或C6055s基因中的一个或多个的表达水平的化合物。表达一个或多个C2093、B5860Ns或C6055s基因中的至少一个的细胞，包括例如由膀胱癌建立的细胞系；这样的细胞可以用于本发明的上述筛选(例如HT1197、UMUC3、J82、HT1376、SW780、RT4和HT1376)。表达水平可以采用本领域技术人员熟知的方法进行评估。在本筛选方法中，可选择降低C2093、B5860Ns或C6055s基因的表达水平的化合物作为用于治疗或预防膀胱癌的候选物质。或者，本发明的筛选方法可以包括以下步骤a)使受试化合物与导入了载体的细胞接触，其中所述载体含有一个或多个标记基因的转录调控区及在该转录调控区的调控下表达的报告基因，其中所述一个或多个标记基因为C2093、B5860Ns或C6055s;b)测定该报告基因的表达水平或活性；和c)与不存在受试化合物时检出的该报告基因的表达水平或活性相比，选择降低该报告基因的表达水平或活性的候选化合物。合适的报告基因和宿主细胞是本领域公知的。使用标记基因的转录调控区可以制备筛选所需的报告子构建体。当本领域技术人员已知标记基因的转录调控区时，可以使用先前的序列信息来制备报告子构建体。当标记基因的转录调控区仍未鉴定时，可以基于标记基因的核苷酸序列信息从基因组文库中分离含有转录调控区的核苷酸区段。可用于结合蛋白的支持物(support)的实例包括不溶性多糖，如琼脂糖、纤维素和葡聚糖；及合成树脂，如聚丙烯酰胺、聚苯乙烯和硅；可优选使用由上述材料制备的商业上可得到的珠子和板(例如多孔板，生物传感器芯片等)。使用珠子时，可以将其填入柱子。蛋白质与支持物的结合可根据常规方法进行，这些方法例如化学结合或物理吸附。可选地，蛋白质可通过特异性识别它的抗体而与支持物结合。此外，还可以利用抗生物素蛋白和生物素来进行多肽与支持物的结合。蛋白质之间的结合在緩冲液中进行，緩沖液例如但不限于磷酸盐緩冲液和Tris缓冲液，只要所述缓冲液不抑制蛋白之间的结合即可。本发明中，利用表面等离子体共振现象的生物传感器可用作检测或定量已结合的蛋白的装置。使用这样的生物传感器(例如BIAcore,Pharmacia)时，仅使用少量的多肽，而且无需标记，即可将蛋白质之间的相互作用实时观察为表面等离子体共振信号。可选地，可以对C2093、B5860N或C6055多肽进行标记，结合蛋白质的标记可用于检测或测定已结合的蛋白质。具体地，对一种蛋白质进行预标记之后，在受试化合物存在的条件下使标记的蛋白与其它蛋白接触，然后在洗涤之后根据标记检测或测定已结合的蛋白质。本发明的方法中，可以使用标记物质来标记蛋白质，所迷标记物质如放射性同位素(例如3H、14C、32P、33P、3《、'251、13'1)、酶(例如碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶、卩-半乳糖苷酶、(3-葡糖苷酶)、荧光物质(例如，异硫氰酸荧光素(FITC)、罗丹明)和生物素/抗生物素蛋白。当用放射性同位素标记蛋白质时，可通过液体闪烁法(liquidscintillation)进行检测或测定。可选地，通过加入该酶的底物，用吸收光度计(absorptiometer)检测或测定底物的酶促变化(如产生颜色)，从而可以检测或测定用酶标记的蛋白质。此外，将荧光物质用作标记的情况中，可利用焚光光度计检测或测定已结合的蛋白质。在本发明的筛选中使用抗体的情况下，所述抗体优选利用上述标记物质之一进行标记，并基于标记物质进行4全测或测定。或者，也可以将抗C2093、B5860Ns或C6055s多肽的抗体用作第一抗体(primaryantibody),使用以标记物质标记的第二抗体对其进^i全测。此外，本发明的筛选中与蛋白结合的抗体，可使用蛋白G或蛋白A柱进行检测或测定。在本发明的筛选方法中可以使用任何受试化合物，这些化合物包括但不限于细胞提取物、细胞培养物上清、发酵微生物的产物、海洋生物提取物、植物提取物、纯化或粗制蛋白、肽、非肽化合物、合成的小分子化合物以及天然化合物。本发明的受试化合物可以使用本领域已知的组合文库法中多种方法中的任一种荻得，所述方法包括(l)生物学文库，(2)空间定位平4亍固相或5容液相文库(spatiallyaddressableparallelsolidphaseorsolutionphaselibraries),(3)需要重叠合法(deconvolution)的合成文库法，(4)"一珠一化合物(onebeadonecompound)，，文库法和(5)使用亲和层析选择的合成文库法。其中，使用亲和层析选择的生物学文库法仅限于肽文库，而其它四种方法适用于肽，非肽寡聚体或化合物小分子文库(Lam(1997)AnticancerDrugDes.12:145)。合成分子文库的方法的举例见于本
技术领域：
(DeWitt"a/.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:6909-13;Erb"a/.(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA91:11422-6;Zuckermann"a/.(1994)J.Med.Chem.37:2678-85;Cho"a/.(1993)Science261:1303-5;CarellWa/.(1994)Angew.Chem.Int.Ed.Engl.33:2059;Carelle"/.(1994)Angew.Chem.Int.Ed.Engl.33:2061;Gallop"a/.(1994)J.Med.Chem.37:1233-51)。化合物文库可存在于溶液中(参见Houghten(1992)Bio/Techniques13:412-21),和珠子上(Lam(1991)Nature354:82-4)，芯片(Fodor(1993)Nature364:555-6)，细菌(美国专利5,223,409),孢子(美国专利5,571,698;°5，403,484和5,223,409),质粒(Cull等(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:1865-9)或噬菌体(ScottandSmith(1990)Science249:386-90;Delvin(1990)Science249:404-6;Cwirla等(19卯)Proc.Natl.Acad.Sci.USA87:6378-82;Felici(1991)丄Mol.Biol.222:301-10;美国专利申"i青2002103360)。通过筛选分离的化合物可作为药物开发的候选物，其中所述药物抑制标记基因的表达或由标记基因编码的蛋白质的活性，并可用于治疗或预防膀胱癌。此外，还包括化合物中的部分结构通过添加、缺失和/或取代而发生转由标记基因编码的蛋白质的活性。将通过本发明的方法分离的化合物作为药物施用于人或其它哺乳动物时，所述其它哺乳动物包括，但不限于小鼠、大鼠、豚鼠(guinea-pig)、兔、猫、狗、羊、猪、牛、猴、狒狒(baboon)、黑猩猩(chimpanzee)时，分离的化合物可以直接给药，或者可以利用已知的药物制备方法配制成剂型。关于本发明的药物组合物和配制物、以及它们的制造和使用方法，将在下文中详细说明。评估患膀胱癌的受试者的预后本发明还提供评估患有BLC的受试者的预后情况的方法，所述方法包括将受试细胞群体中的一种或多种BLC相关基因的表达与疾病阶段i普中的源自患者的参照细胞群体中的相同BLC相关基因的表达相比较的步骤。通过比较受试细胞群体与参照细胞群体中一种或多种BLC相关基因的基因表达，或比较源自受试者的受试细胞群体中基因随时间的表达图式，可以评估受试者的预后情况。例如，与正常对照相比一种或多种上调的BLC相关基因，如表4中所列的那些基因的表达上升，或与正常对照相比一种或多种下调的BLC相关基因，如表5中所列的那些基因的表达下降，表示预后不佳。相反地，一种或多种表4-5中所列的BLC相关基因的表达与正常对照相似，表示受试者预后比较良好。优选地，可以通过比较选自表4和5中所列基因的一种或多种基因的基因表达模式来评估受试者的预后情况。试剂盒本发明还包括BLC检测试剂，例如能够特异性结合或鉴定一种或多种BLC核酸的核酸(诸如与BLC核酸的一部分互补的寡核苷酸序列)或者能够与由BLC核酸编码的一种或多种蛋白质结合的抗体。所述检测试剂可以以试剂盒的形式包装在一起。例如，可以将检测试剂分别包装在不同的容器中，例如核酸或抗体(可与固体基质结合，或与使其同基质结合的试剂分开包装)、对照试剂(阳性和/或阴性)和/或可检测标记。试剂盒内还可以包括实施所述测定的说明(如书面说明书、磁带、VCR、CD-ROM等)。试剂盒的试验方式可以是本领域已知的Northern杂交或夹心ELISA。例如，可以将BLC检测试剂固定于固体基质如多孔条(porousstrip)上，以形成至少一个BLC检测位点。多孔条的测定区或检测区可以包括多个位点，每个位点都含有核酸。测试条也可以含有阴性和/或阳性对照的位点。或者，对照位点可以设置于与测试条不同的条上。任选地，不同的检测位点可以含有不同量的固定化核酸，即第一个检测位点量较多，随后的位点量较少。添加受试样品后，显示可测信号的位点数目提供了样品中存在的BLC的量的定量指标(quantitativeindication)。检测位点的形状可以是任何适宜的可检测的形状，一般为跨越测试条宽度的条状或点状。或者，试剂盒还包含含有一种或多种核酸的核酸基质阵列(nucleicacidsubstrate)。阵列上的核酸可特异性地鉴定由表4-5中所列的BLC相关基因表示的一种或多种核酸序列。通过与阵列测试条或芯片的结合水平可以鉴定由表4-5中所列的BLC相关基因表示的2,3,4,5,6,7,8,9，10，15,20，25,40,50或更多种核酸的表达。基质阵列可以存在于例如固体基质上，所述固体基质如美国专利5,744,305(其全部内容并入本文作为参考)中描述的"芯片"。阵列和核酸混合物(。luralities):本发明还包括含有一种或多种核酸的核酸基质阵列。阵列上的核酸特异性地对应由表4-5中所列的BLC相关基因所示的一种或多种核酸序列。通过检测与阵列结合的核酸，可鉴定由表4-5中所列的BLC相关基因表示的2,3,4，5,6,7，8，9,10,15，20,25,40,50或更多种核酸的表达水平。本发明还包括独立的(isolated)多种核酸的混合物(即两种或两种以上核酸的混合物)。核酸可以存在于液相或固相中，例如固定于如硝酸纤维素膜的固体支持物上。核酸混合物包含由表4-5中所列的BLC相关基因表示的一种或多种核酸。在多个实施方案中，核酸混合物包含由表4-5中所列的BLC相关基因表示的2,3,4,5,6,7,8,9,10,15,20，25,40,50或更多种核酸。抑制膀胱癌的方法
技术领域：
：本发明还提供通过降低一种或多种上调的表4中所列的BLC相关基因的表达(或其基因产物的活性)、或者提高一种或多种下调的表5中所列的BLC相关基因的表达(或其基因产物的活性)来治疗或减轻受试者中的BLC症状的方法。可以将适当的治疗化合物预防性或治疗性地施用于患有BLC或处于BLC发病危险中(或对BLC易感)的受试者。采用标准的临床方法或者通过检测一种或多种表4-5中所列的BLC相关基因的异常表达水平或其基因产物的异常活性，可以鉴定出上述受试者。在本发明的上下文中，适当的治疗剂包括，例如细胞周期调控和细胞增殖的抑制剂。本发明的治疗方法包括如下步骤与获得BLC细胞相同的组织类型的正常细胞相比，提高在BLC细胞中其表达降低的一种或多种基因("下调的"或"低表达的"基因)的表达和/或其基因产物的活性。在这些方法中，使用有效量的化合物对受试者进行治疗，所述化合物可提高受试者中一种或多种低表达的(下调的)基因的量。给药可以是全身给药或局部给药。适宜的治疗化合物包括低表达基因的多肽产物，其生物活性片段，和编码低表达基因且具有允许在BLC细胞中表达的表达调控元件的核酸；例如可提高BLC细胞内源性的此类基因的表达水平的物质(即，其上调一种或多种低表达基因的表达水平)。施用这样的化合物可以消减受试者膀胱癌细胞中一个或多个异常低表达基因的影响，并改善受试者的临床状态。可选地，本发明的治疗方法包括如下步骤降低在膀胱癌细胞中表达异常升高的一种或多种基因("上调的"或"过表达的"基因)的表达和/或其基因产物的活性。可以按照本领域已知的几种方法中的任何一种来抑制表达。例如，通过给受试者施用能抑制或拮抗一个或多个过表达基因的表达的核酸可以抑制表达，所述核酸例如能够破坏一个或多个过表达基因的表达的反义寡核芬酸或小干扰RNA。在其它实施方式中，本发明的治疗方法包括降低C2093、B5860Ns或C6055s基因的表达或功能的步骤。在这些方法中使用有效量的化合物对受试者进行治疗，所述化合物可降低受试者中一种或多种过表达基因(即C2093、B5860Ns或C6055s基因)的表达和/或活性。给药可以是全身给药或局部给药。治疗化合物包括可降低BLC细胞内源性的此类基因的表达水平的化合物(即，下调过表达基因的表达的化合物)。施用这样的治疗化合物可以消减受试者细胞中异常过表达基因的影响，并预期改善受试者的临床状C2093、B5860Ns或C6055s基因表达的抑制可以采用本领域已知的几种方法中的任何一种，这些方法中包括给受试者施用抑制或拮抗基因表达的核酸。可将破坏基因表达的反义寡核苷酸、siRNA或核酶用于抑制基因表达。如上所述，可以使用对应C2093、B5860Ns或C6055s基因的核苷酸序列的反义寡核苷酸来降低C2093、B5860Ns或C6055s基因的表达水平。具体地说，本发明的反义寡核苷酸可以通过与由C2093、B5860Ns或C6055s基因编码的多肽或与之对应的mRNA中的任何一个结合而发挥作用，从而抑制基因的转录或翻译，促进mRNA降解和/或抑制基因所编码的蛋白质的表达，最终抑制C2093、B5860Ns或C6055s蛋白质的功能。通过与合适的基质(basematerial)混合，可以将反义寡核苷酸及其衍生物制成外用制剂，如搽剂(liniment)或罨剂(poultice),并用于本发明的治疗或预防膀胱癌的方法，其中所述合适的基质对衍生物是惰性的(inactive)。抑制一种或多种过表达基因的基因产物的核酸还包括小干扰RNA(siRNA),所述RNA含有编码C2093、B5860Ns或C6055s基因的核苷酸序列的有义链核酸与反义链核酸的组合。将siRNA导入细胞的标准技术。可以用于本发明所述的治疗或预防，其包括以DNA为RNA转录的模板的技术。构建siRNA以使单转录物(singletranscript)具有来自靶基因的互补的反义序列和有义序列，例如为发夹结构(hairpin)。反义多核苦酸、小干扰RNA及核酶如上所述，使用对应于表4中所列的BLC相关基因的核苷酸序列的反义核酸，可以降低基因的表达水平。对于膀胱癌的治疗，对应于表4中所列的在膀胱癌中上调的BLC相关基因的反义核酸是有用的。具体地说，本合而发挥作用，从而抑制基因的转录或翻译，促进mRNA降解和/或抑制表4中所列的BLC相关基因所编码的蛋白质的表达，由此抑制蛋白质的功能。本发明包括与SEQIDNO:3的核苷酸序列内的任意位点杂交的反义寡核芬酸。具体地，本发明提供反义多核苷酸，该多核苷酸可与含有SEQIDNO:3的核苷酸序列988-1842，即B5860NV1序列的特异区域的核酸杂交。这种反义寡核苷酸优选针对SEQIDNO:3的核苷酸序列的至少约15个连续的核苦酸。上述的反义寡核苷酸更优选在上述至少15个连续的核苷酸中含有起始密码子。反义寡核苷酸的衍生物或修饰产物也可以用作反义寡核苷酸。所述修饰产物的例子包括低级烷基膦酸酯(loweralkylphosphonate)修饰如甲基膦酸酯型(methyl-phosphonatetype)或乙基膦酸酯型(ethyl-phosphonate-type),石危代磷酸酯(phosphorothioate)修饰以及磷酰胺(phosphoroamidate)修饰。如本说明书中使用的，术语"反义核酸'，包括与靶序列完全互补的核香酸和具有一个或多个核芬酸错配的核苦酸，只要该反义核酸能与靶序列特异性杂交。例如，本发明的反义核酸包括那些在至少15个连续核苷酸的范围(span)内，具有至少约70%或更高、优选至少约80%或更高、更优选约至少90%或更高、还更优选至少约95。/。或更高的同源性的多核苷酸。所述同源性可使用本领域已知的算法确定。此外在本发明中，所述反义寡核苷酸的衍生物或修饰产物也可以用作反义寡核苷酸。所述修饰产物的例子包括但不限于低级烷基膦酸酯修饰，如甲基膦酸酯型(methyl-phosphonatetype)或乙基膦酸酯型(ethyl-phosphonate-type)，硫代磷酸酯修饰以及磷酰胺修饰。所述反义多核苷酸可用作分离或检测编码本发明的多肽的DNA的探针，或者用于扩增的引物。本发明的反义核酸通过如下方法作用于产生由BLC相关标记基因编码的蛋白质的细胞将本发明的反义核酸与编码该蛋白质的DNA或mRNA结合，抑制其转录或翻译，促进mRNA降解并抑制蛋白质的表达，由此抑制蛋白质的功能。通过与合适的基质混合，可以将本发明的反义核酸制成外用制剂，如搽剂(liniment)或罨剂(poultice)，其中所述合适的基质对核酸是惰性的。