专利名称：：干固体分段发酵方法干固体分段发酵方法
技术领域：
0001本发明提供在发酵工艺中从可发酵基质生产最终产物，例如醇(比如乙醇)和含可溶物的干谷物酒糟(distillersdrygrainsolubles,DDGS)的方法。
背景技术：
：0002由于各种原因，包括持续且增加的对有限的石油供应的依赖性，以及乙醇产品是可再生能源的事实，从农作物中生产作为燃料来源的乙醇的商业生存能力已经重新引起世界范围内的兴趣。0003酒精发酵生产方法，特别是乙醇生产方法的一般特征在于湿磨或干磨方法。关于这些方法的综述，可参考Bothast等，2005,」;;/.MfcraWo/.说0化c/7"0/.67:19-25禾卩THEALCOHOLTEXTBOOK,3rdEd(K.A.Jacques等Eds)1999NottinghamUniversityPress,UK。0004一般而言，湿磨法包括一系列的浸泡(浸渍)步骤以软化谷物，其中可溶淀粉被移走，接着是回收胚芽、纤维(糠)和麸质(蛋白质)。通过干燥、化学和/或酶处理，进一步加工剩余的淀粉。然后该淀粉用于酒精产品、高果糖玉米浆或商品纯度级的淀粉。0005一般而言，干谷物碾磨法包括许多基本步骤，其包括碾碎、蒸煮、液化、糖化、发酵和固液分离，以生产酒精和其它联产物。一般地，所有谷物，例如玉米谷物，被碾磨成细颗粒大小，然后在浆槽内与液体混合。此浆液在蒸汽加压锅内与液化酶(例如a-淀粉酶)受到高温处理，以将谷物中的淀粉溶解并水解成糊精。混合物被冷却，并进一步用糖化酶(例如葡糖淀粉酶)处理以生产可发酵葡萄糖。然后含有葡萄糖的醪液(mash)在产生乙醇的微生物的存在下发酵大约24到120小时。将醪液中的固体从液相中分离出来，得到乙醇和有用的联产物如酒糟(图IA)。0006对上面的发酵方法已经进行了改进，是通过将糖化步骤和发酵步骤结合在一个工艺中实施的，该工艺被称作同时糖化与发酵或同时糖化、酵母繁殖和发酵。这些改进的发酵方法具有优于前面所描述的干磨发酵或甚至湿磨发酵法的优势，因为在发酵罐内没有发展显著的糖浓度，从而避免了糖对酵母生长的抑制。此外，由于缺乏容易利用的葡萄糖，细菌的生长得以减少。通过采用同时糖化和发酵的方法，可导致增加的乙醇产量。0007近来，已经引进这样的发酵方法，其消除了蒸煮步骤，或者其减少了在高温下处理谷物的需要。这些无蒸煮或低温发酵方法包括碾磨谷物和将磨碎的谷物与液体组合形成浆液，其然后与一种或多种粒状淀粉水解酶和任选的酵母混合，以生产乙醇和其它联产物(USP4，514，496，WO04/081193和WO04/080923)(图1B)。0008尽管使用磨碎谷物的浆液与粒状淀粉水解酶的组合的无蒸煮或低温发酵方法提供了优于以前方法的某些改进，但是本发明的干固体分段发酵方法提供生产酒精和其它最终产物的进一步的优势。这些优势中的一些包括，但不限于a)去除了浆槽或进料槽，其包含含有进料到糖化容器中的粒状淀粉的基质；b)降低了含有无菌粒状淀粉的基质发酵中的潜在微生物污染，原因在于去掉了糖化和发酵之前的浆液步骤；c)改善了混合，加快了基质的水化作用，以及改善了碳的转化效率，这是由于初始发酵的起始醪液中干固体百分比(％DS)较低；d)在发酵操作期间总的高固体装载；e)在残留淀粉水平的存在下相等或更高的乙醇浓度，所述残留淀粉水平在含有粒状淀粉的基质的其它无蒸煮或低温发酵方法中可能更高，这些方法不经历千固体分段；f)可选地去掉酵母种繁殖槽；g)减轻发酵期间酵母的压力；h)能处理研磨得很细的基质，这将会降低残留淀粉的量，但不会不利地导致发酵容器内醪液的粘度增加；和i)酶与可发酵基质的比例增加，这增强淀粉的水解。发明概述0009第一方面，本发明涉及用于生产最终产物的干固体分段发酵方法，该方法包括初始发酵步骤，其包括在pH为3.0到7.0、温度为5。C到65。C下，将第一可发酵基质与一种或多种淀粉水解酶和发酵生物在发酵容器内结合2到40小时，得到发酵液，以及装载步骤，其包括向含有发酵液的容器内添加第二可发酵基质，并允许在pH为3.0到7.0、温度为20。C到65。C下继续发酵足够时间期间，以生产最终产物，其中发酵液的干固体百分比(％DS)随时间增加。0010在该方面的一些实施方式中，第一可发酵基质和第二可发酵基质是相同的，和在其它实施方式中，第一可发酵基质和第二可发酵基质是不同的。在进一歩的实施方式中，可发酵基质是固体可发酵基质，和在另外的实施方式中，固体可发酵基质是干的磨碎的谷物。在该方面的其它实施方式中，初始DS为0到40%DS，而累积DS在10到55%之间。在该方面进一步的实施方式中，装载歩骤包括以1至20%的增量添加干固体(drysolid，DS)。在仍然进一步的实施方式中，所述一种或多种淀粉水解酶选自葡糖淀粉酶、a-淀粉酶、粒状淀粉水解酶和其组合。在又一实施方式中，最终产物是酒精，而发酵生物是酵母。0011第二方面，本发明涉及用于生产酒精的干固体分段发酵方法，该方法包括初始发酵步骤，其包括在pH为3.0到6.0、温度为5'C到65'C下，将可发酵基质、一种或多种水解酶和发酵生物在发酵容器内结合2到40小时，得到发酵液，以及装载步骤，其包括向含有发酵液的容器内添加固体可发酵基质，并允许在pH为3.0至1」6.0、温度为20'C到55'C下继续发酵足够时间期间，以生产酒精，其中发酵液的干固体百分比(％DS)随时间增加。0012第三方面，本发明涉及用于生产乙醇的干固体分段发酵方法，该方法包括初始发酵步骤，其包括直接向发酵容器中加入固体可发酵基质，在pH为3.0到6.5、温度为20'C到55'C下，将固体可发酵基质与酵母以及与选自葡糖淀粉酶、a-淀粉酶、粒状淀粉水解酶和其组合的一种或多种淀粉水解酶，在发酵容器内结合2到40小时，得到发酵液，以及装载步骤，其包括向含有发酵液的容器内直接加入固体可发酵基质，允许在pH3.0到6.5、温度2(TC到55'C下继续发酵足够时间期间，以生产乙醇，其中发酵液的千固体百分比(％DS)随时间增加。在该方面的一些实施方式中，所述固体可发酵基质是干的磨碎的谷物。在该方面进一步的实施方式中，在装载步骤过程中，向发酵容器中添加附加量的所述一种或多种淀粉水解酶和/或酵母。0013第四方面，本发明涉及一种在用于生产酒精的发酵液中增加累积干固体(DS)的方法，其包括采用本发明所包括的干固体分段发酵方法。0014第五方面，本发明涉及降低可发酵基质发酵期间的细菌污染的方法。该方面的一个实施方式包括在本发明所包括的干固体分段发酵工艺过程中，向发酵容器中直接加入固体可发酵基质，例如干的磨碎的谷类。0015图1A、1B和1C是图解酒精发酵生产工艺的总示意图表。0016图1A阐明了传统的干磨酒精发酵工艺，其包括在糖化和发酵之前使含粒状淀粉的基质浆液经历高温液化步骤；0017图IB阐明了无-蒸煮干磨酒精发酵工艺，其包括在同时糖化和发酵工艺中，在低于基质的粒状淀粉胶凝温度的温度下，将含粒状淀粉的基质浆液与粒状淀粉水解酶结合；和0018图1C阐明了本发明所包括的干固体分段发酵工艺的实施方式，其包括在初始发酵步骤和装载步骤过程中，向糖化和发酵容器中直接加入干的磨碎的谷物，其中去掉了包括含粒状淀粉的谷物的含水混合物的浆槽。0019图2阐明了在初始发酵步骤开始15小时之后，在装载步骤中，以l小时的间隔，加入干燥、固态、磨碎的玉米，共计10小时，在初始干固体(DS)为7%、10%和15%时，来自玉米的酒精随时间(小时)的回收率(％(v/v))，其中累积DS为30。/。，以及，一麗一代表初始7。/。DS;—命一代表初始10%DS;_X—代表初始15。/。DS,和一A—代表在发酵开始时加入的基线30WDS。可参考实施例3。0020图3提供具有粒状淀粉水解(GSH)活性的灰腐质霉嗜热变种(//w"z/co/agn'^a、w://7trwo/t/ea)的葡糖淀粉酶的成熟氨基酸序列(SEQIDNO:1)。0021图4提供具有粒状淀粉水解(GSH)活性的泡盛曲霉河内变种C4j/erg///^mvawoA7'vwfewac//)的葡糖淀粉酶的成熟氨基酸序列(SEQIDNO:2)。0022图5提供具有粒状淀粉水解(GSH)活性的河内曲霉04^wg///^bwacW)的a-淀粉酶的成熟氨基酸序列(SEQIDNO:3)。发明详述0023除非本发明另有定义，本文所使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的一名普通技术人员一般理解的相同的含义。0024尽管与本发明所述的那些相似或等价的任何方法和材料均可以应用在本发明的实施或实验中，但是优选的方法和材料被描述。0025本发明现在仅用下面的定义和实施例通过参考的方式予以详细描述。本发明所提及的所有专利和出版物，包括在这些专利和出版物中所公开的所有序列，被清楚地并入作为参考。定义0026短语"干固体分段"指的是发酵方法中包括初始发酵步骤和装载步骤在内的至少两个步骤。0027"初始发酵步骤"指的是在适合开始发酵的条件下，在发酵容器内将可发酵基质与一种或多种淀粉水解酶和发酵生物相结合。0028"装载步骤"指的是初始发酵步骤之后，向包括一种或多种淀粉水解酶和发酵生物的发酵容器中加入可发酵基质，以及可发酵基质的继续发酵。