并且根据需要，通过添加赋形剂、等渗剂(isotonicagents)、增溶剂、稳定剂、防腐剂、镇痛剂等，可以将本发明的反义核酸配制成例如片剂、粉末、颗粒、胶嚢、脂质体胶嚢、注射剂、溶液、滴鼻剂和冻干剂。这些剂型可通过如下的公知方法制备。给患者施用本发明的反义核酸，可以直接将其施于患处，也可以将其输入血管以叶吏其到达患处。使用反义封固介质(antisense-mountingmedium)可以提高持久性和膜通透性。所述反义封固介质的例子包括但不限于脂质体、聚-L-赖氨酸、脂质、胆固醇、脂质转染试剂或它们的衍生物。本发明的反义核酸衍生物的剂量，可以根据患者的状况适当调整，并以所需的量^f吏用。例如，可以施用的剂量范围为0.1至100mg/kg,优选O.l至50mg/kg。本发明的反义核酸抑制本发明蛋白质的表达，因而可以用于抑制本发明蛋白质的生物活性。此外，含有本发明的反义核酸的表达抑制剂也可以用于抑制本发明的蛋白质的生物活性。述基因表达上调的原因例如细胞的恶性转化。在靶细胞中，siRNA与对应于表4中所列的一个BLC相关基因的转录物结合，导致细胞产生的蛋白质减少。寡核苷酸的长度为至少IO个核苷酸，可以与天然存在的转录物等长。优选寡核苷酸的长度为75、50、25个核苷酸或更短。最优选寡核苷酸的长度为约19-25个核苷酸。本发明的反义核酸包括经修饰的寡核苷酸。例如，使用硫代寡核苷酸可以赋予寡核芬酸核酸酶抗性。而且，可以使用针对标记基因的siRNA以降低标记基因的表达水平。本说明书中，术语"siRNA，，指能阻止靶mRNA翻译的双链RNA分子。可以采用将siRNA导入细胞的标准技术，这其中包括以DNA为RNA转录的模板的技术。在本发明的上下文中，siRNA含有针对上调标记基因，如表4中所列的BLC相关基因的有义核酸序列和反义核酸序列。构建siRNA以使其单转录物具有来自靶基因的互补的反义序列和有义序列，例如为发夹结构。如表4中所列的BLC相关基因的siRNA与靶基因杂交，并由此通过与正常单链mRNA转录物结合，并藉此干扰蛋白质的翻译和表达，从而减少或抑制由表4中所列的BLC相关基因编码的多肽的产生。因此，本发明的siRNA分子可以根据其在严紧条件下与表4中所列的mRNA或cDNA特异性杂交的能力来定义。就本发明而言，术语"杂交"或"特异性杂交，，可以互换使用，它们均是指2个核酸分子在"严紧的杂交条件"下杂交的能力。短语"严紧的杂交条件"在前述内容中已经说明，并且指如下条件，在该条件下核酸分子，通常在核酸的复杂混合物中，与其靶序列杂交，但不与其它序列发生可4全测程度的杂交(butnotdetectablytoothers叫uences)。严紧条件依赖于序列，并且在不同情况中是不同的。较长序列在较高温度下特异性杂交。关于核酸杂交的全面指南见于Tijssen,rec/zm々wMo/ecw/arS/o/ogy—外Z)n.(i,zfl/7.oww〃/zjVwc/e/ciVo6&s,"Overviewofprinciplesofhybridizationandthestrategyofnucleicacidassays"(1993)。一4殳i也，选4奪的严紧条件为比在限定的离子强度、pH下指定序列的热解链温度(Tm)低约5-10°C。Tm是有50%的与靶标互补的探针在平衡状态下与靶序列杂交(在限定的离子强度、pH和核酸浓度下)的温度(当靶序列过量时，Tm温度下，有50%的探针在平衡状态下被占用)。此外，通过添加去稳定剂，如曱酰胺也可以形成严紧条件。对选择性或特异性的杂交而言，阳性信号为至少2倍背景，优选为IO倍背景杂交。示例性的严紧杂交条件可为如下在50%曱酰胺、5xSSC、1%SDS中于42。C保温，或者在5xSSC、1。/。SDS中于65。C保温，然后用0.2xSSC、0.1%SDS于50°C进行洗涤。在本发明的上下文中，siRNA的长度优选为500、200、100、50或25个核苷酸或更短。更优选地，siRNA的长度为约19-约25个核苷酸。°为了增强siRNA的抑制活性，可以将核苷酸"u"添加到靶序列的反义链的3，端。待添加的"u，，的数目为至少约2,通常为约2-约IO,优选为约2-约5。添加的"u"在siRNA的反义链的3，端形成单链。如表4所列的BLC相关基因的siRNA,可以以能与mRNA转录物结合的形式直接导入细胞。在这些实施方案中，本发明的siRNA分子一般如用于反义分子的上述描述进行修饰。而其它的修饰也是可能的，例如胆固醇结合的siRNA显示改善的药理学性质。SongWa/.A^wwM^/.9:347-51(2003):或者，编码siRNA的DNA也可以携带于载体中。例如，通过将BLC相关性基因靶序列克隆到表达载体中来制备上述载体，其中所述表达载体具有可操作连接的以两条链均能表达(通过DNA分子的转录)的方式位于该靶序列侧翼的调控序列(Lee，N.S.,"a/.,(2002)NatureBiotechnology20:500-5.)。其为BLC相关性基因的mRNA的反义链的RNA分子由第一启动子(例如所克隆DNA3'的启动子序列)转录，其为BLC相关性基因的mRNA的有义链的RNA分子由第二启动子(例如所克隆DNA5，的启动子序列)转录。所述有义链和反义链在体内杂交，从而产生用于沉默BLC相关性基因的siRNA构建体。或者，可以利用两个构建体制备siRNA构建体的有义链和反义链。克隆的BLC相关性基因可编码具有二级结构，例如发夹的构建体，其中单转录物具有来自靶基因的互补反义序列和有义序列。为了形成发夹环结构，可在有义序列和反义序列之间放置由任意核苷酸序列组成的环序列(loopsequence)。因此，本发明还提供具有通式5，-[A]-[B]-[A，]-3，的siRNA,其中[A]为核糖核苷酸序列，其对应于与表4中所列的mRNA或cDNA特异性杂交的序列。在优选的实施方式中，[A]为对应于选自表4的基因的序列的核糖核苷酸序列，为由约3-约23个核芬酸组成的核糖核芬酸序列，和[A，]是由[A]的互补序列组成的核糖核苷酸序列。[A]区与[A，]区杂交，然后形成由[B]区组成的环(loop)。所述环序列的长度优选为3-23个核苷酸。所述突环序列，例如可以选自由如下序列组成的组(http:〃www.ambion.com/techlib/tb/tb—506.html)。此外，由23个核苦酸组成的环序列也提供活性siRNA(Jacque，J,M.,"a/.，(2002)Nature418:435-8.)。CCC,CCACC或CCACACC:Jacque,J.-M.,"a/.,(2002)Nature418:435-8.UUCG:Lee,N.S.,"a/.，(2002)NatureBiotechnology20:500-5.Fruscoloni，P.,".，(2003)Proc.Natl.Acad.Sci.USA100(4):1639-44.UUCAAGAGA:Dykxhoorn,D.M.,"a/.,(2002)NatureReviewsMolecularCellBiology4:457-67.例如，具有本发明的环结构的优选siRNA如下所示。在下面的结构中，环序列可以选自下组CCC,UUCG，CCACC,CCACACC和UUCAAGAGA。优选的环结构是UUCAAGAGA(DNA中为"ttcaagaga")。适当的siRNA的核苷酸序歹'J可4吏用人人Ambion网站(http:〃www.ambion.com/techlib/misc/siRNA—finder,html)可4寻到的siRNAi殳计计算机程序来设计。所述计算机程序基于如下规程选择核苷酸序列用于siRNA合成。选择siRNA靶位点1.从目标转录物的AUG起始密码子开始向下游扫描，寻找AA二核苷酸序列。记录每个AA的出现及其3'侧邻近的19个核苷酸作为潜在的siRNA靶位点。Tuschl等在(1999)Gew&sDev13(24):3191-7中，不推荐针对5'和3'非翻译区(UTRs)和邻近起始密码子的区域(75个碱基之内)设计siRNA，因为上述区域可能富含调控蛋白结合位点。UTR结合蛋白和/或翻译起始复合物可干扰与siRNA内切核酸酶复合物的结合。2.将所述潜在靶位点与人基因组数据库进行比较，不考虑与其它编码序列显著同源的任何靶序列。可采用BLAST(可见于NCBI服务器www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)进行同源性搜索。3.选择合格的靶序列用于合成。在Ambion,可优选沿待评价的基因的长度选择几个靶序列。BLC相关基因序列侧翼的调节序列可以相同也可以不同，但应能够独立地、或者以时间性或空间性方式调控这些基因表达。通过将BLC相关基因的模板分别克隆到载体上，siRNA得以在细胞内转录，其中所述载体含有例如来自小核RNA(snRNA)U6的RNA聚合酶III转录单元或人HIRNA启动子。为了将载体导入细胞，可以使用转染增强剂(transfection-enhancingagent)。FuGENE(Rochediagnostices),Lipofectamin2000(Invi加gen)，Oligofectamin(Invitrogen)和Nucleofactor(WakopureChemical)可以用作转染增强剂。根据标准方法，在体外检测C2093、B5860Ns或C6055smRNA的多个部分的寡核苷酸或者与这些部分互补的寡核苷酸的降低肿瘤细胞中(例如使用HT1197,UMUC3,J82,HT1376,SW780,RT4或HT1376膀胱癌细胞系)C2093、B5860Ns或C6055s产生的能力。使用C2093、B5860Ns或C6055s特异性抗体或采用其它检测策略检测到与不存在候选siRNA组合物的情况下培养的细胞相比，与所述候选siRNA组合物接触的细胞中C2093、B5860Ns或C6055s转录物产物减少。对于在体外的基于细胞的试验或无细胞试-睑中减少C2093、B5860Ns或C6055s产生的序列，进一步试验其对细胞生长的抑制作用。对于在体外的基于细胞的试验或无细胞试验中抑制细胞生长的序列，在大鼠或小鼠中进行体内试-睑，以确认C2093、B5860Ns或C6055s产生的减少和患有恶性新生物的动物中肿瘤细胞生长的减少。本发明还包括含有靶序列的核酸序列的双链分子，所述靶序列例如SEQIDNO:1的核苷酸2543-2561(SEQIDNO:21)，SEQIDNO:3的核苷酸2491-2509,SEQIDNO:5的核苷酸1639-1657(SEQIDNO:25)，SEQIDNO:129的核苦酸1905-1923,SEQIDNO:131的核苷酸1873-1891,SEQIDNO:133的核苷酸1921-1939或者SEQIDNO:135的核苷酸2001-2019(SEQIDNO:144)。在本发明中，将包含有义《连和反义《连的双链分子导入表达C2093、B5860Ns或C6055s基因的细胞时可以抑制所述基因的表达，其中所述双链分子由有义链和反义链相互杂交而形成，其中所述有义链包含对应于SEQIDNO:21、25或144的核糖核芬酸序列，而所述反义链包含与所述有义链互补的核糖核苷酸序列。在本发明中，当分离的核酸为RNA或其衍生物时，应在核苷酸序列中将碱基"t"替换为"u"。如本说明书中使用的，术语"互补的，，指核酸分子的核苦酸单位之间形成Watson-Crick或Hoogsteen碱基配对，而术语"结合"指两种核酸或化合物、或者相关核酸或化合物、或者其组合之间的物理或化学相互作用。互补的核酸序列在适宜条件下杂交，以形成几乎不含或不含错配的稳定双链体。此外，本发明的分离的核苷酸的有义链和反义链可以通过杂交形成双链核香酸或发夹环结构。在优选的实施方案中，这样的双链体的每10个配对中出现的错配不超过1个。在特别优选的实施方案中，双链体的链完全互补，即这样的双链不含^"配。核酸分子少于6319个核苷酸(对于SEQIDNO:1),5318个核普酸(对于SEQIDNO:3)，3851个核苷酸(对于SEQIDNO:129)，3819个核苦酸(对于SEQIDNO:131),3851个核苷酸(对于SEQIDNO:133)或3819个核苷酸(对于SEQIDNO:135)。例如，核酸分子的长度为500、200、75个核苷酸或更短。本发明还包括包含一个或多个本说明书中描述的核酸的载体，以及包含该载体的细胞。对于针对C2093、B5860Ns或C6055s的siRNA或者编码这些siRNA的DNA而言，本发明的分离的核酸是有用的。将这些核酸用于siRNA或编码该siRNA的DNA时，有义链优选为长于约19个核苷酸，更优选长于约21个核苷酸。本发明的反义寡核苷酸或siRNA抑制本发明的多肽的表达，因而可以用于抑制本发明的多肽的生物学活性。并且，含有本发明的反义寡核苷酸或siRNA的表达抑制剂可以用于抑制本发明的多肽的生物学活性。因此，含有本发明的反义寡核苷酸或siRNA的组合物可用于治疗膀胱癌。此外，为了增强siRNA的抑制活性，可将核芬酸"u"添加到靶序列的反义链的3，端。要添加的"u"的数目为至少约2个，通常为约2-约10个，优选为约2-约5个。添加的"u"在siRNA的反义链的3'端形成单链。并且，含有本发明的反义寡核苷酸或siRNA的表达抑制剂可用于抑制本发明的多肽的生物活性。因此，含有本发明的反义寡核苷酸或siRNA的组合物可用于治疗细胞增殖性疾病，如膀胱癌。此夕卜,本发明提供抑制本发明的C2093、B5860Ns或C6055s多肽的表达的核酶。通常，核酶分为大核酶和小核酶。大核酶已知是切割核酸的磷酸酯键的酶。与大核酶反应后，反应位点由5，-磷酸基团和3'-羟基基团组成。大核酶进一步分为(l)催化鸟苷在5，-剪接位点的酯基转移作用的I组内含子RNA;(2)催化经由套索样(lariat-Iike)结构经过两步反应自我剪接的II组内含子RNA;和(3)通过水解在5'位点切割tRNA前体的核糖核酸酶P的RNA组件。另一方面，小核酶与大核酶相比更小(约40bp),并且小核酶切割RNA产生5，-羟基和2，-3，环状磷酸酯。锤头型(Hammerheadtype)核酶(Koizumi"a/.,(1988)FEBSLett228:228-30)和发夹型核酶(Buzayan，(1986)Nature323:349-53;KikuchiandSasaki,(1991)NucleicAcidsRes19:6751-5)都包括在小核酶中。设计和构建核酶的方法是本领域中已知的(参见Koizumi""/.,(1988)FEBSLett228:228-30;Koizumi"a/.,(1989)NucleicAcidsRes17:7059-71;KikuchiandSasaki,(1991NucleicAcidsRes19:6751-5)。因而，抑制本发明的多肽的表达的核酶也可以根据其序列信息(SEQIDNO:l,3,5，129,131,133或135)和这些常规方法来构建。针对C2093、B5860Ns或C6055s转录物的核酶，可抑制C2093、B5860Ns或C6055s蛋白的过表达，并可抑制这些蛋白的生物活性。因此，这些核酶可以用于膀胱癌的治疗或预防。抗体或者，通过施用与基因产物结合或以其它方式抑制基因产物功能的化合物，来抑制在BLC中过表达的基因的一种或多种基因产物的功能。例如，所述化合物是与一种或多种过表达的基因产物结合的抗体。本发明涉及抗体特别是针对由上调的标记基因所编码的蛋白的抗体、或所述抗体的片段的用途。如本说明书中使用的，术语"抗体"指一种具有特异性结构的免疫球蛋白分子，其仅与用于合成该抗体的抗原(即上调标记的基因产物)或与其紧密相关的抗原相互作用(即结合)。本发明提供与本发明的多肽结合的抗体。具体地说，本发明提供与抗原决定簇结合的抗体，所述抗原决定簇包含SEQIDNO:4的氨基酸序列304-588,其为B5860NV1的特异序列。可以以任意形式，如单克隆或多克隆抗体使用本发明的抗体，并包括用本发明的多肽免疫动物如兔获得的抗血清、所有种类的多克隆抗体和单克隆抗体，人抗体和通过基因重组制备的人源化抗体。作为抗原使用以获得抗体的本发明的多肽，可源自任何动物物种，但优选源自哺乳动物，如人、小鼠或大鼠等，更优选源自人。人源多肽可以由本发明公开的核苷酸或氨基酸序列获取。根据本发明，用作免疫抗原的多肽可以是完整的蛋白质，也可以是蛋白质的部分肽。部分肽可以包含例如选自B5860NV1的特异序列(来自SEQIDNO:4的304_588的位置)的部分氨基酸序列。在本说明书中，抗体定义为与本发明的多肽的全长和/或片段反应的蛋白质。可将编码本发明的多肽或其片段的基因插入已知的表达载体，然后用该载体转化如本说明书所述的宿主细胞。可通过任意标准方法从宿主细胞内或细胞外回收所需多肽或其片段，然后可将其用作抗原。此外，表达多肽的全细胞或其裂解物，或者化学合成的多肽均可用作抗原。可以用抗原免疫任意哺乳动物，但优选考虑与用于细胞融合的亲本细胞的相容性。通常使用啮齿目(Rodentia)，兔形目(Lagomorpha)或灵长类(Primates)动物。啮齿目动物包括例如小鼠、大鼠和仓鼠(hamster)。兔形目动物包括例如家兔。