0029术语"发酵"指的是有机物质通过微生物的酶分解和厌氧分解，以产生更简单的有机化合物。尽管发酵在厌氧条件下发生，但并不意味着该术语仅限于严格的厌氧条件，因为发酵在氧存在下也发生。0030短i吾"同时糖f七禾卩发酵(simultaneoussaccharificationandfermentation,SSF)"指的是生产最终产物的工艺，其中发酵生物，例如产生乙醇的微生物，和至少一种酶，例如糖化酶，在同一容器中，在同一个工艺中被结合。0031术语"糖化"指的是不能直接利用的多糖向单糖或低聚糖的酶转化，以便发酵转化为最终产物。0032术语"可发酵基质"指的是两种碳基质，其能被酶促转化为一种可发酵糖和多种可发酵糖。0033术语"碳基质"指的是含有植物基材料的纤维素、半纤维素和/或淀粉。0034术语"固体可发酵基质"指的是植物基可发酵基质，其基本上不含外加水或其它水成液。0035术语"干的磨碎的谷物"指的是这样的固体可发酵基质，其是磨碎的谷物，其基于干重的含湿量大约在2%和25%之间。0036短语"固体可发酵基质的直接进料"或"直接加入固体可发酵基质"指的是将固体可发酵基质转移到发酵容器中，而不是首先在浆槽或存ft槽或类似容器内与水溶液结合。在一些实施方式中，直接进料是将固体可发酵基质转移到发酵容器中而不加入外加的水成液，以及在其它实施方式中，直接进料包括将固体可发酵基质与水成液相混合的管线内(in-line)加料方式。0037"可发酵糖"指的是单糖或二糖，其可以在发酵工艺中被与该可发酵糖接触的微生物转化而生产最终产物。在一些实施方式中，可发酵性糖被微生物代谢，而在其它实施方式中，通过微生物的酶的表达和/或分泌实现了可发酵糖期望的转化。0038如本文所使用，"单糖"指的是聚合物的单体单元，例如淀粉，其中聚合度(DP)为l(例如，葡萄糖、甘露糖、果糖和半乳糖)。0039如本文所使用，"二糖"指的是任何化合物，其包括两个共价键连接的单糖单元(DP2)。该术语包括，但不限于如蔗糖、乳糖和麦芽糖这样的化合物。0040如本文所使用，DP〉3意指聚合度大于3的聚合物。0041如本文所使用，"低聚糖"指的是具有以糖苷键连接的2-10个单糖单元的任何化合物。0042如本文所使用，"多糖"指的是具有以直链或支链连接的多个单糖单元的任何化合物。在一些实施方式中，该术语是指含有成百或成千个单糖单元的长链。多糖典型的例子是淀粉、纤维素和糖原。0043如本文所使用，术语"淀粉"指的是包括植物的复杂多糖碳水化合物的任何材料，其包括式(C6Hu)05)x的直链淀粉和支链淀粉，其中X可以是任何数字。0044术语"粒状淀粉"指的是生(未蒸煮的)淀粉，例如还没有经历胶凝作用的粒状淀粉。0045术语"纤维素"指的是任何含有纤维素的材料。特别地，该术语是指式(C6Hu)05)x的葡萄糖(纤维二糖)的聚合物，其中X可以是任何数字。0046如本文所使用，术语"干固体含量(drysolidscontent,DS)"指的是基于干重的以百分比(％)计的浆液的总固体。0047术语"累积DS"指的是在发酵工艺中的时间期间内加入的总e/。DS。0048术语"初始DS"指的是发酵工艺开始时发酵介质或发酵液中的。/。DS。在一个实施方式中，初始DS是指在本发明的干固体分段发酵方法的初始发酵步骤开始时发酵介质中的。/。DS。0049短语"发酵液的干固体百分比(％DS)随时间增加"指的是累积DS，其大于初始DS，原因在于在装载步骤中可发酵基质的加入。该增加可以通过可发酵基质递增的、连续的或一次性的加入来实现。0050术语"浆液"指的是含有不溶性固体(例如粒状淀粉)的含水混合物。0051术语"醪液(mash)"指的是在发酵产物生产中所使用的液体形式的可发酵基质的混合物，并且被用于指发酵的任何阶段，从可发酵基质与一种或多种淀粉水解酶和发酵生物的初始混合直到发酵运转完成。有时术语"醪液"、"浆液"、"发酵液"、"发酵介质"和"饮料(beer)"这些术语可交换使用。在一些实施方式中，术语发酵液是指发酵介质，其包括发酵生物(fermentingorganism)。0052术语"磨碎(milling)"指的是谷物分解成更小的颗粒。在一些实施方式中，这个术语与碾碎(grinding)交互使用。0053术语"干磨法(drymilling)"指的是干燥的整粒谷物的碾磨，其中谷物的小部分，例如胚芽和糠，还没有被特意去除。0054如本文所使用，术语"干谷物酒糟(distillersdriedgrain,DDG)"和"带可溶物的干谷物酒糟(distillersdriedgrainwithsolubles,DDGS)"指的是谷类发酵方法中的有用的联产物。0055术语"残留淀粉"指的是含淀粉的可发酵基质发酵之后在组合物中留下的残余淀粉(可溶的和不溶的)。0056术语"糖化酶"和"淀粉水解酶"指的是任何能将淀粉转化成单糖或低聚糖的酶。0057术语"葡糖淀粉酶"指的是酶中的淀粉葡糖甘酶类别(例如，E.C.3.2丄3、葡糖淀粉酶、1,4-a-D-葡聚糖葡糖水解酶(1.4-alpha-D-glucanglucohydrolase))。这些是外部作用酶，其从直链淀粉和支链淀粉的非还原性端部释放葡糖基残基。所述酶也水解a-l,6和a-l，3键，尽管是以比a-1,4键慢得多的速度。0058术语"粒状淀粉水解(GSH)酶"和"具有粒状淀粉水解(GSH)活性的酶"指的是具有水解颗粒形式的淀粉能力的酶。0059术语"淀粉水解"指的是借助水分子加入的糖苷键的切割。0060术语"a-淀粉酶(例如E.C.类3.2丄1)"指的是催化a-l,4糖苷键水解的酶。这些酶也被予以描述，如那些影响含有1,4-a连接的D-糖苷单元的多糖中的1，4-a-糖苷键的外水解或内水解的酶。用于描述这些酶的另一个术语是"糖原酶"。0061术语"胶凝"的意指通过蒸煮淀粉溶解而形成粘性悬浮液。0062术语"胶凝温度"指的是含淀粉的基质胶凝开始的最低温度。胶凝的精确温度取决于特定的淀粉，而且可以取决于如植物种类及环境和生长条件之类的因素而变化。0063术语"低于胶凝温度"指的是低于开始凝胶的温度的温度。0064术语"液化"指的是淀粉转化中的阶段，其中胶凝化淀粉水解而产生低分子量的可溶性糊精。0065术语"稀酒糟(thin-stillage)"指的是所形成的发酵液体部分，其含有溶解的物质和悬浮的细粒，并且其是从发酵所产生的固体部分分离出来的。0066术语"容器"包括但不限于槽、桶、瓶子、烧瓶、袋、生物反应器及类似物。在一个实施方式中，该术语是指适合于进行本发明涉及的糖化和/或发酵工艺的任何贮器。0067术语"最终产物"指的是从可发酵基质被酶转化的任何碳源衍生产物。在一些优选的实施方式中，最终产物是酒精，例如乙醇。0068如本文所使用，术语"发酵生物"指的是适宜用在发酵中用于直接或间接生产最终产物的的任何微生物或细胞。0069如本文所使用，术语"乙醇生产者(ethanolproducer)"或"生产乙醇的微生物"指的是能从单糖或低聚糖中生产乙醇的发酵生物。0070术语"抗坏血酸中间体(ascorbicacidintermediate,ASA)"是指下列化合物中的任何一个D-葡糖酸酯、2-酮-D-葡糖酸酯(2-keto-D-gluconate，2KDG)、2,5-二酮-D-葡糖酸酯(2，5-keto-D-gluconate，2,5-DKG)、2-酮-L-葡糖酸(2-keto-L-gulonicacid,2KLG)、异抗坏血酸(erythorbicacid,EA)和抗坏血酸(ascorbicacid，ASA)。0071如本文所使用，"抗坏血酸中间体生产者"指的是能从单糖中生产ASA中间体的发酵生物。0072如本文所使用，"甘油生产者"指的是能从单糖中生产甘油的发酵生物。0073如本文所使用，"二醇生产者"指的是能利用甘油生产1,3-丙二醇的发酵生物。0074术语"衍生的"包括术语"来源于"、"得到"、"从……中可得的"和"从……中分离的"，而且在如本文所使用的一些实施方式中，是指核苷酸序列所编码的多肽是从该核苷酸天然存在的或该核苷酸被插入其中的细胞中产生的。0075术语"异源蛋白质"指的是并非天然存在于宿主细胞中的蛋白质或多肽。术语"同源蛋白质"指的是在宿主细胞中天然存在的蛋白质或多肽。0076术语"酶转化"一般指的是在酶的作用下基质的改性。如本文所使用，该术语也指通过酶的作用可发酵基质的改性，例如含粒状淀粉的基质。0077如本文所使用，术语"回收"、"分离"、"分开"指的是从与其天然相连的至少一个成分中去除的化合物、蛋白质、细胞、核酸或氨基酸。0078如本文所使用，术语"比活性"是指酶单位，定义为在特定条件下每单位时间通过酶制剂转化为产物的基质的摩尔数。比活性表达为单位(U)/mg蛋白质。0079如本文所使用，"酶单位"是指在实验特定条件下每分钟生产1微摩尔产物的酶数量。例如，在一个实施方式中，术语"葡糖淀粉酶活性单位(glucoamylaseactivityunit，GAU)"定义为在60。C和pH4.2的实验条件下，每小时从可溶淀粉基质(4%DS)生产lg葡萄糖所需的酶的数量。0080术语"产量"指的是采用本发明的方法所生产的最终产物的数量。在一些实施方式中，该术语是指最终产物的体积，和在其它实施方式中，该术语是指最终产物的浓度。0081术语"DE"或"葡萄糖当量"是用于测量总的还原糖浓度的工业标准，基于干重以D-葡萄糖计算。未水解的粒状淀粉的DE基本上为O和D-葡萄糖的DE为100。0082术语"糖浆"是指含有可溶性碳水化合物的含水组合物。在一个实施方式中，糖浆是含有葡萄糖的浆液。0083如本文所使用，术语"包含(comprising)"及其同源词是以其包括的意思使用的；也就是，等价于术语"包括(including)"及其对应的同源词。0084"一个(a)"、"一个(an)"和"所述(the)"包括复数指代，除非上下文明确地另外规定。0085数字范围包括定义该范围的数字。0086本文所提供的标题并不是对本发明的各个方面或实施方式的限定，其可以通过参考发明书整体上来理解。原材料可发酵基质0087对本发明有用的可发酵基质包括碳基质，例如含有纤维素和淀粉的植物基材料，以及糖类。合适的植物包括但不限于小麦、玉米、黑麦、高粱、水稻、粟、大麦、木薯、木薯淀粉、马铃薯、甘薯、甜菜、甘蔗、和豆类，例如大豆和豌豆。植物的任何部分可以用作可发酵基质，包括但不限于植物部分，例如叶、茎、外壳、荚、块茎、玉米芯、谷粒和类似物。在一些实施方式中，基本上整个植物都可以使用，例如，全部的玉米秸秆都可以使用。在一个优选的实施方式中，整粒谷物被用作可发酵基质。优选的整粒谷物包括玉米、小麦、黑麦、大麦和高粱(买罗高粱(milo))。此外，杂交玉米，其已经被开发来增加乙醇产量，也应用于本发明的方法中。这些杂交品种特征可能在于高的总可发酵淀粉和/或高的可提取淀粉。另外，可发酵粮谷基质在发酵之前可以被分解成多个部分，包括纤维、胚乳和/或胚芽。分解植物材料例如玉米和小麦的方法在本领域是已知的。0088在一些实施方案中，含有粒状淀粉的可发酵基质可以是来自淀粉精制工艺的高精制生淀粉或原料。许多淀粉是商业可得的。例如，玉米淀粉可从Cerestar、Sigma和Katayama化学工业公司(日本)得到；小麦淀粉可从Sigma得到；甘薯淀粉可从Wako纯化学工业公司(日本)得到；马铃薯淀粉可从Nakaari化学制药公司(日本)得到。0089本领域普通技术人员对制备在本发明所包括的方法中使用的植物基质和尤其谷物的可利用方法很清楚。在一些实施方式中，可发酵基质可以采用诸如磨碎的方法制备。特别地，碾磨整粒谷物的方法是已知的，而且包括使用锤磨机和轧制机。0090在本发明方法的一些实施方式中，可发酵基质尤其是谷物被碾磨成细颗粒大小，以使至少80%、至少85%、至少90%和至少95%的可发酵基质将通过0.5mm的筛子GO目数)。在其它实施方式中，谷物被磨成粗颗粒大小，以使50%以下、40%以下、30%以下和20n/。以下磨碎的谷物将通过0.5mm的筛子。0091尽管在某些实施方式中，优选的可发酵基质是包含粒状淀粉的植物或植物部分，但是在其它的实施方式中，可溶形式的淀粉被用作可发酵基质。可溶形式的淀粉包括可再生原料的未提纯混合物，例如玉米糖浆、糖蜜(例如甜菜或甘蔗)、大麦芽、糖类代用品、高果糖玉米糖浆和转化糖。0092在一些实施方式中，可发酵基质是可溶性糖，例如单糖和/或二糖。单糖包括己糖，例如葡萄糖、甘露糖、艾杜糖和半乳糖，而且包括戊糖，例如核糖、木糖和阿拉伯糖。二糖包括蔗糖、乳糖、麦芽糖和纤维二糖。在一些实施方式中，可发酵糖是葡萄糖、果糖、蔗糖或其组合。0093在一些实施方式中，可发酵基质包括酒糟(stiUage)，其是非发酵固体和水的混合物，是从醪液中去除酒精之后的剩余物。此外，酒糟的液体部分，被称为稀酒糟，可用作可发酵基质。0094其它可发酵基质包括农业居住用材料和木素纤维素材料，例如玉米秸秆、begasses、木材、木片、木桨和锯屑。纸质废物例子包括但不限于任何类型的废弃纸(例如，影印纸、笔记本纸)、报纸、纸板和杂志。淀粉水解酶葡糖淀粉酶0095葡糖淀粉酶(GA)(E.C.3.2丄3)可以来自细菌、植物和真菌来源的异源或内源蛋白质表达。应用在本发明的组合物和方法中的优选葡糖淀粉酶是由几种丝状真菌和酵母菌株产生的。特别地，曲霉属和木霉属的菌株分泌的葡糖淀粉酶在商业上是很重要的。合适的葡糖淀粉酶包括天然存在的野生型葡糖淀粉酶以及葡糖淀粉酶变种和基因工程突变型葡糖淀粉酶。下面的葡糖淀粉酶是可以应用在本发明所包括的方法中的葡糖淀粉酶的非限定实施例。黑曲霉(As77《g///^"/ge。Gl和G2葡糖淀粉酶(Boel等，(1984)EM^OJ3:1097-1102;WO92/00381,WO00/04136禾nUSP6,352,851);泡盛曲霉(」印"g///^"viwwon〕葡糖淀粉酶(WO84/02921);米曲霉(A/wrg〃/船o,yzoe)葡糖淀粉酶(Hata等，(1991)^g〃'cS/o/.Ozem.55:941-949)和Ape/'g/Z/wi's/"7wwam!'葡糖淀粉酶(参见Chen等，(1996)Prot.Eng.9:499-505;Chen等(1995)8:575-582;和Chen等，(1994)肠由w./302:275-281)。0096葡糖淀粉酶也可以从下列菌株获得篮状菌(ra/w0m_yC")的菌株，例如来自埃默森篮状菌(7:eweraom)、Z/^c"to""5、杜邦篮状菌(Uwpo"〃)、嗜热篮状菌f/;e膽冲7w)(WO99/28488;USPNo.RE:532,153;USPNo.4，587.215)那些;根霉属(脂o戸)的菌株，例如雪白根霉"/丽)和米根霉(/.Ow"e);毛霉属(M"cor)的菌株和腐质霉(//ww/'co/t7)的菌株，例如灰色腐质露(//.gn:ve")(参见Boela/.，(1984)￡MBO./.3:1097-1102;WO92/00381;WO00/04136;Chen"(1996)iVw.9:499-505;Taylor""/..(1978)C",.6o/y^ra,e61:301-308;USPat.No.4,514,496;USPat.No.4,092,434;禾IJJensen第(1988)Can./M'croWo/.34:218-223)。其它应用于本发明中的葡糖淀粉酶包括那些从罗耳阿太菌(A/;e/,'",'o诉")得到的酶及其变体(WO04/111218)。0097商业使用的具有葡糖淀粉酶活性的酶例如可以从黑曲霉(商品名DISTILLASE、OPTIDEXL-400和GZYMEG9904X，来自GenencorInternationalInc.)或根霉属某种(商品名CU.CONC，来自日本ShinNihonChemicals)产生。还有商品消化酶，来自曰本AmanoOharmaceuticals，商品名为GLUCZYME(Takahashi等，(1985)J.Biochem.98:663-671)。另外的酶包括根霉属某种的三种形式的葡糖淀粉酶(E.C.3.2.1.3),即"Glucl"(MW74,000)、"Gluc2"(MW58,600)禾口"Gluc3"(MW61,400)。酶制剂GC480(GenencorInternationalInc.)也在本发明中得到应用。a-淀粉酶-0098在本发明所包括的一些实施方式中，a-淀粉酶是具有E.C.编号的微生物酶，E.C.3.2丄1-3和特别地E.C.3.2丄1。在一些实施方式中，a-淀粉酶是耐热细菌a-淀粉酶。在其它实施方式中，a-淀粉酶是耐酸a-淀粉酶。合适的a-淀粉酶可以是天然存在的以及重组和突变型a-淀粉酶。在特别优选的实施方式中，a-淀粉酶衍生自芽孢杆菌属种类。优选的芽孢杆菌属种类包括枯草芽孢杆菌(及swW/!'s)、嗜热脂肪芽孢杆菌(5.Wewo^ew70^,7^)、缓慢芽孢杆菌(及/e"//")、地衣芽孢杆菌(5.//c/je—/bm^)、凝结芽孢杆菌(Rcoagw/朋s)和解淀粉芽孢杆菌(及(USP5，093，257;USP5,763,385;USP5,824,532;USP5,958.739;USP6,008,026.USP6,361,809;USP6，867,031;WO96/23874;WO96/39528和WO05/001064)。特别优选的a-淀粉酶衍生自芽孢杆菌属菌株嗜热脂肪芽孢杆菌(及,s'/eora//7m;o;/w7ws)、解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)和地衣芽孢杆菌(及/7'c/w"^w;〃、)。也可参考具有ATCC39709、ATCC11945、ATCC6598、ATCC6634、ATCC8480、ATCC9945A和NCIB8059的菌株。0099在本发明的组合物和方法中考虑使用的商业可得的a-淀粉酶包括SPEZYMEAA;SPEZYMEFRED;SPEZYMEETHYL;GZYMEG997(Ge謹corInternationalInc.)和TERMAMYL120-L、LC、SC和SUPRA(NovozymesBiotech)。0100除细菌a-淀粉酶之外，真菌a-淀粉酶也考虑应用在本发明的发酵方法中。合适的真菌a-淀粉酶衍生自曲霉菌属，如米曲霉和黑曲霉(例如FUNGAMYL和CLARASEL)。