灵长类动物包括例如狭鼻猿(Catarrhini)(东半球猴(oldworldmonkey))如食蟹猴(Macacafascicularis)、恒河猴(rhesusmonkey)、狒狒(sacredbaboon)和黑猩程(chimpanzee)。用抗原免疫动物的方法是本领域中已知的。腹腔注射或皮下注射抗原是免疫动物的标准方法。更具体地，可以在适量的磷酸盐緩冲盐水(PBS)、生理盐水等中稀释和悬浮抗原。如果需要，将抗原悬液与适量的标准佐剂如福氏(Freund's)完全佐剂混合，制成乳液，然后施用于哺乳动物。其后优选每4至21天施用数次与适量福氏不完全佐剂混合的抗原。也可使用合适的载体进行免疫。如上述进行免疫后，用标准方法检验血清中所需的抗体量的增加。可以按如下方法制备针对本发明的多肽的多克隆抗体从经免疫的哺乳动物(该哺乳动物经;险测其血清中所需的抗体增加)收集血液，并通过任意常规的方法从所述血液中分离血清。多克隆抗体包括含有多克隆抗体的血清，并且可以从所述血清中分离含有该多克隆抗体的级分。使用例如与本发明的多肽偶联的亲和柱，并进一步用蛋白A或蛋白G柱纯化该级分可从仅识别本发明的多肽的级分中制备免疫球蛋白G或M。为了制备单克隆抗体，从用抗原免疫的哺乳动物收集免疫细胞，在如上所述检查血清中所需抗体水平升高，并进行细胞融合。用于细胞融合的例如哺乳动物骨髓瘤细胞，更优选具备获得的特性以便用药物选择融合细胞的骨髓瘤细胞。才艮4居已^口的方法，》口Milstein等(GalfreandMilstein,MethodsEnzymol73:3-46(1981))的方法可将上述免疫细胞和骨髓瘤细胞进行融合。在标准选择培养基如HAT培养基(含次黄噤呤，氨基蝶呤和胸苷的培养基)中进行培养，可以选出由细胞融合所得的杂交瘤。通常，细胞培养是在HAT培养基中连续进行数天至数周，这段时间足以使除了所需的杂交瘤细胞之外的所有其它细胞(非融合的细胞)死亡。然后，进行标准有限稀释(standardlimitingdilution)筛选并克隆生产所需抗体的杂交瘤纟田月包。多肽、表达多肽的细胞或其裂解物免疫人淋巴细胞，如EB病毒感染的淋巴细胞。然后，使免疫后的淋巴细胞与能够无限分裂的源自人的骨髓瘤细胞，如U266融合，以获得产生所需的可与所述多肽结合的人抗体的杂交瘤细胞(特开昭63-17688)。然后将获得的杂交瘤细胞移植入小鼠腹腔，并抽取腹水。获得的单克隆抗体可以通过例如石克酸4妄沉淀、蛋白A或蛋白G柱、DEAE离子交换层析或偶联了本发明的多肽的亲和柱进行纯化。本发明的抗体不仅可以用于纯化和检测本发明的多肽，还可以作为本发明的多肽的激动剂和拮抗剂的候选物。此外，该抗体可以用于与本发明的多肽相关的疾病的抗体治疗。当将获得的抗体施用于人体时(抗体治疗)，优选使用人抗体或人源化抗体以降低免疫原性。例如，可以用选自多肽、表达多肽的细胞或其裂解物的抗原免疫具有人抗体基因文库(repertory)的转基因动物。然后，从该动物收集产生抗体的细胞，将其与骨髓瘤细胞融合以获得杂交瘤，从该杂交瘤可制备针对所述多肽的人抗体(参见WO92-03918，W094-02602,WO94-25585,W096-33735和WO96-34096)。或者，可以通过癌基因使产生抗体的免疫细胞，如经免疫的淋巴细胞无限增殖化(immortalize),并用于制备单克隆抗体。如此获得的单克隆抗体也可以利用基因工程技术重组制备(参见例如BorrebaeckandLarrick，(1990)TherapeuticMonoclonalAntibodies,publishedintheUnitedKingdombyMacMillanPublishersLTD)。例如，可以/人免疫细月包，如产生抗体的杂交瘤或经免疫的淋巴细胞来克隆编码抗体的DNA,将该DNA插入合适的载体并转入宿主细胞，从而制备重组抗体。本发明还4是供如上所述制备的重组抗体。此外，本发明的抗体可以是抗体片段或修饰的抗体，只要其可以结合一种或多种本发明的多肽。例如，所述抗体片段可以是Fab、F(ab，)2、Fv或将来自H链和L链的Fv片段通过合适的接头连接而成的单链Fv(scFv)(Hustona/.,(1988)ProcNatlAcadSciUSA85:5879-83)。更具体地，可以用酶如木瓜蛋白酶或胃蛋白酶处理抗体以产生抗体片段。或者，还可以构建编码该抗体片段的基因，将其插入合适的表达载体，并在适合的宿主细胞中表达(参见例如Co"a/"(1994)JImmunol152:2968-76;BetterandHorwitz,(1989)MethodsEnzymol178:476-96;PluckthunandSkerra,(1989)MethodsEnzymol178:497-515;Lamoyi,(1986)MethodsEnzymol121:652-63;Rousseaux&a/"(1986)MethodsEnzymol121:663-9;BirdandWalker,(1991)TrendsBiotechnol9:132-7》抗体可以通过与各种分子如聚乙二醇(PEG)接合进行修饰。本发明提供这样的修饰抗体。可通过将抗体进行化学修饰来获得修饰抗体。这些修饰方法是本领域常规的。可选地，可获得本发明的抗体作为在源自非人抗体的可变区及源自人抗体的恒定区之间的嵌合抗体，或者作为含有源自非人抗体的互补决定区(CDR)、源自人抗体的框架区(FR)及恒定区的人源化抗体。所述抗体可利用已知技术制备。人源化可通过用啮齿类的CDRs或CDR序列取代人抗体的相应序列的方式进4亍(见例如Verhoeyen(1988)5Wee239:1534-1536)。因而，这样的人源化抗体是嵌合抗体，其中基本上小于完整人可变结构域的区域已被来自非人物种的相应序列取代。除人框架区和恒定区外还包含人可变区的完整人抗体也是可以利用的。这样的抗体可利用本领域已知的各种技术制备。例如，体外方法包括使用在噬菌体上展示的人抗体片段的重组文库(例如，Hoogenboom&Winter,(1992)J.Mol.Biol.227:381-8)。类似地，可通过将人免疫球蛋白基因座引入转基因动物，例如内源性免疫球蛋白基因部分或完全失活的小鼠，来制备人抗体。该方法描述于例如美国专利Nos.6,150,584;5,545,807;5,545,806;5,569,825;5,625，126;5,633,425;5,661,016。可以将如上获得的抗体纯化至均质。例如，可根据用于普通蛋白质的分离和纯化方法进行抗体的分离和纯化。例如，通过适当选择和组合使用柱层析如亲和层析、过滤、超滤、盐析、透析、SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电H焦，可以分离4元体(Antibodies:ALaboratoryManual.EdHarlowandDavidLane,(1988)ColdSpringHarborLaboratory),4旦并不局卩艮于此。蛋白A柱和蛋白G柱可以用作亲和4i例示性的可使用的蛋白A柱包括例如HyperPOROS和SepharoseF.F.(Pharmacia)。除亲和层析外，例示性的层析包括例如离子交换层析、疏水层析、凝胶过滤、反相层析、吸附层析等(StrategiesforProteinPurificationandCharacterization:ALaboratoryCourseManual.EdDanielR.Marshaketal.,(1996)ColdSpringHarborLaboratoryPress)。可以通过液相层析，如HPLC和FPLC进行层析过程。例如，可以采用吸光度测定、酶联免疫吸附试验(ELISA)、酶免疫测定(EIA)、放射免疫测定(RIA)和/或免疫荧光检测来测定本发明抗体的抗原结合活性。在ELISA中，将本发明的抗体固定在平板上，将本发明的多肽施加到平板上，再施加含有所需抗体的样品(如产生抗体的细胞的培养上清液或纯化的抗体)。然后施加用酶(如i威性磷酸酶)标记的识别第一抗体的第二抗体，并保温平板。接下来在洗涤后，在平板中加入酶底物如磷酸对硝基苯酯，测定吸光度以评价样品的抗原结合活性。多肽的片段，如C-末端或N-末端片段可以用作抗原来评价抗体的结合活性。可以使用BIAcore(Pharmacia)评价本发明抗体的活性。上述方法允许通过将本发明的抗体暴露于假定含有本发明的多肽的样品，并;f全测或测定由抗体和多肽形成的免疫复合物，来^^测或测定本发明的多肽。因为本发明所述的检测或测定多肽的方法可特异性地检测或测定多肽，所以该方法可应用于使用多肽的各种实验。定向于癌细胞中发生的特异性分子变化的癌症疗法已经通过下述抗癌药的临床开发和管理机构的批准被认定为有效用于治疗晚期乳腺癌的曲妥单抗(trastuzumab)(Herceptin),用于治疗慢性骨髓性白血病的曱磺酸伊马替尼(imatinibmethylate)(Gleevec),用于治疗非小细胞肺癌(NSCLC)的gefitinib(Iressa)和用于B细胞淋巴瘤和外膜细胞(mantlecell)淋巴瘤的美罗华(rituximab)(抗CD20mAb)(CiardielloFandTortoraG.(2001)ClinCancerRes.;7(10):2958-70.Review.;SlamonDJ,a/.，(2001)NEnglJMed.;344(11):783-92.;RehwaldU,"a/.,(2003)Blood.;101(2):420-4.;FangG,"a/.,(2000).Blood,96,2246-53.)。这些药物临床上是有效的，并且比传统抗癌剂具有更好的耐受性，因为它们仅仅靶向转化的细胞。因此，这些药物不仅改善了癌症患者的存活率和生活质量，而且证明了分子靶向癌症疗法理念的合理性。另外，当靶向药物与标准化疗组合使用时，可以增强标准化疗的效力(GianniL.(2002).Oncology,63Suppl1,47-56.;KlejmanA，"a/.,(2002).Oncogene,21,5868-76.)。因此，未来的癌症治疗将很可能涉及将常头见药物与针对肿瘤细胞不同特性如血管生成(angiogenesis)和侵入力(invasiveness)的耙物特异性试剂组合。这些调节方法可以离体(exv/vo)、体外(例如通过在药剂的存在下培养细胞)或体内(例如通过给受试者施用药剂)进行。所述方法包括作为抵制蛋白质或蛋白质的组合、或者核酸分子或核酸分子的组合。可以用拮抗(即降低或抑制)一种或多种过表达基因的活性的治疗剂来治疗疾病和病症，所述疾病和病症的特征在于基因和基因产物的表达水平或生物活性(相对于未患有疾病或病症的受试者)分别有所增加。可以治疗性或预防性地施用拮抗活性的治疗剂。因此，可以用于本发明上下文中的治疗剂包括例如(i)过表达或低表达的一种或多种基因的多肽或其类似物、衍生物、片段或同源物；(ii)抗过表达基因或基因产物的抗体；(iii)编码过表达或低表达的一种或多种基因的核酸；(iv)反义核酸或"功能障碍(dysfunctional)"的核酸(即，由于在一个或多个过表达基因的核酸内的异源插入所致)；(v)小干扰RNA(siRNA);或(vi)调节剂(即，改变过表达或低表达多肽与其结合配对物(bindingpartner)之间的相互作用的抑制剂、激动剂和拮抗剂)。将功能障碍的反义分子用于通过同源重组来"敲除"多肽的内源性功能(参见例如Capecchi,(1989)Science244:1288-92)。以生物活性下降(相对于未患有疾病或病症的受试者)为特征的疾病和病症，可以使用提高活性(即，对其活性的激动剂)的治疗剂进行治疗。可以以治疗或预防的方式施用上调活性的治疗剂。可以利用的治疗剂包括但不限于多肽(或其类似物、衍生物、片段或同源物)或提高生物利用度(bioavailability)的;敫动剂。通过获取患者组织样品(例如从活检组织)，并在体外检测其RNA或肽水平、表达的肽(或表达有所改变的基因的mRNA)的结构和/或活性，来定量肽和/或RNA,从而可以容易地检测出水平的上升或下降。本领域公知的方法包括f旦不限于免疫测定法(例如在Westem印迹分析、免疫沉淀后进行十二烷基磺酸钠(SDS)聚丙烯酰胺凝胶电泳、免疫细胞化学等)和/或检测mRNA表达的杂交试验(例如Northern试验、点印迹、原位杂交等)。预防性给药在出现疾病的明显临床症状之前进行，以阻止疾病或病症的出现或者延迟其进程。本发明的疗法可以包括使细胞与调节剂接触的步骤，所述调节剂可调节一种或多种差异表达基因的基因产物的活性。蛋白质活性调节剂的例子包括但不限于核酸、蛋白质、这些蛋白质的天然存在的同源配体(naturally-occurringcognateligands)、肽、肽沖莫拟物及其它小分子。例如，合适的试剂可以刺激一种或多种差异性低表达基因的一种或多种蛋白质的活性。针对膀胱癌的预防接种(vaccinate)本发明还涉及治疗或预防受试者中膀胱癌的方法，该方法包括如下步骤对所述受试者施用疫苗，其中所述疫苗包含由选自表4中所列的BLC相关基因(即上调基因)的核酸编码的多肽，该多肽的免疫活性片段或者编码该多肽或其片段的多核香酸。施用所述多肽在受试者中诱导抗肿瘤免疫。为了诱导抗肿瘤免疫，应给有需要的受试者施用由选自表4中所列的BLC相关基因的核酸编码的多肽，该多肽的免疫活性片段或者编码该多肽或其片段的多核苷酸。多肽或其免疫活性片段可以用作针对BLC的疫苗。在一些情况下，蛋白质或其片段可以以结合于T细胞受体(TCR)或由抗原呈递细胞(APQ,如巨噬细胞、树突细胞(DC)或B细胞呈递的形式进行施用。由于DC具有强抗原呈递能力，所以在APC中使用DC是最优选的。在本发明中，针对BLC的疫苗是指具有如下能力的物质将其接种于动物后诱导抗胂瘤免疫。根据本发明，由表4中所列的BLC相关基因编码的多肽或其片段被认为是HLA-A24或HLA-A*0201限制性表位肽，其可诱应。因此，本发明还包括使用多肽诱导抗肿瘤免疫的方法。一般而言，抗肿瘤免疫包括诸如以下的免疫应答-诱导抗肿瘤的细胞毒性淋巴细胞，-诱导识別肿瘤的抗体，和-诱导抗肿瘤细胞因子的产生。因此，当某蛋白质接种动物后诱导任一种所述免疫反应时，确定该蛋白质具有抗肿瘤免疫诱导效果。由蛋白质诱导的抗肿瘤免疫可以通过在体内或体外观察宿主中的免疫系统针对该蛋白质的应答而进行检测。例如，检测细胞毒性T淋巴细胞的诱导的方法是公知的。具体地，进胞。以抗原特异性方式应答于APC所呈递抗原的T细胞由于该抗原的刺激而分化为细胞毒性T细胞(或细胞毒性T淋巴细胞；CTL)，然后增殖(这称为T细胞活化)。因此，一些肽的CTL诱导可以通过将该肽经由APC呈递于T细胞和检测CTL的诱导来进行评估。此外，APC具有激活CD4+T细胞，CD8+T纟田月包，巨噬细胞，嗜酸粒细胞(eosinophil)和NK细胞的功效。由于CD4+T细胞和CD8+T细胞在抗肿瘤免疫中也是重要的，可使用这些细胞的激活效应作为指标来评价肽的抗肿瘤免疫诱导作用。使用树突细胞(DC)作为APC评价CTL诱导作用的方法在本领域中是众所周知的。在APC中，DC是具有最强CTL诱导作用的代表性APC。在该方法中，首先使受试多肽与DC接触，然后使该DC与T细胞接触。在与DC接触后，如果检测出具有针对目标细胞的细胞毒性作用的T细胞，则表示该受试多肽具有诱导细胞毒性T细胞的活性。CTL的抗肿瘤活性可以例如采用"Cr标记的肿瘤细胞的溶解(lysis)作为指标来进行检测。或者，采用3&胸苷摄取活性或LDH(乳糖脱氢酶)释放作为指标来评价肿瘤细胞损伤程度的方法也是众所周知的。除DC外，外周血单核细胞(PBMC)也可用作APC。已才艮道通过在存在GM-CSF和IL-4的情况下培养PBMC来增强CTL的诱导。相似地，已显示通过在存在钥孔戚血蓝素(KLH)和IL-7的条件下培养PBMC来诱导CTL。可以认为通过这些方法确定为具有CTL诱导活性的受试多肽，是具有DC激活效应和随后的CTL诱导活性的多肽。因此，请导针对肺瘤细胞的CTL的多肽可用作抗肿瘤的疫苗。此外，通过与所述多肽接触而获得诱导针对肺瘤的CTL的能力的APC也可用作抗肿瘤的疫苗。此外，通过APC呈递多肽抗原而获得细胞毒性的CTL也可用作抗胂瘤的疫苗。利用由APC和CTL产生的抗肺瘤免疫的这些肿瘤治疗方法称为细胞免疫疗法。一般来说，当使用多肽用于细胞免疫疗法时，已知通过组合多种具有不同结构的多肽并使其与DC接触来增加CTL诱导的效率。因此，当用蛋白质片段刺激DC时，使用多种类型的片段的混合物是有利的。可选地，多肽对抗肿瘤免疫的诱导可以通过观察针对肺瘤的抗体产生的诱导来进行确认。例如，当用多肽免疫的试验动物中诱导产生抗该多肽的抗体并且这些抗体抑制胂瘤细胞生长时，所述多肽可视为具有诱导抗肿瘤免疫的能力。施用本发明的疫苗可以诱导抗肿瘤免疫，而该抗肿瘤免疫的诱导能够治疗和预防BLC。抗癌治疗或对癌症发病的预防可以包括任何下述步骤诸如癌性细胞生长的抑制，癌症的退化(involution)以及癌发生的抑制。癌症的治疗或预防还包括患有癌症的个体死亡率和发病率降低、血液中肿瘤标记物水平减少、癌症伴发的可检测症状的缓解等。所述治疗性和预防性效果优选是统计学上显著的。例如，在观察中显著性水平为5%或更低，在所述观察中将疫苗针对细胞增殖性疾病的治疗性或预防性效果与未施用疫苗的对照进行比较。