粒状淀粉7K解酶(Glanularstarchhydrolyzingenzymes,GSHEs)-0101GSHEs能水解粒状(生)淀粉，而且这些酶已经从真菌、细菌和植物细胞中回收，例如芽孢杆菌属某种。a"7/""p.)、青霉属某种(尸em'"7/!'訓、腐质霉属某种(//wm/ra/",甲.)、木霉属某种(7Wc/w6fen"a平)、曲霉属某种"印"g/〃^印.)、毛霉属某种(MwcoA"平)和根霉属某种(/^&o;w印.)。在一个实施方式中，具有GSH活性的一组特别的酶包括具有葡糖淀粉酶活性和/或a-淀粉酶活性的酶(参见Tosi等,(1993)Can.J.Microbiol.39:846-855)。米根霉粒状淀粉水解酶已经在Ashikari寧，(1986)^gr/c所o/.C7w附.50:957-964禾卩USP4，863，864中予以描述。灰腐质霉粒状淀粉水解酶已经在AUison#"，(1992)O/rrGe"e/.21:225-229和EuropeanPatentNo.171218中予以描述。泡盛曲霉河内变种粒状淀粉水解酶已经在Hayashida筝,(1989)爿gn'c.C/ww53:923-929中予以描述。s/2,Voww，"'的粒状淀粉水解酶已经在Shibuya筝(1990)^r/'c.别o/.54:1905-1914中予以描述。0102在一个实施方式中，GSHE可具有葡糖淀粉酶活性且衍生自灰腐质霉菌株，特别是灰腐质霉嗜热变种菌株(参见USP4,618,579)。在优选的实施方式中，灰腐质霉嗜热变种是在真菌宿主细胞、特别地木露属宿主细胞如里氏木導(:rr化w/)宿主细胞中已经被异源表达的菌株。在一些优选的实施方式中，具有GSH活性的腐质霉酶与SEQIDNO:l的氨基酸序列具有至少85%、卯％、92%、94%、95%、96%、97%、98%和99%的序列同一性。0103在另一个实施方式中，GSHE可以具有葡糖淀粉酶活性，而且衍生自泡盛曲霉菌株，尤其是泡盛曲霉河内变种菌株。在优选的实施方式中，泡盛曲霉河内变种是在真菌宿主细胞中已经被异源表达的菌株，例如曲霉属或木霉属宿主细胞，以及尤其是里氏木霉宿主细胞。在-些优选的实施方式中，具有GSH活性的泡盛曲霉河内变种酶与SEQIDNO:2的氨基酸序列具有至少85%、90%、92%、94%、95%、96%、97%、98%和99%的序列同一性。0104在另一个实施方式中，GSHE可以具有葡糖淀粉酶活性，而且衍生自根霉属菌株，例如雪白根霉或米根霉。衍生自Koji菌株雪白根霉的酶以商品名"CUCONC"销售，或者来自根霉的酶以商品名GLUZYME销售。0105具有葡糖淀粉酶活性的另一有用的GSHE是SPIRIZYMEPlus(NovozymesA/S)，其也包括酸性真菌淀粉酶活性。0106在另一个实施方式中，GSHE可以具有a-淀粉酶活性，而且衍生自曲霉菌株，例如菌株泡盛曲霉、黑曲霉、米曲霉或河内曲霉的菌株，特别是河内曲霉的菌株。0107在优选的实施方式中，河内曲霉是在真菌宿主细胞内已经被异源表达的菌株，例如木霉属或曲霉属宿主细胞，特别是雪白木霉宿主细胞。在一些优选的实施方式中，具有GSH活性的河内曲霉的酶与SEQIDNO:3的氨基酸序列具有至少85%、卯％、92%、94%、95%、96%、97%、98%和99%的序列同一性。0108在一些实施方式中，具有GSH活性的酶是杂交酶，例如，一种这样的杂交酶，其含有a-淀粉酶的催化结构域——如黑曲霉a-淀粉酶、米曲霉ci-淀粉酶或河内曲霉a-淀粉酶的催化结构域，和不同的真菌a-淀粉酶或葡糖淀粉酶的淀粉结合结构域，例如河内曲霉和灰腐质霉的淀粉结合结构域。在其它的实施方式中，具有GSH活性的杂交酶可以包括葡萄淀粉酶的催化结构域——如曲霉属某禾中(/1/^^///15^)、篮状菌属某种(ra/ara附少c"^.)、蜀葵某禾中(X/Ae")、木霉属某种(7Wc/w&mo取)或根霉属某种(//^opzw取)的催化结构域，和不同的葡糖淀粉酶或ci-淀粉酶的淀粉结合结构域。一些具有GSH活性的杂交酶公开在WO05/003311,WO05/045018;Shibuya等，(1992)所Wc/.Z/"d化w56:1674—1675和Cornett等，(2003)尸,wto'"E叫"'"tw/wg16:521-520中。0109在一些实施方式中，在干固体分段发酵方法中所使用的GA或GSHE的量以GAU测量。在优选的实施方式中，本领域的技术人员将使用如在本文实验部分所描述的试验来测定GAU。此外，其它方法包括3，5-二硝基水杨酸溶液(3，5-dini加salicylicacid，DNS)方法(参见Goto等，(1994)Biosci.Biotechnol.Biochem.58:49-54)。在一些实施方式中，以GAU测得的葡糖淀粉酶在0.001与15.0GAU/gDS之间、在0.01与10GAU/gDS之间、在0.01与5.0GAU/gDS之间、在0.05与10.0GAU/gDS之间、在0.1与10.0GAU/gDS之间、在0.1与5.0GAU/gDS之间、在0.1与2.0GAU/gDS之间和在0.25与1.5GAU/gDS之间。0110在其它的实施方式中，在发酵方法中使用的a-淀粉酶的量为0.01至40SSU/gDS、在0.01与30.0SSU/gDS之间、在0.01与20SSU/gDS之间、在0.01与15.0SSU/gDS之间、在0.01与10SSU/gDS之间、在0.01与5.0SSU/gDS之间、在0.05与10.0SSU/gDS之间、在0.05与5.0SSU/gDS之间、在0.1与10.0SSU/gDS之间、在O.l与5.0SSU/gDS之间、在0.1与2.0SSU/gDS之间、在0.25与2.5SSU/gDS之间和在0.5与1.5SSU/gDS之间。0111在本发明的一些实施方式中，在混合组合物中提供了淀粉水解酶。特别有用的酶组合物包括具有a-淀粉酶活性的GSHE与葡糖淀粉酶的混合物。一个有用的组合物将包括具有0.1到10GAU/gDS的GA和具有0.01到15.0SSU的a-淀粉酶。特别有用的掺合物包括来自黑曲霉的GA如DISTILLSE和来自河内曲霉的具有GSH活性的a-淀粉酶的组合物。另一有用的组合物包括GA和衍生自灰腐质霉的具有GSH活性的葡糖淀粉酶。0112在一些实施方式中，在发酵中使用的具有a-淀粉酶活性(SSU)的GSHE与具有GA活性(GAU)的酶的比例将在15:1至1:15的范围内。在进一步的实施方式中，该比例(SSU与GAU)将在大约10:1至1:10、大约10:1至1:5、大约5:1至1:5、大约4:1至1:4、大约3:1至1:3、大约2:1至1:4和大约2:1至1:2的范围内。在一些优选的实施方式中，SSU与GAU的比例将在大约4:1与2:1之间。次级酶0113次级酶可以被应用在根据本发明的干固体分段发酵方法中，这些酶中的一些包括蛋白酶、P-淀粉酶、纤维素酶、半纤维素酶、支链淀粉酶、木聚糖酶、e-葡聚糖酶、肌醇六磷酸酶、果胶酶、木聚糖酶、脂肪酶、角质酶(cutinase)和其组合。特别优选的次级酶包括蛋白酶、纤维素酶、支链淀粉酶和P-淀粉酶。0114合适的蛋白酶包括微生物蛋白酶，例如真菌和细菌的蛋白酶，例如，酸性真菌蛋白酶，例如FERMENZYME以及GC106(GenencorInternationalInc.)。优选的真菌蛋白酶衍生自曲霉属(例如来自黑曲霉和米曲霉的蛋白酶)、毛霉属(例如米黑毛霉(M""'ete/))、木霉属、根霉属和念珠菌(CamZ/tfe)的菌株。优选的细菌蛋白酶衍生自芽孢杆菌属的菌株，如液化淀粉芽孢杆菌。添加到发酵中的蛋白酶可以增加游离氨基氮的水平和增加酵母的代谢速度并进一步提供更高的发酵效率。0115可以应用在本发明的方法中的另一种酶包括e-淀粉酶(E.C.3.2丄2)。这些酶是外部作用的麦芽糖淀粉酶(exo-actingmaltogenicamylase),其催化直链淀粉、支链淀粉和相关的葡萄糖聚合物中1,4-a-糖苷键的水解。商业上的e-淀粉酶可从GenencorInternationalInc.得到，而且例子包括SPEZYMEBBA和OPTIMALBBA。0116纤维素酶(E.C.3.2丄4)，例如内切葡聚糖酶，可以应用在本发明的干固体分段发酵方法中。纤维素酶的例子包括来自丝状真菌如木霉菌、腐质霉菌、镰刀菌和曲霉菌的纤维素酶。商业纤维素酶以SPEZYMECP(GenencorInternationalInc.)禾卩CELLUZYME(NovozymesA/S)可得。0117在干固体分段发酵方法中可用的木聚糖酶可以来自细菌或真菌来源，例如曲霉菌、木霉菌、链孢菌(A^/ro^ora)和镰刀菌(Awar/ww人商业制剂包括SPEZYMECP(GenencorInternationalInc.)和ULTRAFLOW(NovozymesA/S)。0118肌醇六磷酸酶的例子如(E.C.3丄3.8和3.1.3.26)包括PHYTASE(NovozymesA/S)。0119干固体分段发酵方法中所包括的这些酶的有效量可以容易地由本领域技术人员确定。发酵生物0120取决于期望的最终产物，不同的发酵生物可以被用在干固体分段发酵方法中。这些发酵生物可以是野生型生物或修饰的生物(modifiedorganism)。例如，异源表达酶的修饰的生物，或者过量表达通常由野生型生物产生的酶的修饰的生物。发酵生物的优选例子是产乙醇微生物(ethanologenicmicroorganism)或产生乙醇的微生物，例如产乙醇细菌，其表达乙醇脱氢酶和丙酮酸酯(pyruvate)脱氢酶，而且其可以从运动发酵单孢菌(Zy附owomw.MoWfc)中得到(参见，例如USP5,000,000;USP5,028,539;USP5,424,202;USP5,514,583和USP5,554,520)。在另外的实施方式中，产乙醇微生物表达木糖还原酶和木糖醇脱氢酶、将木糖转化成木酮糖的酶。在进一步的实施方式中，木糖异构酶被用于将木糖转化成木酮糖。在特别优选的实施方式中，使用能够使戊糖和己糖发酵为乙醇的微生物。举例来说，在一些实施方式中，微生物可以是天然的或非基因工程微生物，或者在其它实施方式中，微生物可以是重组微生物。举例来说，在一些实施方式中，优选的发酵微生物包括来自芽孢杆菌属、乳酸菌属(丄fl"Wacv7/M)、大肠杆菌属(￡.co/,')、欧文氏菌属(五nWm'a)、泛菌属(Pa"/oe")(例如拧檬泛菌(尸.c/加a))禾口克雷伯氏杆菌属(火/A^//0)(例如产酸克雷伯氏杆菌(尺m7""7))的细菌菌株(参见，例如USP5,028,539、USP5,424,202和WO95/13362)。0121在进一步优选的实施方式中，产生乙醇的微生物是真菌微生物，例如酵母和特别是酵母菌(Saccteram^^)，例如酿酒酵母(S.cerev/w'ae)的菌株(USP4，316，956)。各种酿酒酵母是商业上可获得的，而且这些酿酒酵母包括FALI(Fleischmann'sYeast)、SIPERSTART(AUtech)、FERMIOL(DSMSpecialties)、REDSTAR(Lesaffre)和安琪酒精酵母(Angelalcoholyeast)(AngelYeastCompany,中国)。0122在一些实施方式中，除了上面所描述的原材料之外，发酵介质将含有补充物，包括但不限于微生素(例如生物素、叶酸、烟碱酸、核黄素)、辅因子和常量和微量营养物和盐(例如(NH4)2S04;K2HP04;NaCl;MgS04;H3B03;ZnCl2;CaCl2)。工艺0123尽管在本发明的干固体分段发酵工艺与本领域已知方法之间可能存在多种表面相似之处，但是本发明提供了更全面的目标，其体现在许多被认为对于本发明的实施来说是独特的详细特征。在一些实施方式中，这些特征显著地包括直接将固体可发酵基质进料到发酵容器内，以低的初始DS——其低于累积DS，并且甚至可以是0%——开始初始发酵步骤，发酵进行之后继续在装载步骤添加干固体，在装载步骤期间通过进料固体控制发酵，和在发酵生物对数生长阶段通过添加可发酵基质提高发酵效率。0124本文所包括的干固体分段发酵方法的主要工艺歩骤在一个实施方式中可以分成下面的步骤予以描述初始发酵步骤和装载步骤。初始发酵步骤0125在初始发酵步骤的一些实施方式中，可发酵基质在发酵容器中与一种或多种淀粉水解酶和发酵生物相结合，从而开始初始发酵。0126尽管可发酵基质可以是如在原材料描述中所公开的任何基质，但是在一些实施方式中，可发酵基质是固体可发酵基质，并且特别是干的磨碎的谷物，其已经被磨成细颗粒大小(例如，其中至少90%的谷物可通过0.5mm目筛)，而在其它实施方式中，干谷物已经被磨成粗颗粒大小或者根本没有碾磨。0127在一些优选的实施方式中，可发酵基质是己经被湿磨或干磨和任选被分级的谷物。在其它优选的实施方式中，可发酵基质是可发酵糖。0128在一些实施方式中，可发酵基质在干固体分段发酵工艺之前可以被预处理。预处理可以包括下面的任何一种或组合预浸泡、稀酸处理、碱处理和酶处理。在一些实施方式中，预处理可以进行30分钟至24小时，也可以从30分钟至12小时，也可以从30分钟至8小时，也可以从30分钟至4小时，以及优选地从1小时至3小时以下。0129在一些传统的工艺中，当可发酵基质是谷物或其它包括粒状淀粉的基于植物的基质时，该基质被碾磨，与水成液混合，并贮存在浆槽或存贮槽中。包括含有粒状淀粉的基质的浆液被混合或搅拌，以防止由于桨液中固体的粘度而引起的浆槽的沉淀或堵塞。来自槽中的浆液然后被进料到糖化槽内。这些浆槽潜在地提供促进微生物污染的环境。0130在本发明所包括的干固体分段发酵方法的一个实施方式中，固体可发酵基质在浆槽或存贮槽内或类似容器中与水成液的混合被去掉，因为固体可发酵基质被直接进料到糖化/发酵(S/F)容器内。在将基质加入到S/F容器里之前，水或其它水成液可以与固体可发酵基质结合，但是该加入是通过管线内进料方式完成的，例如通过将水成液加到固体可发酵基质转移管道中，如将可发酵基质进料到S/F容器的管，或者通过将固体可发酵基质送至混合基质与水成液的泵，并将浆液进料到S/F容器里。通过管线内进料方式添加水成液可以在固体可发酵基质转移到S/F容器期间任何时刻完成。在一些实施方式中，水成液将是水，而在本工艺的其它实施方式中，水成液将是稀酒糟(图1C)。循环的稀酒糟，可以被加入到发酵工艺中，有时在本领域中被称为逆流(backset)。0131在初始发酵步骤期间，可发酵基质与一种或多种淀粉水解酶和发酵生物的结合可以以本领域技术人员能够容易确定的多种方式进行。在一些实施方式中，所有成分(原材料)加入到发酵容器中基本上是同时的。在其它实施方式中，水成液、一种或多种淀粉水解酶和酵母在发酵容器内被混合，可发酵基质，特别是固体可发酵基质随后被加入。在还有其它实施方式中，可发酵基质首先在发酵容器内与水成液混合，然后淀粉水解酶和酵母被加入到容器内。尽管干固体分段发酵工艺的优选实施方式是同时糖化和发酵工艺，但是在其它实施方式中，干固体分段发酵工艺可以包括分开的糖化容器和发酵容器。0132在优选的实施方式中，在初始发酵步骤期间没有进一步添加所述一种或多种淀粉水解酶或发酵生物。0133在一些实施方式中，初始发酵在至少大约5°C、10°C、15°C、20°C、25°C、30。C、35°C、40°C、45°C、50°C、55。C、60°C、65°C、70。C和75。C的温度下进行，以及也可以在小于7(TC、小于65'C和小于6(TC的温度下进行。在其它实施方式中，该温度将在大约5—65。C、大约10—65。C、大约20—65。C、大约20—6(TC、大约20—55。C、大约25—50。C、大约25—45°C、大约30—45。C、大约30—40'C和大约35—45'C之间。在所有的实施方式中，初始发酵的温度将低于可发酵基质中的粒状淀粉的胶凝温度。0134在一些实施方式中，初始发酵在pH3.0与7.0之间、pH3.0与6.5之间、pH3.0与6.0之间、pH3.0与5.0之间、pH3.5与5.5之间、pH3.5与5.0之间和pH3.5与4.5之间的pH下进行。依照本方法的任何发酵步骤所使用的精确温度和pH取决于具体的可发酵基质，并且进一步可能取决于特定的植物品种、正在使用的酶和发酵生物。0135发酵生物经历不同的生长阶段，包括停滞阶段、对数阶段、稳定阶段和死亡阶段。停滞阶段的长短可取决于营养、生长条件、温度和接种密度而变化。停滞阶段也可以取决于发酵生物如酵母是否适应新环境或者是否是被直接加入发酵罐内的。一般地，停滞阶段是6到9小时。如果发酵生物如酵母可以保持在活性生长状态，最终产物例如酒精，特别是乙醇的产量，可以增加，并且发酵时间可能降低。0136因此，在一些实施方式中，初始发酵进行的时间期间对应于发酵生物的停滞阶段。在其它实施方式中，初始发酵步骤进行2到40小时之间的一段时间，也可以在2到30小时之间，也可以在2到25小时之间，也可以在5到20小时之间以及在2到15小时之间。在一些实施方式中，初始发酵时间大于2、3、4、5、6、7、8、9、IO或15小时但小于36小时。0137在一些实施方式中，在初始发酵步骤中含有可发酵基质的浆液的。/。DS(初始DS)将在0到45%之间、0到40%之间、2到30%之间、5到25%之间以及在一些实施方式中还在5到20%之间。在一些实施方式中，以及特别是，其中可发酵基质是固体可发酵基质，例如干的谷物，初始发酵醪液的干固体(DS)至少是2%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、12%、15%、20%、22%和25%。在一些实施方式中，该醪液的DS为40%以下、30%以下、28%以下、26%以下、25%以下和24%以下。在其它实施方式中，DS在P/。和25。/。之间。0138尽管如在原材料部分所描述的任何数量的淀粉水解酶可以被用在干固体分段发酵工艺中，在优选的实施方式中，淀粉水解酶是葡糖淀粉酶、a-淀粉酶、粒状淀粉水解酶或其组合。特别优选的酶组合物包括葡糖淀粉酶和具有粒状淀粉水解活性的酶的组合。举例来说，黑曲霉葡糖淀粉酶和河内曲稀a-淀粉酶可以被使用。装载步骤0139在干固体分段发酵方法的优选实施方式中，进一步添加的可发酵基质在装载步骤被加入到与初始发酵步骤相同的发酵容器中。在一些实施方式中，该可发酵基质与在初始发酵步骤中加入的可发酵基质相同，而在其它实施方式中，可发酵基质是不同的可发酵基质。