例如，可将Student'st-检验，Mann-WhitneyU-检验或ANOVA用于统计学分析。上述具有免疫活性的蛋白质或编码该蛋白质的载体可与佐剂组合。佐剂是指当与具有免疫活性的蛋白质共同(或相继)施用时能增强针对该蛋白质的免疫应答的化合物。例示性的佐剂包括但不限于霍乱毒素(choleratoxin)、沙门氏菌毒素(salmonellatoxin)、明风(alum)等。此外，本发明的疫苗可适宜地与药物可接受的载体组合。这样的载体的例子包括但不限于无菌水、生理盐水、磷酸緩沖液、培养液等。此外，疫苗可根据需要包含稳定剂，悬浮剂，防腐剂，表面活性剂等。疫苗可全身或局部地进行施用。疫苗施用可以通过单次给药进行，或者通过多次给药来强化(boost)。当使用APC或CTL作为本发明的疫苗时，可以例如通过离体方法治疗或预防肺瘤。更具体地，可以收集接受治疗或预防的受试者的PBMC，使细胞与多肽在离体条件下接触，诱导APC或CTL，然后将该细胞施用于受试者。也可通过将编码多肽的载体在离体条件下导入PBMC中来诱导APC。体外诱导的APC或CTL可以在施用前进行克隆。通过克隆和培养具有高靶细胞破坏活性的细胞，可以更有效地实施细胞免疫治疗。此外，以该方式分离的APC和CTL不仅可以用于针对提供细胞的受试者进行细胞免疫治疗，还可以用于针对来自其它个体的相似类型的肿瘤进行细胞免疫治疗。此外，本发明提供治疗或预防细胞增殖性疾病诸如癌症的药物组合物，其包含药物有效量的本发明的多肽。该药物组合物可以用于提高抗肿瘤免疫。C2093、B5860Ns或C6055s的正常表达限定在睾丸内。因而，对这些基因的抑制不会给其它器官造成不良影响。因此，C2093、B5860Ns或C6055s多肽优选用于治疗细胞增殖性疾病，特别是膀胱癌。而且，由于在癌细胞中特异性表达的蛋白质的肽片段显示诱导抗癌免疫应答，因此也可以将C2093、B5860Ns或C6055s的肽片l殳用于治疗或预防细月包增殖性疾病如膀胱癌的药物组合物中。本发明中，以足够诱导抗肿瘤免疫的剂量施用多肽或其片^殳，剂量范围为0.1mg-10mg，优选0.3mg-5mg,更优选0.8mg-1.5mg。反复进行施用。为诱导抗肿瘤免疫，例如可以每2周分4次施用1mg肽或其片段。此外，编码C2093、B5860Ns或C6055s的多核苷酸或者它们的片段可以用于产生抗肿瘤免疫。可以将这样的多核苷酸并入表达载体以在待治疗的受试者中表达C2093、B5860Ns或C6055s或者它们的片段。因此，本发明包含诱导抗肿瘤免疫的方法，其中给患有细胞增殖性疾病如膀胱癌或处于发生此类疾病的危险中的受试者施用编码C2093、B5860Ns或C6055s的多核苷酸或者它们的片段。用于抑制BLC或恶性BLC的药物组合物本发明提供用于治疗或预防膀胱癌的组合物，其含有通过本发明的筛选方法选择的任意化合物。当为治疗细胞增殖性疾病(例如膀胱癌)而将通过本发明的筛选方法分离的化合物作为药物施用于人或其它哺乳动物，其包括但不限于小鼠、大鼠、豚鼠、兔、猫、犬、羊、猪、牛、猴子、狒狒、黑猩猩时，分离的化合物可以直接施用，或者可以利用已知的药物制备方法配制成剂型。例如，根据需要，药物可以作为糖衣片剂、胶囊剂、酏剂和微胶嚢口服施用；或者用水或任何其它药物可接受的液体配制成无菌溶液或悬浮液，以注射剂的形式非口服施用。例如，可以将化合物以一般接受的药物配制方式(dmgimplementation)所需的单位剂型、与药理学可接受的载体或介质混合在一起，所述载体或介质具体为无菌水、生理盐水、植物油、乳化剂、悬浮剂、表面活性剂、稳定剂、调味剂、赋形剂(excipient)、々某介物(vehicle)、防腐剂、粘合剂等。这些制剂中有效成分的量给出(make)可获得的指定范围内的合适剂量。能够混合到片剂和胶嚢中的添加剂的例子包括但不限于，粘合剂如明胶、玉米淀粉、黄蓍胶(tragacanthgum)和阿拉伯胶；赋形剂例如结晶纤维素；溶胀剂例如玉米淀粉、明胶和海藻酸(alginicacid);润滑剂例如硬脂酸镁；增甜剂例如蔗糖、乳糖或糖精；和调味剂例如薄荷(pepperaiint)、Gcm//zen'a油和樱桃。当单位剂型为胶嚢剂时，上述成分中还可以包括液体载体，例如油。注射用无菌组合物可以使用媒介物例如注射用蒸馏水，按照标准的药物配制方式进行配制。生理盐水、葡萄糖以及包含佐剂，如D-山梨醇、D-甘露糖、D-甘露醇和氯化钠的其它等渗液体，可用作注射用水溶液。这些可以与合适的增溶剂组合使用，所述增溶剂例如醇，特别是乙醇、多元醇例如丙二醇和聚乙二醇，非离子表面活性剂，例如Polysorbate80(TM)和HCO-50。芝麻油或大豆油是油质液体的实例，所述油质液体可以与苯甲酸千酯或苯曱醇组合使用作为增溶剂，还可与緩冲液，如磷酸盐缓沖液和乙酸钠缓冲液；镇痛剂，如盐酸普鲁卡因；稳定剂，如苯曱醇、酚；以及抗氧化剂配制在一起。制备的注射剂可以装入到合适的安瓿(ampoule)中。可以利用本领域技术人员所公知的方法给患者施用本发明的药物组合物(pharmaceuticalcompound),例如通过动月永内、,争月永内或经皮注射，以及鼻内、肌内或口服给药施用于患者。施用剂量和方法根据患者的体重和年龄以及施用方法而变化；不过，本领域技术人员能够按常规选择它们。如果所述化合物由DNA编码，可将该DNA插入到基因治疗载体中，并施用该载体以进行治疗。施用的剂量和方法因患者的体重、年龄和症状而异，但是选择和优化这些参数在本领域技术人员的能力范围之内。本发明中，适宜的药物制剂包括适于口服、直肠、鼻、局部(包括口腔或舌下)、阴道或非消化道(包括肌内、皮下和静脉内)施用的制剂，以及适于通过吸入或吹入(insufflation)施用的制剂。优选静脉内施用。制剂可以任选包装在独立的剂量单位(dosageunit)中。适于口服施用的药物制剂包括胶嚢剂、扁嚢剂(cachet)或片剂，它们各含有一定量的活性成分。适合的制剂还包括粉末、颗粒，溶液，悬浮液或乳液。活性成分可以任选以大丸剂(bolus)、药糖剂(electuary)或糊剂(paste)的形式施用。用于口服给药的片剂和胶嚢剂可含有常规赋形剂诸如结合剂、填充剂、润滑剂、崩解剂或湿润剂。片剂可通过压缩或模制来制备，其中任选含有一种或多种配方成分。压缩片剂可通过如下方法制备将活性成分以自由流动的形式(如粉末或颗粒)任选地与结合剂、润滑剂、惰性稀释剂、润滑剂、表面活性剂和/或分散剂混合，并在适当的机器中进行压缩。模制片剂可通过如下方法制备在适当的机器中对利用惰性液体稀释剂湿润的粉末化合物的混合物进行模制。所述片剂可根据本领域已知的方法进行包覆(coated)。口服液体制备物可以是例如水性或油性的悬浊液、溶液、乳液、糖浆或酏剂的形式，或者也可以作为干燥产物提供，在使用前用水或其它适宜媒介物制成。所述液体制备物可含有常规添加剂诸如悬浮剂，乳化剂，非水性媒介物(可包括食用油)和/或防腐剂。片剂可任选地配制以提供其中活性成分的緩释或控释。片剂的包装中可以包含每月服用的一片药物。适于非消化道施用的制剂包括水性和非水性的无菌注射溶液，其中任选地含有抗氧化剂、緩沖剂、抑菌剂(bacteriostat)和使得制剂与目标受体的血液等张的(isotonic)溶质；以及水性和非水性的无菌悬浮液，其中含有悬浮剂和/或增稠剂。所述制剂可以以单位剂量或多次剂量容器提供，例如密封的安瓿和小瓶；还可以在冷冻-千燥(冻干的)条件下保存，这样仅需要恰在使用前添加无菌液体载体例如盐水、注射用水。可选地，可提供所述制剂用于连续输注(continuousinfusion)。即配即用的注射溶液和悬浮液可由前述的无菌粉末、颗粒及片剂的类型制备。适于直肠给药的制剂包括栓剂(suppository)及标准载体如可可脂或聚乙二醇。适于口内局部给药，例如口腔或舌下给药的制剂包括4走剂(lozenge)和软锭剂(pastille),其中锭剂在调味基质，如蔗糖和阿拉伯胶(acacia)或黄蓍胶中包含活性成分，而软锭剂在基质，如明胶和甘油或蔗糖和阿拉伯胶中包含活性成分。鼻内给药时，本发明的化合物可以用作液体喷雾剂、可分散粉末，或以滴剂(drop)的形式。滴剂可用水性或非水性基质配制，该基质中也含有一种或多种分散剂、增溶剂或悬浮剂。吸入给药时，可以由吹入器、雾化器、气溶胶包装(pressurizedpack)或其它输送气溶胶喷雾的便利装置方便地输送化合物。气溶胶包装可含有适宜的喷射剂，如二氯二氟甲烷、三氯氟曱烷，二氯四氟乙烷、二氧化碳或其它适宜气体。在加压气溶胶的情况下，可通过提供输送计量量(meteredamount)的阀门来确定剂量单位。可选地，通过吸入或吹入给药时，化合物可以是干粉组合物的形式，例如该化合物与适宜粉末基质(如乳糖或淀粉)的粉末混合物。粉末组合物可以以单位剂型提供，这些剂型例如胶囊、药筒(cartridge)、凝胶(gelatin)或发泡包(blisterpack),借助吸入器或吹入器，可由上述剂型施用所述粉末。其它的制剂包含可释放治疗剂的可植入装置及粘性贴片(adhesivepatches)。需要时，可以采用适于緩释活性成分的上述制剂。药物组合物中还可以含有其它活性成分，诸如抗微生物剂，免疫抑制剂和/或防腐剂。应当理解除上述具体提及的成分外，本发明的制剂可含有本
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对于所述制剂类型常规的其它试剂，例如适于口服给药的制剂可以含有调味剂。举例来说，当向标准成年人(体重60kg)口服给药时，虽然根据其症状存在一些差异，但与本发明的多肽结合并调节其活性的化合物的剂量为约0.1mg-约100mg每天，优选为约1.0mg-约50mg每天，更优选为约1.0mg-约20mg每天。当以注射剂形式向标准成年人(体重60kg)非胃肠道给药时，虽然根据患者、靶器官、症状和给药方法存在一些差异，但静脉内注射约0.01mg-约30mg每天，优选约O.lmg-约20mg每天，更优选约O.lmg-约10mg每天的剂量是合适的。而且，在其它动物的情况下，可以按换算为60kg体重的量施用。优选的单位剂量制剂如下所述含有有效剂量或其适当部分的活性成分。对于前述的各种情况，可以以约0.1-约250mg/kg每天的剂量范围口服或通过注射施用所述组合物，例如多肽和有机化合物。成人的剂量范围通常为约5mg-约17.5g/天，优选为约5mg-约10g/天，更优选为约100mg-约3g/天。片剂或其它以分散单元提供的单位剂型可适宜地含有以这样的剂量或者作为多个这样的剂量有效的量，例如含有约5mg-约500mg,更通常为约100mg-约500mg。所用剂量依赖于多种因素，包括受试者的年龄和性别，治疗的确切疾患及其严重程度。此外，给药途径也依赖于病症及其严重程度而变化。然而无论怎样，本领域技术人员都能在考虑上述因素的基础上常规地计算出合适的最佳剂量。此外，本发明提供用于治疗或预防膀胱癌的药物组合物，其含有抑制C2093、B5860Ns或C6055s基因表达的有效成分。这样的有效成分包括针对C2093、B5860Ns或C6055s基因的反义多苷酸、siRNA或核酶，或者所述反义多核苦酸、siRNA或核酶的衍生物，如表达载体。siRNA的核芬酸序列可以按与前述相同的方式进行^1计。而且，也可以按与前述相同的方式选择C2093、B5860Ns或C6055smRNA的各个部分的寡核苷酸和与之互补的寡核苷酸。在哺乳动物细胞中抑制表达的C2093、B5860Ns或C6055ssiRNA寡核苦酸的例子包括分别包含SEQIDNO:21、25和144的輩巴序列。SEQIDNO:25的靶序列是2种B5860N转录物即B5860NV1和B5860NV2之间所共有的，因此，包含SEQIDNO:25作为有义链的siRNA可以抑制B5860NV1和B5860NV2转录物两者的表达。SEQIDNO:144的把序列是4种C6055转录物即MGC34032、Genbank登录号No,AK128063、C6055V1和C6055V2之间所共有的，因此，包含SEQIDNO:144作为有义链的siRNA可以抑制全部的MGC34032、Genbank登录号No.AKl28063、C6055V1和C6055V2转录物的表达。在本发明中，当核酸序列为RNA或其衍生物时，应将核苷酸序列中的碱基"t"替换为"u"。可以以能与mRNA转录物结合的形式将siRNA直接导入细胞。或者，可以以与使用针对C2093、B5860N或C6055的siRNA相同的方式，将编码siRNA的DNA包含在载体中。此外，为了形成发夹环结构，可在有义序列和反义序列之间放置由任意核苷酸序列组成的环序列。因此，本发明还提供具有通式5，-[A]画[B]扁[A，]-3，的siRNA。如上所述，在该式中，其中为核糖核苦酸序列，其对应于与C2093、B5860N或C6055的mRNA或cDNA特异性杂交的序列，为由约3-约23个核苷酸组成的核糖核苦酸序列，且[A，]是由[A]的互补序列组成的核糖核苷酸序列。在本发明的siRNA中，为了提高siRNA的抑制活性，可以将核苷酸"u"添加到[A，]的3，端。添加的"u"的数目至少为约2个，通常为约2-约10个，优选为约2-约5个。而且，由23个核苷酸组成的环序列也可以提供活性siRNA(Jacque，丄-M.,"a/.,(2002)Nature418:435-438.)。例如，本发明的具有发夹结构的优选siRNA如下所示。在下面的结构中，环序列可以选自下组CCC，UUCG,CCACC,CCACACC和UUCAAGAGA。优选的环序列是UUCAAGAGA(DNA中为"ttcaagaga")。适于在本发明的上下文中使用的例示性发夹siRNA包括序列)5，-gugaagaagugcgaccgaa-[B]-uucggucgcacuucuucac-3，(SEQIDNO:24),靶序列)5，-ccaaaguuccguagucuaa-[B]-uuagacuacggaacuuugg-3'(SEQIDNO:28)和靶序列)5'-gttgcagttacagatgaag陽[B]-cttcatctgtaactgcaac-3'(SEQIDNO:147)。通过与合适的基质混合，可以将这些活性成分制成外用制剂，如搽剂或罨剂，其中所述合适的基质对衍生物(derivative)是惰性的。并且根据需要，通过添加赋形剂、等渗剂(isotonicagents)、增溶剂、稳定剂、防腐剂、镇痛剂等，可以将这些活性成分配制成例如片剂、粉末、颗粒、胶嚢、脂质体胶嚢、注射剂、溶液、滴鼻剂和冷冻干燥剂。这些剂型可以按常规方法制备。通过直接将活性成分施于患处(ailingsite),或通过将其输入血管以使其到达患处而将活性成分给予患者。也可使用封固剂(mountingmedium)来提高持久性和膜通透性。封固剂的例子包括脂质体、聚-L-赖氨酸、脂质、胆固醇、脂质转染试剂或它们的衍生物。本发明的这种组合物的剂量可以根据患者的身体状况(condition)适当调整，并按所需的量使用。例如，可以施用的剂量范围为0.1-100mg/kg，优选0.1-50mg/kg。本发明的另外的实施方式为用于治疗和预防膀胱癌的组合物，该组合物含有抗由C2093、B5860Ns或C6055s基因编码的多肽的抗体或可与该多肽结合的抗体的片段。当向标准成年人(体重60kg)口服给药时，虽然根据症状存在一些差别，但用于治疗或预防膀胱癌的抗体或其片段的剂量为约0.1mg-约100mg每天，优选为约1.0mg-约50mg每天，更优选为约1.0mg-约20mg每天。当以注射剂形式向标准成年人(体重60kg)非消化道给药时，虽然根据患者的状况、疾病症状和给药方法而存在一些差别，但静脉内注射约O.Olmg-约30mg每天，优选约O.lmg-约20mg每天；更优选约O.lmg-约10mg每天的剂量是合适的。同样地，在其它动物的情况下，可以按换算为60kg体重的量施用。以下的实施例中将描述本发明的各个方面，但其并非意欲限制权利要求书中所述的本发明的范围。以下的实施例，将对BLC细胞中差异表达的基因的鉴定与表征进行说明。除非另外限定，本说明书中使用的全部技术术语和科学术语均与本发明所属
技术领域：
的普通技术人员一般理解的含义相同。尽管与本说明书中的所述类似或等同的方法和材料均可用于实施或检验本发明，但以下描述了合适的方法和材料。本说明书中引用的任何专利、专利申请和出版物均并入作为参考。实施例材料与方法患者、细胞系、组织样品和新辅助化疗人膀胱癌细胞系HT1197、UMUC3、J82、HT1376、SW780和RT4获自ATCC。所有的细胞均在合适的培养基中进行培养，即对于HT1197、UMUC3、J82和HT1376使用含O.lmM必需氨基酸(Roche)、lmM丙酮酸钠(Roche)、0.01mg/ml胰岛素(Sigma)的EMEM(Sigma,St.Louis,MO);对于HBLIOO和COS7<吏用Dulbecco改进的Eaglei杏养基(Invitrogen,Carlsbad,CA);对于RT-4使用McCoy's5a(Sigma);对于SW780使用L-15。每种培养基都添加有10。/。胎牛血清(Cansera)和1。/。抗生素/抗真菌溶液(antimycoticsolution)(Sigma)。于37°C,在不含C02的湿润空气的气氛中维持SW780细胞。于37。C,在含5%0)2的湿润空气的气氛中维持其它细胞系。在每位患者4是供书目的知情同意(informedconsent)后，获取由外科手术切除的膀胱癌的组织样品，并获fof目应的临床信息。选4奪已通过组织学确定为膀胱移行细胞癌的总共33个癌样本(女性9人、男性24人；除一人(BC01025)年龄不详外，年龄范围在53-T7岁，年龄中值为66.5岁)(表l)用于本研究。根据UICCTNM分类判断临床病期(clinicalstage)。我们只加入希望接受4艮治性膀胱切除术的无结节转移的T2aN0M0-T3bN0M0的患者，且这些患者之前未接受过放射性治疗。要求参与者没有肾功能、肝功能和血液机能的重度异常，且其ECOG病期(performancestatus，PS)判定为^2。(表l)受试患者<table>tableseeoriginaldocumentpage76</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage77</column></row><table>在进行新辅助化学疗法前的活体检验时，由各患者取3-5片癌组织。立即将这些样品埋入TissueTekOCT介质(Sakura,Tokyo，Japan),冷冻并于-80。C保存。使用恒冷切片机(cryostat)(Sakura,Tokyo,Japan)将冷冻组织切成8pm切片，然后用苏木精(hematoxylin)和伊红(eosin)进行染色以便组织学检查。使用具有脉沖紫夕卜窄束聚焦激光(pulsedultravioletnarrowbeam-focuslaser)的EZ-cutsystem按生产商的规程选择性地富集用于本发明人的实验的膀胱癌细胞。所有患者均经胸部X射线、腹部和骨盆的计算机断层摄影术(CT)和核》兹共振成像一全查，并确认未发生淋巴结转移和远端转移。RNA提取和基于T7的RNA扩增如前所述(KitaharaO，"a/.,(2001)CancerRes;61:3544-9)从显微切割的(microdissect)癌细胞的各群体提取总RNA。为了确保RNA的品质，将由各病例的残留组织提取的总RNA在变性琼脂糖凝胶上进行电泳，通过存在核糖体RNA条带来确认品质。总RNA提取和基于T7的RNA扩增，除使用RNeasyMicroKits(QIAGEN,Valencia,CA,USA)之外，还可以按之前的描述(OkabeH,"a/.,(2001)CancerRes;61:2129-37)进行。经两轮RNA扩增后，对于各样品得到30-100pg的扩增RNA(aRNA)。作为对照，以相同方式扩增正常人膀胱poly(A)+RNA(BDBioscience,PaloAlto，CA)。如本发明人较早前已经通过半定量RT-PCR实验(KitaharaO,a/.，(2001)CancerRes;61:3544-9)确认的，无论使用总RNA还是使用aRNA作为模板，由该方法扩增的RNA正确地反映最初的RNA来源中的比例，其中来自微阵列的数据与由RT-PCR获得的结果一致。cDNA微阵列为了获得点样于载玻片上的cDNA,按之前所述对各基因进行RT-PCR(KitaharaO,"a/.,(2001)CancerRes;61:3544-9)。使用高密度MicroarraySpotterLucidea(GEHealthcare,AmershamBiosciences)将PCR产物点样在VII型载玻片(GEHealthcare,AmershamBiosciences,BuckinghamshireUK)上；在一个载玻片上重复(induplicate)点样9216个基因。制备3组不同的栽玻片(共有27648个基因点)，每组载玻片上还点样相同的52个持家基因和2个阴性对照基因。按之前描述的方式由aRNA制备cDNA探针(OkabeH,"a/.,(2001)CancerRes;61:2129-37)。为进行杂交实验，分别在存在Cy5-dCTP和Cy3陽dCTP(GEHealthcare,AmershamBiosciences)的条件下对9.0jag来自各癌症组织和来自对照的扩增RNA(aRNA)进行逆转录。按之前的描述进行杂交、洗涤和信号检测(OkabeH,"a/.，(2001)CancerRes;61:2129-37)。信号的定量检测从27648个点定量Cy3和Cy5的信号强度，并利用ArrayVision软件(ImagingResearch,Inc.,St.Catharines,Ontario,Canada)通过替换背景来分析信号。随后，调整各靶标点(targetspot)的Cy5(肿瘤)和Cy3(对照)的荧光强度以使52个持家基因的平均Cy5/Cy3比为1。因为由低信号强度获得的数据的可信度低，因此如前所述(OnoK,"a/.,(2000)CancerRes;60:5007-11)在各载玻片上确定截止值(cutoffvalue),如果Cy3和Cy5两种染料产生的信号强度低于截止值，则在进一步的分析中排除该基因(Saito-HisaminatoA,"a/.,(2002)DNARes;9:35-45)。对于其它基因，对使用各样品的原始数据将Cy5/Cy3计算为相对表达比的前述方法进行了修正，因为如果Cy3或Cy5信号强度低于截止值时，会提供Cy5/Cy3比极高或极低的读数(reading)，从而导致选出假性预测基因。为了减少这样的偏移，当Cy3或Cy5信号强度低于截止值时，将各样品的Cy3和Cy5信号强度加上各截止值的一半计算Cy5/Cy3比。鉴定膀胱癌中上调或下调的基因按以下标准对膀胱癌中通常上调或下调的基因进行鉴定和分析。首先选出满足下述条件的基因能够计算超过50%的病例的相对表达比，并且在超过50%的病例中其表达是上调或下调的。此外，如果能够计算35-50%的病例的相对表达比时，还要评价了该基因在80%的病例中上调或下调。各基因的相对表达比(Cy5/Cy3强度比)被归于如下4个类群之一(l)上调(表达比大于5.0);(2)下调(表达比小于0.2);(3)表达无变化(表达比为0.2-5.0);(4)未表达(或微量表达，但小于检测的截止水平)。这些类群用于检测出一组基因，这些基因的表达比变化在各样品间是一致的，并且对某亚群是特异性的。为了检测出在膀胱癌细胞中一般上调或下调的候选基因，对27648个基因的全体表达图式进行筛选，以选出表达比大于5.0或小于0.2的基因。在看起来在肿瘤细胞中上调的全部394个基因中，注意集中在内部识别号(in-houseidentificationmunber)为C2093、B5860N和C6055的基因上，因为它们的表达比在超过50%的提供资料的膀胱癌病例中超过5.0,且正常人组织表达模式显示其在正常器官包括心、肺、肝和肾中是低表达的。半定量RT-PCR选捧44个上调基因，通过实施半定量RT-PCR实验考察它们的表达水平。使用随机引物(Roche)和SuperscriptII(Invitrogen)将来自各样品的3|igaRNA等分试样逆转录为单链cDNA。对各cDNA混合物进行稀释，然后使用与为靶标DNA或04尸Di7特异性反应所制备的相同的引物组进行PCR扩增。图la的RT-PCR中使用的引物序列列于表2。图lb和lc的RT-PCR中使用的PCR引物序列如下用于C20935'-TGCTGGTTCAGAACGAACTATG-3'(SEQIDN0.9)和5'-TCCTCGTGGCTAATGAAAGC-3'(SEQIDNO.10);用于B5860NV1和V2的共同序列5'-GCTACAAGTAAAGAGGGGATGG-3'(SEQIDNO.ll)和5'-GGACAGAAAGGTAAGTCAGTGGG-3'(SEQIDNO.12)。以GAPDH的表达为内部对照。最优化PCR反应的循环数，以确保产物强度在扩增的线性范围内(表2)。表2图la的RT-PCR中使用的引物序列<table>tableseeoriginaldocumentpage80</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage81</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage82</column></row><table>B5860N、F1653、B9838和C6055的[a32P]-dCTP标记的扩增产物杂交(表3)。用于C6055的微阵列探针5'-CCCCAGTTGAGAGTTTGCTC-3'(SEQIDNO:137)和5'-CTGTCATGTGCTCATGTGAGTTT-3'(SEQIDNO:53);用于C6055的4个转录物的共有区域5'-TGACATCGGGATTCAGACTAA-3'(SEQIDNO:138)和5'-AAAGATGCTGGTCCTTGTGC-3'(SEQIDNO:139)。按生产商的说明书，使用TRIzol试剂(Invitrogen)从全部的膀胱癌细胞系和冰冻外科样品才是取总RNA。在用DNaseI(NipponGene,Osaka,Japan)处理后，使用Micro-FastTrack(Invitrogen)按生产商的说明书分离mRNA。在1%变性琼脂糖凝胶上分离各l吗的各种mRNA的等分试样和从正常成人的心、肺、肝、肾、脑、胰、睾丸和膀胱分离的polyA(+)RNA(Clontech，PaloAlto,CA),并转移在尼龙膜上。按供应商的推荐进行预杂交、杂交和洗涤。使用增感屏(intensifyingscreen)在-80。C将印迹放射自显影14天。表3用于通过RT-PCR制备Northern探针的引物序列<table>tableseeoriginaldocumentpage82</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage83</column></row><table>5,RACE和3，RACE通过使用SMART(TM)RACEcDNAAmplificationKit(Clontech)进行cDNA末端5'快速扩增(5'RACE)和cDNA末端3'快速扩增(3，RACE),来确定B5860N和C6055的5'末端和3，末端序列。由膀胱癌细胞系，SW780细胞合成cDNA模板用于扩增，并使用试剂盒中提供的API引物和如下引物进行PCR:用于5'RACE的B5860N特异性反向引物(5'-CATTTTCTGATCCCCACCTCCCTTTG-3'(SEQIDN0.14)),用于5'RACE的C6055特异性反向引物(C6055一GSP1;5'-GATCCAAATGCTAGGGATCCTGTGTG-3'(SEQIDNO:140)和C6055一NGSP1;5'-CCTGTGTGATATCGTATGGCTCGTCCA-3'(SEQIDNO:141));和用于3'RACE的B5860N特异性正向引物(5'-AGAGGGGATGGGGAAGGTGTTGC-3'(SEQIDNO.15))。表达载体的构建使用KOD-PlusDNA聚合酶(Toyobo,Osaka,Japan)通过PCR扩增C2093、B5860Ns和C6055scDNA的完整编码序列，PCR使用的引物如下TCAAGAGG-3'(SEQIDNO.16)(下划线表示NotI位点)和C2093-反向，5'-ATAAGAATGCGGCCGCTTTGGCTGTTTTTGTTCGA-3'(SEQIDN0.17)(下划线表示NotI位点)，B5860NVl-正向，5'-ATAAGAATGCGGCCGCTATGGAGAGTCAGGGTGTGC-3，(SEQIDNO.18)(下划线表示NotI位点)和B5860NVl-反向，5'-CCGCTCGAGTCTTAGACTACGGAACTTTGGT-3'(SEQIDNO.19)(下划线表示XhoI位点)，B5860NV2-正向，5'-GGAATTCATGGAGAGTCAGGGTGTG-3'(SEQIDNO.20)(下划线表示EcoRI位点)和B5860NV2-反向，5'-CCGCTCGAGTCTTAGACTACGGAACTTTGGT-3'(SEQIDNO.19)(下划线表示XhoI位点)，C6055-正向，5'-AGAATTCATGATCTTCCTACTGTGTATTATTGGC-3'(SEQIDNO:142)(下划线表示EcoRJ位点)和C6055-反向，5'-TATCTCGAGCTGCTTCCTAGTTTGTGGATTTTC-3';(SEQIDNO:143)(下划线表示XhoI位点)。将PCR产物分别插入pCAGGSnHA表达载体的EcoRI和XhoI,和NotI位点。通过DNA测序确定这些构建体。Western印迹分析使用FuGENE6转染试剂(Roche)按生产商的说明书分别用l吗的pCAGGS-C2093-HA、pCAGGS-B5860NV1-HA、pCAGGS-B5860NV2-HA或pCAGGS-C6055-HA瞬时(transiently)转染COS7细胞。在10%SDS聚丙烯酰胺凝胶(用于pCAGGS-C2093-HA、pCAGGS-B5860NVl-HA、pCAGGS-B5860NV2-HA转化细胞)或7.5%SDS-聚丙歸酰胺凝胶(用于pCAGGS-C6055-HA转化细胞)上对细胞裂解物进行分离，并转移到硝酸纤维素膜上，然后与作为第一抗体以1:1000稀释的小鼠抗HA抗体(Roche)—起温育。在与作为第二抗体的羊抗小鼠IgG-HRP(AmershamBiosciences)温育之后，用ECL试剂盒(AmershamBiosciences)将信号可视化。进行免疫细胞化学染色以检测膀胱癌细胞中外源性C2093、B5860N和C6055蛋白为考察外源性C2093、B5860NV1和B5860NV2或C6055的亚细胞定位，对全部的3个构建体以每孔lxl()S个细胞接种COS7细胞。24小时后，使用FuGENE6转染试剂(Roche)按生产商的说明书分别用l吗的pCAGGS-C2093-HA、pCAGGS-B5860NV1-HA、pCAGGS-B5860NV2-HA或pCAGGS-C6055-HA瞬时转染入COS7细胞。然后，使用含4%多聚曱醛(paraformaldehyde)的PBS固定细胞15分钟，用含0.1%TritonX-100的PBS于4°C处理2.5分钟以赋予细胞通透性。接下来，用3。/。BSA的PBS溶液于4。C覆盖(cover)细胞12小时，以封闭非特异性杂交。接着，将各个转染了构建体的COS7细胞与l:1000稀释的小鼠抗HA抗体(Roche)温育。用PBS清洗后，两种转染细胞均用以1:3000稀释的Alexa488-结合的抗小鼠第二抗体(MolecularProbe)进行染色。用4',6-二脒基-2-笨吲哚二盐酸(DAPI)对细胞核进行复染(counter-stain)。在TCSSP2AOBS显微镜(Leica,Tokyo,Japan)下获取荧光影像。同步化及流式细胞计量术分析使用FuGENE6(Roche)按供应商的规程用8吗的pCAGGS-C2093-HA、或pCAGGS-B5860NV1-HA、pCAGGS-B5860NV2-HA转染HeLa细胞(lx106)。转染24小时后，进一步用阿非迪霉素(lng/ml)处理16小时以使细胞抑制(arrest)在G1期。用新鲜培养基清洗3次以使细胞周期释放(release),在指定时间点收集细胞。将细胞与诺考达唑(250ng/ml)温育16小时以使其抑制在有丝分裂期(mitoticphase),然后收获细胞。将同步化粘附和分离的细胞的400ml等分试样于4°C与70%乙醇组合并用其固定，以用于FACS分析。用PBS(-)清洗2次后，然后将细胞与lml含lmgRNaseI的PBS于37。C温育30分钟。然后在1ml含50mg碘化丙锭(PI)的PBS中对细月包进行染色。在流式细胞仪(FACScalibur;BectonDickinson,SanDiego,CA)中从至少10000个中细胞确定细胞周期阶段的每个部分的百分比。使用psiU6X3.0构建C2093、B5860N和C6055特异性siRNA表达载体按照之前的报导(WO2004/076623)使用psiU6BXsiRNA表达载体建立基于载体的RNAi系统。通过将双链寡核苷酸克隆至psiU6BX载体的Bbsl位点，来制备针对C2093(psiU6BX-C2093)、B5860N(psiU6BX-B5860N)、C6055(psiU6BX-C6055)的siRNA表达载体以及对照质粒，psiU6BX-EGFP、-SCR。