0140与初始发酵步骤相似，在一些实施方式中，固体可发酵基质可以是谷物，其已经被碾磨成细颗粒大小(例如，其中至少90%的谷物通过0.5mm网筛)，而在其它实施方式中，干谷物已经被磨成粗颗粒大小或者根本没研磨。0141在一些实施方式中，初始发酵步骤的可发酵基质是可溶性糖，例如糖蜜或葡萄糖糖浆，而装载步骤的可发酵基质是固体可发酵基质，例如磨碎或未碾磨的谷物或其己分级的部分。当初始发酵歩骤的可发酵基质是可溶性糖并且装载步骤的可发酵基质是固体可发酵基质，例如干谷物时，具有粒状淀粉水解活性的酶将与该固体可发酵基质一起被包括在发酵槽内。在一些实施方式中，不同的可发酵基质可以在装载步骤期间被加入到发酵容器内。0142固体可发酵基质可以与初始发酵步骤所描述的相同的方式，在装载步骤期间被直接进料到S/F容器内。在一些实施方式中，直接进料将通过管线内加料方式完成。0143在装载阶步骤期间，可发酵基质的进料可以是连续进料、间歇进料或一次性大量进料，这基本上是在装载歩骤开始的时候。间隔可以包括几分钟或几小时。在一些实施方式中，进料间隔可以是每5、10、15、20或30分钟。进料也可以以每小时的间隔进行，例如每l、2、3、4、5或10小时。在一些实施方式中，在装载步骤期间的进料将持续在大约5到35小时之间的一段时间，也可以是大约5到25小时和5到20小时。在一些实施方式中，在装载步骤期间的进料可以持续l、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或30小时或更多。进料可以持续不同的时间期间，而且这可能取决于包括可发酵基质在内的许多因素。在一些实施方式中，可发酵基质的进料将以与可发酵基质转化成最终产物的速度相等或不同的速度进行。0144在一些实施方式中，初始发酵将进行5到36小时以及装载步骤的进料将进行10到20小时。第二可发酵基质的添加可以在发酵生物的对数阶段(活性生长阶段)进行。0145发酵液的干固体百分比(％DS)将随时间增加，使得在一些实施方式中累积DS将在大约10到55%之间。在其它实施方式中，累积DS将在大约IO到50%、大约15到45%、大约20到40%、大约25到40%和大约10到20%之间。0146在一些实施方式中，尽管添加到发酵液中的累积DS将在大约10到55%之间，但是初始发酵介质的DS将比发酵液累积DS的干固体少至少5y。、至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%和至少90%。本领域普通技术人员将能够容易地计算在干固体分段发酵工艺中加入的可发酵基质的数量，从而得到特定百分比的DS。0147在其它实施方式中，当接近50%、60%、70%、80%、90%的DS被转化成可溶固体时，在装载步骤中将会进行可发酵基质的另一批进料。0148尽管期望在一些实施方式中装载步骤将不需要发酵生物的附加接种物或另外的淀粉水解酶，但是某些实施方式将包括接种物如酵母和/或淀粉水解酶的添加。另外，在一些实施方式中，附加的酵母接种物可以在装载步骤开始之后，例如，在5到40小时之间、在10到40小时之间、在12到30小时之间或在15到24小时之间加入。0149装载步骤可以在如上所述的初始发酵步骤的温度和pH下进行。在一些实施方式中，该温度和pH将基本上与初始发酵步骤的温度和pH相同，而在其它实施方式中，该温度和pH可以不同于初始发酵步骤。例如，在一些实施方式中，初始发酵步骤的温度可以在25'C到40'C之间或在30'C到5(TC之间，而装载步骤的温度可以以1°C、2'C、3t:、4°C、5'C、6'C、7'C、8'C、9'C或l(TC的增量降低。在一些实施方式中，初始发酵步骤的温度将在35'C到4(TC之间，而装载歩骤的温度将在25'C到35'C之间。0150对于依照干固体分段发酵方法可以使用的可发酵基质中的许多淀粉来说，通常的淀粉胶凝温度范围包括大麦(52到59°C)、小麦(58到64°C)、黑麦(57到7(TC)、玉米(62到72°C)、高直链淀粉玉米(67到8CTC)、水稻(68到77°C)、高粱(68到77°C)、马铃薯(58到68°C)、木薯淀粉(59到69°C)和甘薯(58至l」72'C)(J丄M.Swinkelspg32-38,在STARCHCONVERSIONTECHNOLOGY,EdsVanBeynum等，(1985)MarcelDekkerLie.NewYork禾口TheAlcoholTextbook3rdED。关于饮料、燃料和工业酒精业的参考，EdsJacques等,(1999)NottinghamUniversityPress,UK)。根据此处的本发明，发酵将在低于包含在可发酵基质内的淀粉的淀粉胶凝温度的温度下进行。0151在一些实施方式中，干固体分段方法的总发酵时间将是大约24到168小时、24到144小时、24到108小时、24至lj96小时、36至lj96小时、36到72小时和48至lj72小时。0152在干固体分段方法中来自可发酵基质的葡萄糖的收率(总的溶解的干固体的百分比)可以是至少大约60%、65%、70%、75%、80%、85%、卯％、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%和98%。然而，在优选的实施方式中，葡萄糖是连续生产的，而且在本方法中，基本上所有的葡萄糖被用来生产最终产物，例如乙醇。在进一步的实施方式中，来自干固体分段发酵工艺的最终醪液将包括1.0%以下、0.8%以下、0.5%以下、0.2%以下、0.15%以下、0.1%以下和0.05%以下的DP-1(w/v)。0153尽管优选的最终产物是酒精和特别是乙醇，其它的最终产物也可以得到，而且这些最终产物包括但不限于甘油、ASA中间体、1,3-丙二醇、酶、抗菌剂、有机酸、氨基酸和抗生素。0154在一些实施方式中，乙醇的收率按体积计将大于8%、10%、12%、14%、16%、18%和20%。在其它实施方式中，最终乙醇收率的至少50%、60%、70%、80%在前20、22、24、26、28或30小时内产生。在某些实施方式中，乙醇的收率将大于16%，并且最终乙醇的至少50%将在前20小时内产生。根据千固体分段发酵方法得到的乙醇可以被用作燃料乙醇、饮料乙醇或工业乙醇。0155在干固体分段发酵结束时的醪液可以包括0到30%的残余淀粉。在一些实施方式中，醪液可以包括至少1%、2%、4%、6%、8%、10%、12%但30%以下、20%以下和15%以下的残余淀粉。0156在一些实施方式中，在基本上相同的发酵条件下，例如发酵基质、pH、温度、发酵时间及类似条件，当与其它无蒸煮或低温发酵方法相比时，干固体分段发酵方法将具有更高的碳转化效率。碳转化效率可以被定义为可发酵基质中的碳直接转化成最终产物如酒精、而没有将碳作为副产物释放的转化率增加。在一些实施方式中，与在基本相同的条件下、使用同样原材料的无蒸煮发酵方法相比，当使用干固体分段发酵方法时，碳转化效率的增加将至少是2%、至少5%、至少7%、至少10%、至少15%和至少20%。在一些实施方式中，增加的碳转化效率体现在发酵结束时更高的残余淀粉水平，其产生与被比较的方法大体相同数量的乙醇。在一些优选的实施方式中，可发酵基质将是谷物，例如玉米、小麦、大麦或黑麦。0157在进一步的实施方式中，根据本方法所产生的最终产物将从发酵介质中被分离和/或纯化。分离和纯化的方法是已知的，例如，通过使介质经历萃取、蒸馏和柱层析。在一些实施方式中，最终产物直接通过使该介质经过高压液相色谱(HPLC)分析而被鉴定。0158在进一步的实施方式中，醪液例如可以通过离心成为液相和固相而被分离，并回收最终产物如酒精和固体。酒精可以通过诸如蒸馏和分子筛脱水或超滤的方法回收。0159发酵剩余的残余物，被称为酒糟也可以回收，并且再循环用于装载步骤中的酒糟的成分或所述酒糟可以被分成可溶馏分或不溶馏分。0160当酒糟通过例如离心或筛分成可溶馏分和不可溶馏分而被分离时，这些馏分可被用来制造可溶酒糟(distillers'solubles)或可溶干酒糟(distillers'driedsolubles)或者混合在一起制造含可溶物的谷物干酒糟(distillers'driedgrainplussolubles，DDGS)。本领域技术人员通常熟悉形成DDGS和谷物酒糟的工艺。然后，DDGS例如可以被用于动物词料配方中。0161在一些实施方式中，干固体分段发酵方法将产生含有30%以下、20%以下、15%以下、10%以下、9%以下、8%以下、7%以下、6%以下、5%以下、4%以下、2%以下和r/。以下残余淀粉的DDGS。在一些实施方式中，从根据本发明的本方法中得到的DDGS将具有更高的残余淀粉含量，和在其它实施方式中，与现有技术方法制备的DDGS相比，将含有更低的残余淀粉含量。从干固体分段方法中得到的DDGS可用在动物饲料中。此外，从发酵回收的残余淀粉可以被用作可发酵基质。0162对于本领域技术人员而言，在阅读了本公开内容之后，本说明书和实施例的各种其它实施例和改进将是显而易见的，而不背离本发明的精神和范围，这意味着所有的这些实施例或改进将被包括在所附的权利要求书的范围之内。实验0163提供下面的实施例，以便说明和进一步阐明本发明的某些优选实施方式和方面，而且不应被解释为对其范围的限制。确实，期望这些教导将在进一步优化本文所描述的工艺系统中起作用。0164在本公开内容和接下来的实验部分，用到了下面的縮写GA(葡糖淀粉酶)；AkAA(具有GSH活性的河内曲霉a-淀粉酶；SEQIDNO:3);AnGA/AkAA(具有GSH活性的酶掺合物，其包括黑曲霉葡糖淀粉酶和河内曲霉a-淀粉酶)；Wt%(重量百分比)；°C(摄氏度)；rpm(每分钟的转数)；H20(水)；dH20(去离子水)；dlH20(去离子水，Milli-Q过滤)；aa(氨基酸)；bp(碱基对)；kb(—千个碱基对)；kD(千道尔顿)；g或者gm(克)；吗(微克)；mg(毫克)；pi(微升)；ml和mL(毫升)；mm(毫米)；(微米)；M(摩尔)；mM(毫摩尔)；(微摩尔)；U(单位)；V(伏特)；MW(分子量)；sec(秒)；min(s)(分钟(minute/minutes));hr(s)(小时(hour/hours));DO(溶解的氧);邻苯二甲酸盐缓冲液(邻苯二甲酸钠水溶液，20mM,pH5.0);w/v(重量与体积之比)；w/w(重量与重量之比)；v/v(体积与体积之比)；Genencor(GenencorInternational,Inc.,PaloAlto,CA);DDGS(含可溶物的干谷物酒糟，DistilleriesDryGrainplusSolids);MT(公吨);和EtOH(乙醇)。0165以下实验和方法在下面提供的实施例中被使用0166葡糖淀粉酶的活性采用公知的试验测定，其基于葡糖淀粉酶可催化对硝基苯-a-D-批喃葡糖苷(p-nitrophenyl-alpha-D-glucopyranoside，PNPG)生成葡糖淀粉酶和对硝基苯酚的能力。在碱性pH下，该硝基苯酚形成黄色物质，其与葡糖淀粉酶的活性成比例，在400nm处测定，并且与经测定作为GAU的酶标准比较。0167一个"葡糖淀粉酶活性单位(GlucoamyaseActivityUnit)"(GAU)被定义为在pH4.2和60'C下产生1gm还原糖的酶的量，计算为每小时来自可溶淀粉基质(4%DS)的葡萄糖。0168a-淀粉酶活性的测定是基于在pH4.5和50'C下，可溶性马铃薯淀粉基质(4%DS)被一等分酶样品水解的程度。还原糖的含量是采用在Miller,G.L.(1959)Anal.Chem.31:426-428中所述的DNS方法测定的。一个酶活性单位(SSU，可溶淀粉单位(solublestarchunit))相当于在特定温育条件下每分钟所释放lmg葡萄糖的还原能力。0169总淀粉含量的测定用酶-酶淀粉液化和糖化方法测定总淀粉含量。在典型的分析中，在100ml的Kohlraucsh烧瓶内放入2g干样品，并且加入45ml的pH为7.0的MOPS缓冲液。将该浆液充分搅拌30min。1.0ml的SPEZYMEFRED(以l:50稀释在水中)被加入并且加热，煮沸3-5min。将该烧瓶放在高压灭菌器内，在12rC下保持15min。高压灭菌处理之后，将该烧瓶放置在95'C的水浴中，加入1ml的以1:50稀释的SPEZYMEFRED并且温育45min。pH调整到pH4.2，温度降到6(TC。接着加入20mlpH为4.2的乙酸盐缓冲液。通过加入1.0ml的以1:100稀释的OPTIDEXL-400(来自GenencorInternationalInc.的葡糖淀粉酶)进行糖化，且在60'C下继续温育18小时。通过在95'C下加热10min终止此酶反应。总的糖成分利用葡萄糖作为标准通过HPLC分析进行测定。在室温下不经过酶处理的、来自样品的水萃取液的可溶淀粉水解产物被从总糖中扣除。0170残余淀粉碘测试啤酒(发酵液)样品在2ml的塑料离心管中离心。将上清夜轻轻倒出，并将含有颗粒状物的离心管放在冰浴里。向颗粒状物加入几滴0.025N碘溶液(来自VWRCat.No.VW3207-1的0.1N的碘稀释4倍)并将其混合。阳性(+)的淀粉显示出从蓝色到紫色的颜色范围，而且颜色强度与淀粉的浓度成正比。阴性结果(-)保持淡黄色。0171蛋白质总量分析样品制剂中的总氮(N)是采用Kjddhal方法(AmericanAssoc.CerealChemists(AACC),(1983),Methods22B608thEd.StPaul,MN)测定的。蛋白质的含量是以总氮的6.25倍计算的。乙醇和碳水化合物的测定0172样品中的甲醇和碳水化合物成分是采用此处描述的HPLC方法测定的a)将1.5ml的Eppendorf离心管装满发酵啤酒并在冰上冷却10min;b)该样品管在Eppendorf台式离心机中离心1min;c)0.5ml上清液样品被转移到含有0.05mlKill溶液(1.1NH2S04)的测试管中，并使其静置5min;d)向测试管中加入5.0ml水，然后通过0.45尼龙针头滤器(NylonSyringeFilter)将其过滤到HPLC小瓶内；禾口e)运行HPLC。HPLC条件a)乙醇体系柱PhenomenexRezex有机酸柱(RHM-单糖)#00H0132-KO(相当于Bio-Rad87H);柱温60'C;流动相0.01NH2SO4;流速0.6mL/min;检测器RI;和注射体积20^L。b)碳水化合物体系柱PhenomenexRezex碳水化合物(RCM-单糖)#00H-0130-KO(相当于Bio-Rad87H);柱温70°C;流动相NanopureDIH20;流速0.8mL/min;检测器RI;注射体积10pL(3。/。DS材料)。0173柱基于糖的分子量进行柱分离，糖被命名为DP1(单糖)；DP2(二糖)；DP3(三糖)；以及大于3的DP(聚合度大于3的低聚糖)。实施例l一分批发酵0174五百克(500g)细磨的玉米(湿度为14%,100%通过40网筛的颗粒大小，其相当于0.420mm(ASTM)，含有40%淀粉含量的30%的脱脂胚芽，总淀粉含量为67%,中国黑龙江肇东CREthanol)被加入到2升的生物反应器内，该生物反应器含有1.0升蒸馏水并且备有温度和pH控制程序化系统。干尿素以1000ppm被加入。将pH用稀硫酸调整到pH4.5。混合均匀且温度稳定(30°C)之后，AnGA/AkAA以0.75GAU/gDS被加入，接着加入干酵母(0.8%Fali酵母，中国黑龙江阿城)和尿素(0.1%，中国无锡的无锡民丰)。发酵介质被连续搅拌以避免磨碎玉米沉淀。在不同时间间隔对发酵液取样，并离心。反应产物的成分通过HPLC分析进行测定。为了测定发酵效率，在72小时分析发酵液的残余淀粉。0175表1<table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>0176发酵液中乙醇的浓度随着发酵时间增加，在72小时达到16.34%V/v。在72小时发酵液中残余淀粉含量是10.71%。实施例2—装载有干的磨碎玉米的干固体分段方法0177如上所述，进行发酵，具有下列不同之处。基于最终的30。/。DS，生物反应器内初始被装填15%DS的磨碎的玉米(发酵累积DS的一半)，0.75GAU/g的AnGA/AkAA。发酵在3(TC下进行。在开始初始发酵之后大约22小时的时候开始，每隔一小时加入干的磨碎的玉米(15.4g)，持续16小时(总发酵时间=38小时)。继续发酵直到72小时。上清液中反应产物的成分采用HPLC分析，而残余淀粉在72小时被测定。0178表2<table>tableseeoriginaldocumentpage31</column></row><table>0179与实施例l类似，乙醇含量随着发酵时间的增加而增加。到72小时，乙醇含量为17.15%(v/v)，其高于实施例l。在72小时时，发酵液中残余淀粉含量为11.1%。0180表1禾n2结果比较说明，采用实施例2的干玉米进料的碳转化效率得到提高。该结论得到在72小时时从干的磨碎玉米进料中得到的更高乙醇百分比(17.16%对16.34%)支持，尽管残余淀粉较高(11.1%对10.17%)。实施例3—装载步骤中干的磨碎谷物的进料以及初始DS的影响0181如上面实施例1中所述，进行发酵，但是具有不同的初始DS。使用来自中国黑龙江肇东CREthanol的除胚芽的磨碎玉米，其100%通过40目筛。在2升的生物反应器内，基于含湿量816到830克磨碎的玉米(用SartoriusAGGottingenMA30-000V3测量)，与1400或1500克自来水混合，并加入基于该DS的0.1%的尿素。用26%的硫酸将浆液的pH调整到pH4.7。基于30%的最终DS，AnGA/AkAA以1.0GAU/gDS被加入。用0.8%DS的干安琪酵母(Angelyeast)(中国湖北安琪酵母股份有限公司)接种生物反应器。在30°C，慢速搅拌下混合发酵介质。初始DS被调整到7%、10%和15%。基于最终的30%DS，加入AnGA/AkAA。在15小时时开始，干固体磨碎的玉米每隔一小时被等量地直接加入到发酵罐内，持续10小时。调整干固体玉米的加入重量，以达到30%的最终DS。发酵pH维持在pH4.7。在15、24、48和72小时取样并用HPLC分析。在72小时测定来自发酵液样品的残余淀粉含量。