双链寡核苷酸的核苷酸序列显示如下C2093si弁3用于耙序列GTGAAGAAGTGCGACCGAA(SEQIDNO:21)有义(SEQIDNO:22):5'-TTCTTCAC-3'反义(SEQIDNO:23)5、TTCTTCAC-3'B5860Ns说3用于耙序列CCAAAGTTCCGTAGTCTAA(SEQIDNO:25)有义(SEQIDNO:26)5'-AACTTTGG-3'反义(SEQIDNO:27)5'—AACTTTGG-3'C6055si-有义(SEQIDNO:145):144)ACTGCAAC-3'反义(SEQIDNO:146)ACTGCAAC-3'siRNA对照(SilNO:29)有义(SEQIDNO:30):(SEQIDGCTGC丁TC-3'反义(SEQIDNO:31):GCTGCTTC-3'siRNA对照(SiSCR)用于靶序列GCGCGCTTTGTAGGATTCG(SEQIDNO:33)有义(SEQIDNO:34):AAGCGCGC-3'反义(SEQIDNO:35):AAGCGCGC-3'这些siRNA表达载体表达具有由如下核苷酸序列组成的发夹结构的siRNA:C2093si#3;GTGAAGAAGTGCGACCGAATTCAAGAGATTCGGTCGCACTTCTTCAC(SEQIDNO:24),B5860Nsi#3:CCAAAGTTCCGTAGTCTAATTCAAGAGATTAGACTACGGAACTTTGG(SEQIDNO:28),TAACTGCAAC(SEQIDNO:147)GTGCTGCTTC(SEQIDNO:32)，和CAAAGCGCGC(SEQIDNO:36)。C2093、B5860N和C6055的基因沉默效应将人膀胱癌细胞系涂布于0-cm亚(1《106细胞/亚)，所述人膀胱癌细胞系对C2093和B5860N而言是UMUC3和J82,对C6055而言是SW780。然后，对于C2093和B5860N使用FuGENE6(Roche)和Lipofectamine2000(Invitrogen)试剂、对于C6055使用Nucleofector(Ai職a)试剂，分别用psiU6BX-EGFP和psiU6BX-SCR作为阴性对照、psiU6BX-C2093、psiU6BX-B5860N或psiU6BX-C6055按照供应商的推荐进行转染。在用各构建体转染6天后，由细胞提取总RNA,然后使用前述的C2093、B5860N和C6055共同区域特异性引物通过半定量RT-PCR确认siRNA的敲低效应(knockdowneffect)。作为内部对照的GAPDH和ACTB的引物如下GAPDH5'-CGACCACTTTGTCAAGCTCA-3'(SEQIDN0.7)和5'-GGTTGAGCACAGGGTACTTTATT-3'(SEQIDN0.8)。ACTB5'-CATCCACGAAACTACCTTCAACT-3，(SEQIDNO:148)5，-TCTCCTTAGAGAGAAGTGGGGTG-3'(SEQIDNO:149)进一步，分别在含0.6、1.0和0.3mg/ml新霉素的选择培养基上将使用UMUC3、J82和SW780细胞系表达siRNA的转染子培养21、28和24天。用4%多聚曱醛固定后，用姬姆萨液(Giemsasolution)对转染细胞进行染色以评价集落形成。进行MTT试验以定量分析细胞生存力。分别在含有新霉素的培养基中培养21天和28天后，以0.5mg^ml的浓度加入MTT溶液(3-(4,5-二甲基-噻唑-2-基)-2，5-二苯基溴化四唑)(3-(4，5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromide)(Sigma)。37°C保温2.5小时或1.5小时后，加入酸-SDS(0.01NHCl/10o/oSDS);剧烈混合悬浮液，然后于37。C保温过夜以溶解黑蓝色的晶体。用MicroplateReader550(BioRad)测定570nm下的吸光度。观察因C2093-siRNA产生的多核细胞使用FuGENE6(Roche)以si-C2093和作为阴性对照的si-EGFP转染UMUC3细胞之后，将它们进行培养，并在转染7天后通过显微镜观察它们的细胞形态。为进一步确认C2093蛋白质表达的抑制，按照标准规程使用抗C2093抗体进4亍Western印迹。抗C2093抗体和抗B5860N抗体使用pET21载体分别制备表达在其COOH末端含有His标签的C2093(1612-1780a.a.)(SEQIDNO:150)和B5860NV2(337-527a.a)或B5860NV1(621-811a.a.)(SEQIDNO:151)的部分片段。在大肠杆菌BL21密码子强化(codon-plus)菌抹(Stratagene,LaJolla,CA)中表达重组蛋白质，按供应商的规程使用Ni-NTA树脂和TALON进行纯化。将这些蛋白质接种于兔。按标准规程在亲和柱上纯化免疫血清。亲和纯化的抗C2093抗体和抗B5860N抗体用于Western印迹、免疫沉淀和免疫染色。免疫细胞化学染色以检测膀胱癌细胞中内源性C2093和B5860N蛋白为考察内源性C2093或B5860N的亚细胞定位，分别以lxl()S个细胞每孔接种内源性表达C2093或B5860N的UMUC3细胞。24小时后，使用含4%多聚曱醛的PBS固定细胞15分钟，并用含0.1%TritonX-100的PBS于4°C处理2分钟以赋予细胞通透性。接下来，用3%BSA的PBS溶液于4。C覆盖细胞12小时，以封闭非特异性杂交。接着，将UMUC3细胞与1:100稀释的亲和纯化的抗C2093抗体或抗B5860N抗体温育。用4',6'-二脒基-2'-苯基p引哚二盐酸(DAPI)对细胞核进行复染。用PBS清洗后，将UMUC3细胞用1:3000稀释的Alexa488-结合的抗兔第二抗体(MolecularProbe)进行染色。在共聚焦显微镜(Leica,Tokyo，Japan)下获取荧光影像。免疫组织化学染色以4企测正常组织或膀胱癌组织中内源性C2093和B5860N蛋白进行使用ENVISION+Kit/HRP(DakoCytomation,Glostmp，Denmark)对石蜡包埋的正常成人组织(BioChain,Hayward,CA)和外科膀胱癌样本的载玻片进行染色，染色前需分别经过如下处理对切片进行脱石蜡处理，使用抗C2093抗体在高pH抗原回收液(DAKO)中用微波炉于80。C加热5分钟；或者，对切片进行脱石蜡处理，使用抗B5860N抗体在高pH抗原回收液(DAKO)中于108°C自分泌(autocrave)15分钟。封闭内源性的过氧化物酶和蛋白质之后，将这些切片与1:20稀释的亲和纯化的抗C2093抗体或抗B5860N抗体温育。使用过氧化物酶标记的抗兔免疫王求蛋白(Envisionkit,DakoCytomation,Carpinteria，CA)进行免疫染色。最后，用3,3V-二氨基联苯(Dako)对反应物进行显色，并用苏木精(hematoxylin)对细胞进行复染。结果为获得膀胱癌的正确表达模式，使用LMM仅收集膀胱癌细胞。如通过显微镜观察所测定的，估计通过该操作选出的癌细胞的比例几乎是100%(数据未显示)。鉴定出394个表达比超过5.0的上调基因(表4)。这些基因中，包括288个在膀胱癌细胞中过表达且功能性表征的基因，而另外的106个(包括51个EST)是目前未知的。这些上调元件中包括与信号传导途径、癌基因、细胞周期及细胞粘附和细胞骨架相关的重要基因。在另一方面，鉴定出1272个表达比低于0.2的下调基因(表5)。这些下调基因中，包括1026个在膀胱癌细胞中下调且功能性表征的基因，而另夕卜246个(包括119个EST)是未知的。为确认在膀胱癌中这些上调的基因的表达图式，使用膀胱癌细胞系及包含正常膀胱和正常转移细胞的正常人组织进行了半定量RT-PCR分析。比较在所有提供信息的病例的大部分中过表达的44个上调基因的表达水平的比例，其结果在大多数试验病例中是与微阵列分析的结果高度相似的(图1)。特别是B5860N、B0811、C2093、F6022、F4976、D5491、F0411、D7746、A0576N、F1653、C2210、C7757和D7443在正常重要器官(vitalorgan)中均未见表达。这些数据验证了旨在鉴定膀胱癌细胞中一般性上调基因的本发明人的策略的可靠性。为了进一步考察这些上调基因即A0576N、C2093、C5509、B5860N、F1653、B9838和C6055的表达图式，分别以使用如表3所示的各引物组通过RT-PCR制备的A0576N、C2093、C5509、B5860N、F1653、B9838和C6055的各[a"P]-dCTP标记的扩增产物为各探针，对膀胱癌细胞系进行Northern印迹分析(图2)。与在正常膀胱中的表达相比，它们全部在膀胱癌细胞系中显示更高的表达。特别是A0576N、C2093、B5860N、B9838和C6055在膀胱癌细胞系中特异性过表达，而在含正常膀胱的正常人组织中不表达。这显示这些特异性过表达的基因可以成为分子靶向疗法的优秀候选物。表4膀胱癌中上调的基因<table>tableseeoriginaldocumentpage90</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage91</column></row><table><table>complextableseeoriginaldocumentpage92</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage93</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage94</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage95</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage96</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage97</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage98</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage99</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage100</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage101</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage102</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage103</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage104</column></row><table><table>complextableseeoriginaldocumentpage105</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage106</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage107</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage108</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage109</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage110</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage111</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage112</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage113</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage114</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage115</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage116</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage117</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage118</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage119</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage120</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage121</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage122</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage123</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage124</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage125</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage126</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage127</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage128</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage129</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage130</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage131</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage132</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage133</column></row><table><table>complextableseeoriginaldocumentpage134</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage135</column></row><table>(SEQIDNO.3,编码SEQIDN0.4))和C6055(表示MGC34032假设蛋白(Genebank登录号NM—152697SEQIDNO:133,编码SEQIDNO:134))的基因。C2093、B5860N和C6055基因的表达分别在可获得表达数据的膀胱癌病例的25例中的24例、20例中的17例,和32例中的21例中是上升的。为确定这些上调基因的表达，进行半定量RT-PCR分析，以比较膀胱癌样品与含正常膀胱癌细胞的正常组织间的表达水平。首先，发现与正常膀胱细胞和包括肺、心、肝和肾的正常人组织相比，C2093在21例临床膀胱癌样品的17例中显示表达上升(图la和b)。而且，该基因在全部6个膀胱癌细胞系中同样是过表达的(图lb)。接着，发现与正常人组织、特别是正常膀胱mRNA相比，B5860N在21例临床膀胱癌样品的20例中显示表达上升(图la和c),而且在试验的全部6个膀胱癌细胞系中均是过表达的(图lc)。为进一步考察这些基因的表达图式，以C2093、B5860N和C6055的cDNA片段为探针，用多种人类组织和膀胱癌细胞系进行Northern印迹分析(参见材料与方法)。C2093在睾丸以外的正常人组织中不表达或不能检出(图2e;上)，而其在所有膀胱癌细胞系中均令人惊讶地过表达(图2e;下)。同样地，B5860N也仅在睾丸表达(图2f;上)，而与其它正常组织，特别是正常人膀胱相比，其在所有的膀胱癌细胞系中均显著过表达(图2f;下)。C6055同样在正常人組织中不表达或不能检出(图2g;上)，而其在6个膀胱癌细胞系中的3个中过表达(图2g;下)。因此，关注集中在膀胱癌特异性表达的转录物上。C2093、B5860N和C6055的基因组结构(genomicstructure)由于数据库中的C2093最初并非是全长的，为获得C2093、B5860N和C6055的全长cDNA序列，使用膀胱癌细胞系SW780作为模板，以EST步移(ESTwalking)及5'RACE和3'RACE实验的方式进行RT-PCR(参见材料与方法)。C2093由31个外显子组成，表示M期磷蛋白1(MPHOSPH1),位于染色体10q23.31上。C2093的全长mRNA序列含6319个核苷酸，编码1780个氨基酸。该转录物的ORF起始于各外显子1内。B5860N表示含DEP结构域1(DEPDC1),位于染色体的lp31.2上。该基因还具有两个不同的转录变体，它们分别由12个外显子和11个外显子组成，分别对应于B5860NVI(SEQIDN0.3,编码SEQIDNO,4)和B5860NV2(SEQIDN0.5，编码SEQIDNO.6)(图3b)。VI的外显子8中存在可替换的变异(alternativevariations),其余的外显子是两个突变体共有的。V2变体没有VI的外显子8，其在最后的外显子内产生相同的终止密码子。B5860NV1和B5860NV2变体的全长cDNA序列分别由5318个核香酸和4466个核苦酸组成。这些变体的ORF起始于各外显子1内。最终，VI和V2转录物分别编码811个和527个氨基酸。为进一步确认膀胱癌细胞系和正常人组织，包括膀胱、心、肺、肝、肾、脑、胰中各变体的表达图式，进行了Northern印迹分析。结果发现两种变体均在膀胱癌细胞中高度过表达，而在睾丸以外的正常人组织中不表达或不能检出(图2f,下)。特别是V2转录物仅在睾丸中表达。因而，进一步进行了B5860N的两个变体的功能分析。根据NCBI的数据库，C6055由24个外显子组成，称作MGC34032,位于染色体lp31.3上。因为C6055并不包含在^:据库中MGC34032的最后外显子(外显子24)内，本发明人使用膀胱癌细胞系SW780为模板，以EST步移及5'RACE和3'RACE实验的方式进行RT-PCR，以获得C6055的全长cDNA序列(参见材料与方法)。结果，本发明人发现了2个新转录物一C6055V1(SEQIDNO:129,编码SEQIDNO:130)和C6055V2(SEQIDNO:131，编码SEQIDNO:132)。最终，该基因具有4个不同的剪接变体，它们分别由24个、25个、22个和22个外显子组成，分别对应于MGC34032、Genbank登录号No.AKl28063、C6055V1和C6055V2(图3c)。MGC34032的外显子1、2、3、4和24存在可替换的变异，其余的外显子是4个变体共有的。C6055V1和C6055V2转录物中没有MGC34032的外显子1、2和3,其在最后的外显子内产生相同的终止密码子。特别是C6055V1和C6055V2转录物的ORF起始于各外显子4，这显示C6055V1和C6055V2转录物具有相同的ORF。MGC34032、Genbank登录号No.AK128063、C6055V1和C6055V2转录物的全长cDNA序列分别由2302、3947、3851和3819个核普酸组成。最终，MGC34032、Genbank登录号No.AK128063、C6055V1和C6055V2转录物分别编码719、587、675和675个氨基酸。为了进一步确定在膀胱癌细胞系中及正常人体组织，包括膀胱、心、肺、肝、肾、脑、睾丸及胰中各变体的表达图式，本发明人使用cDNA片段C6055用于微阵列作为探针，进行Northern印迹分析。结果，约3.9kb的转录物在一些膀胱癌细胞(HT-1376、SW780和RT4)中高度过表达，而在正常人体组织中不表达或不能检出(图2g，上)。而且，7.5kb的转录物仅在HT1376细胞中特异性表达，但还未鉴定该转录物的全mRNA序列。此外，当我们使用这些转录物中的共有区作为探针进行Northern印迹分析时，仅在正常睾丸中检测出对应于MGC3卯32的2.3kb转录物(图2g,中和下)。因而，本发明人进一步进行了C6055V1基因产物的功能分析。C2093、B5860N和C6055的亚细胞定位为进一步考察C2093、B5860N和C6055的性质，考察了这些基因产物在COS7细胞内的亚细胞定位。首先，将表达C2093蛋白的质粒(pCAGGS-C2093-HA)瞬时转染入COS7细胞时，通过Western印迹分析按预想的大小观察到210KDa-C2093蛋白(图4a)。免疫细胞化学染色显示外源性C2093主要定位在COS7细胞中的核器官，并观察到在一些细胞中其在染色体周围积累(图4b)。因而，用阿非迪霉素使细胞同步化(synchronize),考察了细胞周期进行过程中C2093蛋白的定位。明显地，该蛋白在G1/G0和S期定位于细胞核，特别是在G2/M期积累在染色体周围。接着，将表达B5860NV1或V2蛋白的质粒(pCAGGS-B5860NV1-HA或pCAGGS-B5860NV2-HA)分别瞬时转染入COS7纟田月包时，在转染后24小时和48小时通过Western印迹分析按预想的大小观察到外源性B5860NV1和V2蛋白(图4d;VI:左，V2:右)。而且，免疫细胞化学染色显示BS860NV1定位于细胞质(图4e，上)，但也观察到在一些细胞中其存在于核器官(图4e,下)；而B5860NV2主要定位在细胞质(图4f，上)，并且也观察到在一些细胞中其存在于细胞质膜(cytoplasmicmembrane)下(图4f，下)。因而，用阿非迪霉素使细胞同步化，并考察细胞周期进行过程中B5860NV1和V2蛋白的定位。B5860NV1蛋白在G1/G0和S期定位于细胞核，而在G2/M期定位于细胞质膜下(图4g);而B5860NV2蛋白在G2/M期定位于细胞质膜下(图4h)。此外，将表达B5860NV1和V2蛋白的两种质粒瞬时转染入COS7细胞时，观察到B5860NV1蛋白定位于核及细胞质器官，而B5860NV2定位于核并在G2/M期转移至细胞质膜下(图4i)。为进一步确定内源性C2093的亚细胞定位，使用经亲和纯化的抗C2093抗体通过免疫细胞化学分析，考察了其在细胞周期进行过程中的定位。内源性C2093蛋白在间期(interphase)定位于细胞核中，在前期(prophase)、中期(metaphase)和早后期(earlyanaphase)定位于细胞质，特别是在晚后期(lateanaphase)其位于中间体(midbody)，而在末期(telophase)其位于收缩环(contractilering)附近(图4j)。因此，C2093可能在胞质分裂(cytokinesis)中起重要作用。接下来，像C2093—样，在细胞周期进行过程中考察膀胱癌细胞中的内源性B5860N,使用经亲和纯化的B5860N多克隆抗体进行了免疫细胞化学分析。内源性B5860N蛋白在间期主要定位于细胞核，而在M期则定位于细胞质(图4k)。SMART和SOSUI计算机预测表明，预测的C6055蛋白包含第8、第9或第IO跨膜区。为了验证这个预测，我们考察了该基因产物在转染36小时和60小时后的COS7细胞中的亚细胞定位。首先，将表达C6055蛋白的质粒(pCAGGS-C6055-HA)瞬时转染入COS7细胞时，使用抗HA标签抗体进行Western印迹分析。结果显示出与C6055蛋白的预想大小相当的67Kda条带以及另外的75Kda条带(图41)。为了验证75Kda条带是否表示通过磷酸化或糖基化修饰的C6055的形式，我们在进行免疫印迹之前，用人-磷酸酶、O-糖苷酶或N-糖苷酶(N-glycosydase)及O-糖香酶处理细胞提取物。经磷酸酶和O-糖苷酶处理后，75Kda条带不消失，而经O-糖苷酶处理后75Kda条带消失，这显示C6055蛋白仅在活细胞中进行O-糖基化(图4m)。为考察C6055蛋白的亚细胞定位，我们在转染了C6055的COS7细胞中进行了荧光免疫组织化学染色。结果显示，在36小时时观察到C6055定位于细胞质，而在60小时时外源性C6055主要定位于COS7细胞中的细胞膜(图4n)。设计以降低C2093、B5860N和C6055的表达的小干扰RNA(siRNA)的生长抑制效果为评价C2093、B5860N和C6055的生长促进作用，通过基于哺乳动物载体的RNA干扰(RNAi)技术在显示C2093、B5860N和C6055过表达的膀胱癌细胞系J82、UMUC3和SW780中敲低了内源性C2093、B5860N和C6055的表达(参见材料与方法)。通过半定量RT-PCR实验考察了C2093、B5860N和C6055的表达水平。如图5-7所示，与对照siRNA构建体(psiU6BX-EGFP和SCR)相比，C2093、B5860N和C6055特异性siRNA显著抑制各基因的表达(图5a,5d,6a，7a)。为确认C2093、B5860N和C6055特异性siRNA引起的细胞生长抑制，分别进行了集落形成试验和MTT试验。导入C2093-si3构建体抑制J82和UMUC3细胞的生长(图5b，c,e,f)，B5860N-si3构建体抑制J82细胞的生长(图6b,c)，而C6055-si-08构建体抑制SW780细胞的生长(图7b,c),这与上述表达下降的结果相一致。每个结果是通过3次独立实验-险证的。这些发现显示，C2093、B5860N和C6055在膀胱癌的细胞增殖中具有重要功能。尤其是为了进一步阐明C2093在胞质分裂中的作用，我们将C2093-siRNA转染到膀胱癌细胞系UMUC3细胞，在转染后7天通过显微术观察细胞形态。我们确定C2093-siRNA敲低了C2093蛋白的表达(图8b)，并在转染siRNA的细胞中观察到多核细胞(图8a,c)，这显示si-C2093敲低细胞使胞质分裂变弱(failedincytokinesis)。临床样品中C2093和B5860N蛋白的表达在外科手术切除的侵入性膀胱癌组织和正常膀胱组织切片及各种正常组织(肾、心、肺和肝)中分别进行C2093或B5860N的免疫组织化学分析。仅在膀胱癌组织中观察到针对两种蛋白的强染色(图9a,b)，而在正常膀胱组织中未检出C2093的染色(图9a)。讨论在本报导中，通过使用全基因组cDNA微阵列获得的膀胱癌的正确表达模式，分离了与正常人体组织相比在膀胱癌细胞中显著过表达的新基因C2093、B5860N和C6055。通过免疫化学染色，观察到B5860N蛋白作为中间丝(intermediatefilament)定位于细胞质，这显示B5860N可在细胞对细胞的相互作用中扮演关4定角色。此外，证实了用siRNA处理膀胱癌细胞有效抑制全部3个靶基因C2093、B5860N和C6055的表达，并且明显抑制膀胱癌细胞/肺瘤生长。这些发现显示C2093、B5860N和C6055在胂瘤细胞生长增殖中可能起到重要作用，并可为用于抗癌药开发的有希望的靶标。工业实用性本说明书所述的膀胱癌的基因表达分析是通过激光捕获切割(laser-capturedissection)和全基因组cDNA孩i阵列的组合而获得的，其鉴定了特异性基因作为预防和治疗癌症的靶标。基于这些差异表达的基因亚组(subset)的表达，本发明提供用于鉴定和检测膀胱癌的分子诊断标记。的分子靶标。本发明中报导的数据增加了对膀胱癌的全面理解，促进新型诊断策略的开发，提供用于鉴定治疗药和预防剂的分子靶标的线索。这样的信息有助于对膀胱肿瘤发生的更深的理解，为开发用于诊断、治疗和最终预防膀胱癌的新战略提供了指示。与非癌性膀胱组织相比，人基因C2093、B5860Ns和C6055s的表达在膀胱癌中显著提高。因此，这些基因作为膀胱癌的诊断标记是有用的，由它们编码的蛋白质可用于膀胱癌的诊断试验。本发明人还显示C2093、B5860Ns或C6055s蛋白的表达可以促进细胞生长，而对应于C2093、B5860Ns和C6055s基因的小干扰RNA则抑制细胞生长。这些发现显示，C2093、B5860Ns和C6055s蛋白可促进致癌活性。因此，这些癌蛋白中的每个均是用于开发抗癌药物的有用的靶标。例如，阻断C2093、B5860Ns和C6055s表达或者抑制其活性的物质作为抗癌剂,特別是用于治疗膀胱癌的抗癌剂，具有治疗上的功效。这样的物质的例子包括针对C2093、B5860Ns和C6055s基因的反义寡核苷酸、小干扰RNA和核酶，以及识别C2093、B5860Ns和C6055s的抗体。本说明书提及的所有专利、专利申请和出版物皆全文并入本说明书作为参考。但可理解的是上述说明书实际上是例示性和解释性的，意;fe夂阐明本发明及其优选实施方案。通过常规的实验，本领域技术人员将容易地认识到，可对本发明进行各种变化和修饰而不背离本发明的精神和范围。因此，本发明并不意欲受到上述说明的限定，而由如下权利要求及其等同物限定。权利要求1.一种诊断受试者中的膀胱癌或发生膀胱癌的素因的方法，该方法包括测定源自患者的生物样品中膀胱癌相关基因的表达水平，其中所述基因在所述样品中的表达水平与正常对照水平相比上升或下降表示该受试者患有膀胱癌或处于发生膀胱癌的危险中。2.权利要求1的方法，其中所述膀胱癌相关基因选自基因BLCNos.l-394，且与正常对照水平相比，所述样品中的表达水平上升表示所述受试者患有膀胱癌或处于发生膀胱癌的危险中。3.权利要求2的方法，其中与所述正常对照水平相比，所述样品中的表达水平高至少io%。4.权利要求1的方法，其中所述膀胱癌相关基因选自基因BLCNos.395-1666,且其中与正常对照水平相比，所述样品中的表达水平下降表示所述受试者患有膀胱癌或处于发生膀胱癌的危险中。5.权利要求4的方法，其中与所述正常对照水平相比，所述样品中的表达水平低至少10%。6.权利要求1的方法，所述方法进一步包括测定多个膀胱癌相关基因的表达水平。7.权利要求l的方法，其采用选自下组的方法测定基因的表达水平(a)4企测膀胱癌相关基因的mRNA，(b)检测由膀胱癌相关基因编码的蛋白质，和(c)检测由膀胱癌相关基因编码的蛋白质的生物活性。8.权利要求7的方法，其中所述检测在DNA阵列上进行。9.权利要求l的方法，其中所述源自患者的生物样品包括上皮细胞。10.权利要求1的方法，其中所述源自患者的生物样品包括膀胱癌细胞。11.权利要求1的方法，其中所述源自患者的生物样品包括来自膀胱癌细胞的上皮细胞。12.膀胱癌参照表达才莫式，其包括选自基因BLCNos.l-1666的2个或2个以上膀胱癌相关基因的基因表达图式。13.膀胱癌参照表达模式，其包括选自基因BLCNos.1-394的2个或2个以上膀胱癌相关基因的基因表达图式。14.膀胱癌参照表达模式，其包括选自基因BLCNos.395-1666的2个或2个以上膀胱癌相关基因的基因表达图式。15.—种筛选用于治疗或预防膀胱癌的化合物的方法，所述方法包括以下步骤a)使受试化合物与多肽接触，其中所述多肽由选自基因BLCNos.1-1666的多核苷酸编码；b)4全测多肽与受试化合物之间的结合活性；和c)选择与多肽结合的受试化合物。16.—种筛选用于治疗或预防膀胱癌的化合物的方法，所述方法包括以下步骤a)使受试化合物与表达一个或多个标记基因的细胞接触，其中所述一个或多个标记基因选自基因BLCNos.1-1666;和b)选择候选化合物，所述候选化合物与在不存在受试化合物时检出的多肽的表达水平相比，降低选自基因BLCNos.1-394的一个或多个标记基因的表达水平，或者提高选自基因BLCNos.395-1666的一个或多个标记基因的表达水平。17.权利要求16的方法，其中所述细胞包括膀胱癌细胞。18.—种筛选用于治疗或预防膀胱癌的化合物的方法，所述方法包括以下步骤a)使受试化合物与多肽接触，其中所述多肽由选自基因BLCNos.1-1666的多核苦酸编码；b)检测步骤a)的多肽的生物活性；和c)选择受试化合物，所述受试化合物与在不存在受试化合物时检出的由选自基因BLCNos.1-394的多核苷酸编码的多肽的生物活性相比，抑制所述多肽的生物活性，或者与在不存在受试化合物时检出的由选自基因BLCNos.395-1666的多核苷酸编码的多肽的生物活性相比，增强所述多肽的生物活性。19.一种筛选用于治疗或预防膀胱癌的化合物的方法，所述方法包括以下步骤a)使候选化合物与导入了载体的细胞接触，其中所述载体含有一个或多个标记基因的转录调控区及在该转录调控区的控制下表达的报告基因，其中所述一个或多个标记基因选自基因BLCNos.l-1666;b)测定所述报告基因的表达水平或活性；和c)选择候选化合物，与在不存在受试化合物时检出的所述报告基因的表达水平或活性相比，当所述标记基因为选自基因BLCNos.l-394的上调标记基因时，所述候选化合物降低所述报告基因的表达水平或活性，或者当所述标记基因为选自基因BLCNos.395-1666的下调标记基因时，所述候选化合物增强所述报告基因的表达水平或活性。20.含有检测试剂的试剂盒，其中检测试剂与(a)选自基因BLCNos.l-1666的2个或2个以上核酸序列，或者(b)由其编码的多肽结合。21.—种阵列，其含有与选自基因BLCNos.1-1666的1个或多个核酸序列结合的2个或2个以上核酸。22.—种治疗或预防受试者中膀胱癌的方法，其包括对所述受试者施用反义组合物，所述反义组合物包含与选自基因BLCNos.l-394的编码序列互补的核苷酸序列。23.—种治疗或预防受试者中膀胱癌的方法，其包括对所述受试者施用siRNA组合物，其中所述siRNA组合物降低选自基因BLCNos.l-394的核酸序列的表达。24.—种治疗或预防受试者中膀胱癌的方法，其包括如下步骤对所述受试者施用药物有效量的抗体或其免疫学活性片段，其中所述抗体或其免疫学活性片段与由选自基因BLCNos.1-394的任一基因编码的蛋白质结合。25.—种治疗或预防受试者中膀胱癌的方法，其包括对所述受试者施用疫苗，其中所述疫苗包含选自下组的至少一种(1)由选自基因BLCNos.1-394的核酸编码的多肽；(2)所述多肽的免疫学活性片段；或(3)编码所述多肽的多核苷酸。26.—种诱导抗肺瘤免疫的方法，所述方法包括如下步骤使抗原呈递细胞与多肽、编码该多肽的多核苷酸或者含有该多核苷酸的载体接触，其中多肽由选自基因BLCNos.1-394的基因，或者其免疫原性多肽编码片段编码。27.权利要求26的诱导抗肿瘤免疫的方法，其中所述方法进一步包括对受试者施用抗原呈递细胞的步骤。28.—种治疗或预防受试者中膀胱癌的方法，所述方法包括施用根据权利要求15-19中任一项的方法获得的化合物的步骤。29.—种治疗或预防受试者中膀胱癌的方法，其包括对所述受试者施用药物有效量的物质，其含有(a)选自基因BLCNos.395-1666的多核苷酸，或者(b)由该核苦酸编码的多肽。30.—种治疗或预防膀胱癌的组合物，所述组合物含有药物有效量的针对选自基因BLCNos.1-394的多核苷酸的反义多核苷酸或siRNA。31.—种治疗或预防膀胱癌的组合物，所述组合物含有药物有效量的与由选自基因BLCNos.1-394的基因编码的蛋白质结合的抗体或其片段。32.—种治疗或预防膀胱癌的组合物，所述组合物含有作为有效成分的药物有效量的通过权利要求15-19中任一项的方法选择的化合物，和药物可接受的载体。33.选自下组的基本上纯的多肽(a)包含SEQIDNO:4的氨基酸序列的多肽；(b)多肽，其包含SEQIDNO:4的氨基酸序列、或者与SEQIDNO:4具有至少约80%同源性的序列；(c)包含经修饰的SEQIDNO:4的氨基酸序列的多肽，其中该序列内的一个或多个氨基酸通过缺失、添加、插入和/或被其它氨基酸取代而被修饰，且突变数目通常不超过全部氨基酸的35%;而且其中所述多肽具有与由SEQIDNO:4的任一氨基酸序列组成的多肽等同的生物活性；和(d)由多核苷酸编码的多肽，所述多核苷酸在严4各条件与由SEQIDNO:3的核苷酸序列组成的多核苷酸杂交，其中所述多肽具有与由SEQIDNO:4的氨基酸序列组成的多肽等同的生物活性。34.分离的多核苷酸，其编码权利要求33的多肽。35.—种载体，其含有权利要求34的多核苷酸。36.—种宿主细胞，其含有权利要求34的多核苷酸或包含该多核苷酸的载体。37.生产权利要求33的多肽的方法，所述方法包括以下步骤(a)培养宿主细胞，所述宿主细胞含有编码权利要求33的多肽的多核苷酸或者包含该多核苷酸的载体；(b)使宿主细胞表达多肽；和(c)收集表达的多肽。38.与权利要求33的多肽结合的抗体，其中所述抗体与包含SEQIDNO:4的氨基酸序列304-588的抗原决定簇结合。39.与SEQIDNO:3的多核香酸或其互补链互补的、含至少15个核苷酸的多核苷酸，其中所述多核苷酸与含有SEQIDNO:3的位置988-1842的核苷酸序列杂交。40.针对包含SEQIDNO:3的核香酸序列的多核苷酸的反义多核苷酸或小干扰RNA，其中所述反义多核苷酸或小干扰RNA的靶序列包含选自SEQIDNO:3的位置988-1842的核香酸序列。41.诊断膀胱癌的方法，所述方法包括以下步骤(a)检测生物样品中基因的表达水平，所述基因编码选自下组的氨基酸序列SEQIDNO:2、4、6、130、132、134和136;和(b)将表达水平的提高与膀胱癌相关联。42.权利要求41的方法，其中通过选自下组的任一方法检测表达水平(a)检测mRNA,其编码选自下组的氨基酸序列SEQIDNO:2、4、6、130、132、134和136;(b)检测蛋白质，其包含选自下组的氨基酸序列SEQIDNO:2、4、6、130、132、134和136;和(c)检测蛋白质的生物活性，所述蛋白质包含选自下组的氨基酸序列SEQIDNO:2、4、6、130、132、134和136。43.—种筛选用于治疗或预防膀胱癌的化合物的方法，所述方法包括以下步骤(a)使受试化合物与选自下组的多肽接触(1)包含选自下组的氨基酸序列的多肽SEQIDNO:2、4、6、130、132、134和136;(2)多肽，其包含选自下组的氨基酸序列SEQIDNO:2、4、6、130、132、134和136，或包含与所述序列具有至少约80%同源性的序列；和(3)由多核苦酸编码的多肽，所述多核香酸在严格条件下与由选自下组的核苷酸序列组成的多核苷酸杂交SEQIDNO:l、3、5、129、131、133和135，其中所述多肽具有与由选自下组的氨基酸序列组成的多肽等同的生物活性SEQIDNO:2、4、6、130、132、134和136;(b)检测所述多肽与受试化合物之间的结合活性；和(c)选择与所述多肽结合的化合物。44.一种筛选用于治疗或预防膀胱癌的化合物的方法，所述方法包括以下步骤(a)使受试化合物与选自下组的多肽接触(1)包含选自下组的氨基酸序列的多肽SEQIDNO:2、4、6、130、132、134和136;(2)多肽，其包含选自下组的氨基酸序列SEQIDNO:2、4、6、130、(3)由多核香酸编码的多肽，所述多核苦酸在严格条件下与由选自下组的核香酸序列组成的多核苦酸杂交SEQIDNO:l、3、5、129、131、133和135,其中所述多肽具有与由选自下组的氨基酸序列组成的多肽等同的生物活性SEQIDNO:2、4、6、130、132、134和136;(b)检测步骤(a)的多肽的生物活性；和(c)选择化合物，所述化合物与不存在受试化合物时检出的生物活性相比，抑制该多肽的生物活性。45.权利要求44的方法，其中所述生物活性是细胞增殖活性。46.—种筛选用于治疗或预防膀胱癌的化合物的方法，该方法包括以下步骤(a)使受试化合物与细胞接触，其中所述细胞表达一个或多个多核苷酸，所述一个或多个多核苷酸包含选自下组的核苷酸序列SEQIDNO:l、3、5、129、131、133和135;和(b)选择化合物，所述化合物与不存在受试化合物时检出的表达水平相比，降低一个或多个多核苷酸的表达水平，所述一个或多个多核苷酸包含选自下组的核苦酸序列SEQIDNO:l、3、5、129、131、133和135。47.权利要求46的方法，其中所述细胞为膀胱癌细胞。48.—种筛选用于治疗或预防膀胱癌的化合物的方法，所述方法包括以下步骤(a)使受试化合物与导入了载体的细胞接触，其中所述载体含有一个或多个标记基因的转录调控区及在该转录调控区的控制下表达的报告基因，其中所述一个或多个标记基因包含SEQIDNO:1、3、5、129、131、133和135中的任一个核苷酸序列；(b)测定所述报告基因的表达水平或活性；和(c)选择化合物，所述化合物与不存在受试化合物时检出的所述报告基因的表达水平或活性相比，降低所述报告基因的表达水平或活性。49.一种治疗或预防膀胱癌的组合物，所述组合物含有药物有效量的针对多核苷酸的反义多核苷酸或小干扰RNA作为有效成分，和药物可接受的载体，其中所述多核苦酸编码选自下组的多肽(a)包含选自下组的氨基酸序列的多肽SEQIDNO:2、4、6、130、132、134和136;(b)包含选自下组的氨基酸序列的多肽SEQIDNO:2、4、6、130、132、134和136,其中fM戈、缺失、插入和/或添加一个或多个氨基酸，且该多肽具有与由选自下组的氨基酸序列组成的多肽等同的生物活性SEQIDNO:2、4、6、130、132、134和136;和(c)由多核芬酸编码的多肽，所述多核苷酸在严格条件下与由选自下组的核苷酸序列组成的多核苷酸杂交SEQIDNO:1、3、5、129、131、133和135，其中所述多肽具有与由选自下组的氨基酸序列组成的多肽等同的生物活性SEQIDNO:2、4、6、130、132、134和136。50.权利要求49的组合物，其中所述小干扰RNA包含SEQIDNO:21、25或144的核苦酸序列作为靶序列。51.权利要求50的组合物，其中所述siRNA具有通式5，-[A]-[B]-[A，]-3，，^巾[A]为对应于SEQIDNO:21、25或144的核苷酸序列的核糖核苷酸序列，[B]为由3-23个核苷酸组成的核糖核苷酸序列，和[A，]为由[A]的互补序列组成的核糖核苷酸序歹'J。52.权利要求49的组合物，所述组合物包含转染增强剂。53.—种治疗或预防膀胱癌的组合物，所述组合物含有药物有效量的抗选自下组的多肽的抗体(a)包含选自下组的氨基酸序列的多肽SEQIDNO:2、4、6、130、132、134和136;(b)包含选自下组的氨基酸序列的多肽SEQIDNO:2、4、6、130、132、134和136，其中取代、缺失、插入和/或添加一个或多个氨基酸，且该多肽具有与由选自下组的氨基酸序列组成的多肽等同的生物活性SEQIDNO:2、4、6、130、132、134和136;和(c)由多核苷酸编码的多肽，所述多核苷酸在严格条件下与由选自下组的核苦酸序列组成的多核苦酸杂交SEQIDNO:1、3、5、129、131、133和135，其中所述多肽具有与由选自下组的氨基酸序列组成的多肽等同的生物活性SEQIDNO:2、4、6、130、132、134和136作为有效成分，和药物可接受的载体。54.—种治疗或预防膀胱癌的组合物，所述组合物含有药物有效量的通过权利要求43-48中任一项的方法选择的化合物作为有效成分，和药物可接受的载体。55.—种治疗或预防膀胱癌的方法，所述方法包括施用药物有效量的反义多核苦酸或小干扰RNA的步骤，所述反义多核苷酸或小干扰RNA针对编码选自下组的多肽的多核苷酸(1)包含选自下组的氨基酸序列的多肽SEQIDNO:2、4、6、130、132、134和136;(2)包含选自下组的氨基酸序列的多肽SEQIDNO:2、4、6、130、132、134和136，其中^F又代、缺失、插入和/或添加一个或多个氨基酸，且该多肽具有与由选自下组的氨基酸序列组成的多肽等同的生物活性SEQIDNO:2、4、6、130、132、134和136;和(3)由多核苷酸编码的多肽，所述多核苷酸在严格条件下与由选自下组的核苷酸序列组成的多核苷酸杂交SEQIDNO:1、3、5、129、131、133和135，其中所述多肽具有与由选自下组的氨基酸序列组成的多肽等同的生物活性SEQIDNO:2、4、6、130、132、134和136。56.权利要求55的方法，其中所述siRNA包含SEQIDNO:21、25或144的核普酸序列作为靶序列。57.权利要求56的方法，其中所述siRNA具有通式5，-[A]-[B]-[A，]-3，，其中[A]为对应于SEQIDNO:21、25或144的核普酸序列的核糖核苦酸序列，[B]为由3-23个核苷酸组成的核糖核苦酸序列，和[A，]为由[A]的互补序列组成的核糖核苦酸序列。58.权利要求57的方法，其中所述组合物包含转染增强剂。59.—种治疗或预防膀胱癌的方法，所述方法包括施用药物有效量的抗体的步骤，所述抗体针对选自下组的多肽(a)包含选自下组的氨基酸序列的多肽SEQIDNO:2、4、6、130、132、134和136;(b)包含选自下组的氨基酸序列的多肽SEQIDNO:2、4、6、130、132、134和136,其中取代、缺失、插入和/或添加一个或多个氨基酸，且该多肽具有与由选自下组的氨基酸序列组成的多肽等同的生物活性SEQIDNO:2、4、6、130、132、134和136;和(c)由多核苦酸编码的多肽，所述多核苷酸在严格条件下与由选自下组的核苷酸序列组成的多核香酸杂交SEQIDNO:1、3、5、129、131、133和135，其中所述多肽具有与由选自下组的氨基酸序列组成的多肽等同的生物活性SEQIDNO:2、4、6、130、132、134和136。60.—种治疗或预防膀胱癌的方法，所述方法包括施用药物有效量的通过权利要求43-48中任一项的方法选择的化合物的步骤。61.—种治疗或预防膀胱癌的方法，所述方法包括施用药物有效量的选自(a)-(c)的多肽或编码该多肽的多核苷酸的步骤(a)包含选自下组的氨基酸序列的多肽或其片段SEQIDNO:2、4、6、130、132、134和136;(b)包含选自下组的氨基酸序列的多肽SEQIDNO:2、4、6、130、132、134和136，其中取代、缺失、插入和/或添加一个或多个氨基酸，且该多肽具有与由选自下组的氨基酸序列组成的多肽等同的生物活性SEQIDNO:2、4、6、130、132、134和136;(c)由多核苦酸编码的多肽或其片段，所述多核芬酸在严格条件下与由选自下组的核苦酸序列组成的多核苷酸杂交SEQIDNO:1、3、5、129、131、133和135，其中所述多肽具有与由选自下组的氨基酸序列组成的多肽等同的生物活性SEQIDN0:2、4、6、130、132、134和136。62.—种诱导抗肿瘤免疫的方法，所述方法包括如下步骤使选自(a)-(c)的多肽与抗原呈递细胞接触，或者将编码该多肽的多核苷酸或包含该多核苷酸的载体导入抗原呈递细胞(a)包含选自下组的氨基酸序列的多肽或其片段SEQIDNO:2、4、6、130、132、134和136;(b)包含选自下组的氨基酸序列的多肽SEQIDNO:2、4、6、130、132、134和136,其中取代、缺失、插入和/或添加一个或多个氨基酸，且该多肽具有与由选自下组的氨基酸序列组成的多肽等同的生物活性SEQIDNO:2、4、6、130、132、134和136;(c)由多核苷酸编码的多肽或其片段，所述多核苷酸在严格条件下与由选自下组的核苷酸序列组成的多核普酸杂交SEQIDNO:l、3、5、129、131、133和135，其中所述多肽具有与由选自下组的氨基酸序列组成的多肽等同的生物活性SEQIDNO:2、4、6、130、132、134和136。63.权利要求62的诱导抗肿瘤免疫的方法，其中所述方法进一步包括将抗原呈递细胞施用于受试者的步骤。64.—种治疗或预防膀胱癌的药物组合物，所述组合物含有药物有效量的选自(a)-(c)的多肽或编码该多肽的多核苷酸(a)包含选自下组的氨基酸序列的多肽或其片段SEQIDNO:2、4、6、130、132、134和136;(b)包含选自下组的氨基酸序列的多肽SEQIDNO:2、4、6、130、132、134和136，其中取代、缺失、插入和/或添加一个或多个氨基酸，且该多肽具有与由选自下组的氨基酸序列组成的多肽等同的生物活性SEQIDNO:2、4、6、130、132、134和136;(c)由多核苷酸编码的多肽或其片段，所述多核苷酸在严格条件下与由选自下组的核苷酸序列组成的多核苷酸杂交SEQIDNO:l、3、5、129、131、133和135,其中所述多肽具有与由选自下组的氨基酸序列组成的多肽等同的生物活性SEQIDNO:2、4、6、130、132、134和136作为有效成分，和药物可接受的载体。65.权利要求64的药物组合物，其中所述多核苷酸是并入表达载体的。66.诊断膀胱癌的诊断试剂，其中所述试剂含有寡核苷酸或抗体，所述寡核苷酸与编码多肽的多核苷酸杂交，所述多肽包含选自下组的氨基酸序列SEQIDNO:2、4、6、130、132、134和136,所述抗体与所述多肽结合。67.包含有义链和反义链的双链分子，其中所述有义链含有对应于SEQIDNO:21、25或144的核糖核苷酸序列，且其中反义链含有与所述有义链互补的核糖核苦酸序列，其中所述有义链和所述反义链相互杂交形成所述双链分子；而且其中将所述双链分子导入表达至少任意一个由选自SEQIDNO:1、3、5、129、131、133和135的核苷酸序列组成的基因的细胞时，所述双链分子可抑制所述基因的表达。68.权利要求67的双链分子，其中所述有义链含有来源于选自SEQIDNO:1、3、5、129、131、133和135的任一核苦酸序列的约19-约25个连续的核苷酸。69.权利要求67的双链分子，其中所述有义链由对应于SEQIDNO:21、25或144的核糖核苷酸序列组成。70.权利要求67的双链分子，其中单一核糖核苷酸转录物包含有义链和反义链，所述双链分子进一步包含连接所述有义链和所述反义链的单链核糖核香酸序列。71.—种载体，其编码权利要求67的双链分子。72.权利要求71的载体，其中所述载体编码具有二级结构的转录物，其中所述转录物包含有义链和反义链。73.权利要求71的载体，其中所述转录物进一步包含连接所述有义链和所述反义《连的单链核糖核苷酸序列。全文摘要本发明公开了旨在检测和诊断膀胱癌(BLC)的方法。在一类实施方案中，本诊断方法包括测定识别BLC细胞与正常细胞的BLC相关基因的表达水平的步骤。本发明还进一步利用一些BLC相关基因提供预测和预防膀胱癌转移的方法，所述BLC相关基因在淋巴结转移的膀胱癌细胞中具有独特的表达图式。最后，本发明提供用于膀胱癌治疗的治疗药物的筛选方法、膀胱癌的治疗方法及为对象接种膀胱癌疫苗的方法。特别是，本发明提供在膀胱癌中表达显著提高的新的人类基因C2093、B5860N和C6055。这些基因及由这些基因编码的多肽有许多应用，例如用于膀胱癌的诊断、用作开发针对疾病的药物的靶标分子及用于抑制膀胱癌的细胞增殖。文档编号C12Q1/68GK101175862SQ200680011580公开日2008年5月7日申请日期2006年2月9日优先权日2005年2月10日发明者中村佑辅,中鹤修一,片桐丰雅申请人:肿瘤疗法科学股份有限公司;国立大学法人东京大学