0182表3A乙醇产量在0小时，总计30。/。DS干玉米基质添加量<table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table>0183表3B乙醇产量初始7%DS，累积30%DS，干玉米基质在15到25小时进料时间进料<table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table>0184表3C乙醇产量初始10%DS，累积30%DS，干玉米基质在15到25小时进料时间进料<table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage33</column></row><table>0185表3D乙醇产量初始15。/。DS，累积30。/。DS，干玉米基质在15到25小时进料<table>tableseeoriginaldocumentpage33</column></row><table>0186正如从表3A—3D所示，与30。/。DS对照相比，在干玉米基质重复进料的情况下，最终乙醇收率的稳定增加是由于更高的初始DS。在72小时，对于30。/oDS，乙醇的。/ov/v为17.06(表3A);对于7。/oDS，为17.75(表3B);对于10。/。DS,为8.11(表3C);以及对于15。/。DS，为18.50(表3D)。也可参考图2。实施例4一干固体的装载和开始时间的影响0187如上面实施例1中所述，进行发酵，其在初始发酵时间10和15小时之后的装载步骤中采用不同的干谷物进料开始时间。初始DS为10%。每隔一小时等量地加入干的磨碎玉米，在初始发酵为10小时的情况下持续15小时，或者在初始发酵为15小时的情况下持续10小时。发酵的最终累积DS为30%DS。在每种情况下，用26。/。的硫酸将发酵的pH调整到pH4.7。在总发酵时间的15、24、48和72小时的时候，对发酵液取样并通过HPLC分析，并使用在72小时取样的发酵液，测定残余淀粉含量。0188表4A初始发酵时间为10小时且在装载步骤中的进料持续15小时<table>tableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table>表4B初始发酵时间为15小时且在装载步骤中的进料持续10小时<table>tableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table>Ol卯如在表4A和4B中所显示的结果说明了开始时间对酒精收率的影响。实施例5—干固体分段-不同谷物的干的磨碎进料0191如上面实施例1所述，进行发酵，使用不同谷物基质。玉米、买罗高粱(milo)和小麦被使用1.5mm筛的实验室锤磨机3100(瑞典)加工。95%以上的磨碎材料通过30目筛。黑麦和大麦购买于AzureStandard(Dufer，OR)。谷物的含湿量用OHAUS，MB35Haolgen湿度平衡仪(NJ)测定。在发酵罐内，180—183g(基于含湿量)磨碎谷物和950g水连同600mg尿素被混合在一起。该浆液的pH用6N硫酸调整到pH4.0。对于每种发酵，加入基于32%最终DS为1.0GAU/gDS的AnGA/AkAA以及0.5Kgs/MT的GC106(GenencorlnternationalInc.)。如下加入其它次级酶对于小麦，0.1Kgs/MT的CELLEULASE2000L(GenencorInternationalInc.);对于大麦，0.5Kgs/MT的CELLEULASE2000L(GenencorInternationalInc.);以及对于黑麦，0.5Kgs/MT的OTIMASHBG(GenencorInternationalInc.)。用1.5克的干REDSTARETHANOLRED酵母(LesafireYeastCorp.,WI)接种发酵罐。在3(TC，慢速搅拌下不断混合发酵介质。在初始发酵开始14小时、20小时和24小时之后，以逐歩的方式加入干的磨碎谷物(每次122克)。在每种情况下，发酵的pH用6NH2S04或2NKOH调整到pH4.0。另一剂量的干酵母(1.5克)在24小时时加入到每个发酵中。在14、24、48和72小吋取样并通过HPLC分析。如表5中所观察到的，测试谷物所生产的乙醇百分比是变化的，而且该变化是每种谷物类型的淀粉含量的函数。例如，期望的是，72小时时来自小麦的％乙醇收率将小于72小时时来自玉米的乙醇收率。用72小时的发酵液样品来测定残余淀粉含量。0192表5—不同谷物基质情况下，干固体分段发酵对乙醇产量的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage35</column></row><table>实施例6—使用分级的玉米胚乳进行的千固体分段发酵与分批发酵的比较0193从美国伊利诺伊大学(theUniversityofIllinois),采用己知方法，将#2YellowDent玉米分级，得到胚乳部分。胚乳/麸质级部分被磨碎，并且得到一样品，其中至少95%的样品通过1.5mm的筛子(PertenLaboratoryMill3100，瑞典)。谷物的含湿量用OHAUS,MB35Halogen湿度平衡仪(NJ)测量。0194对于分批工艺，使用483克胚乳和1017克去离子水。对于干固体分段(Dss)工艺，使用161克胚乳和1017克去离子水。在进入发酵14、20和24小时的时候，每个时间段向干固体分段样品中加入107克胚乳，以得到30%的累积DS。pH用6NH2S04调整到4.0。样品被放到30'C水浴中且使其平衡。向每个样品中加入1.0GAU/gDS的AnGA/AkAA、0.5Kgs/MT的GC106(Genencor)和1.5gREDSTARRED酵母(LesaffreYeastCorp.WI)。监测pH，需要时用4NKOH将pH调整到pH4.0。在14、24、38、46和70小时取样并通过HPLC(PhenomenexRezex8u)分析。用72小时之后的发酵液来测定残余淀粉含量。0195表6<table>tableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table>0196如表6所示，在初始发酵期间，由于DS水平较高，分批方法的乙醇生产的速度较快，但是在发酵的后面阶段，干固体分段发酵方法中乙醇生产的总体速度增加。此外，尽管干固体分段发酵方法中的％残余淀粉比分批方法高(分别为6.9%相比于4.0%)，然而，干固体分段发酵方法中产生的乙醇百分比是18.78，相比而言，分批方法是19.38。这些值表明千固体分段发酵方法具有更高的碳转化效率。实施例7—使用湿加工的谷物的干固体分段发酵0197碾磨#2YellowDent玉米样品，使得至少95%的样品通过1.5mm筛(PertenLaboratoryMill3100，瑞典)。谷物的含湿量用OHAUS，MB35Halogen湿度平衡仪(NJ)测量。初始发酵用750glO。/。DS的磨碎玉米引发。尿素(4000ppm)和5.0g干玉米浸渍液被加入到烧瓶内，并且pH用6NH2S04调整到4.9。样品被放到3(TC水浴中且使其平衡。为了开始发酵，向每个烧瓶中加入1.5gREDSTARRED酵母(LesaflieYeastCorp.WI)和1.0GAU/gDS的AnGA/AkAA(Genencor)。初始发酵步骤8小时之后，来自湿加工系统的另外的750g淀粉浆(34.7%DS)以0.05mls/min的速度被连续地从蠕动泵(Gilson，Minipuls3，ModelM312,法国)加入，直到样品达到1500g的总量。整个实验中监控pH，如果需要，用4NKOH将其调整到4.0。在24、32、48、56和70小时取样并通过HPLC(PlienomenexRezex8u)分析。用72小时之后的发酵液样品来测定残余淀粉含量。结果显示在表7。0198表7<table>tableseeoriginaldocumentpage37</column></row><table>'实施例8—在干固体分段发酵和补料-分批发酵中应用液化0199从生产的乙醇中得到液体，且用去离子水稀释至28n/。DS，以得到一升的样品。该样品的pH用6NH2S04调整到pH4.5。该样品被放到3(TC水浴中且使其平衡。向该样品中加入3.0gREDSTARRED酵母(LesaffreYeastCorp.WI)和0.4GAU/gDS的DISTILLASEL-400(Genencor)以及7个分光光度法酸性蛋白酶单位(spectrophotometricacidproteaseunit,SAPU)的GC106/gDS(Genencor)。一个SAPU是在试验条件下每分钟从酪蛋白底物中释放一毫摩尔的酪氨酸的酶活性的量值。15小时后将该醪液分为4个重复处理，每个含有100g样品。0200处理A在整个发酵中持续进行而没有另外的装载步骤或另外加入酶或酵母。对于处理B，基于36。/。的累积DS，加入l.OGAU/gDS的AnGA/AkAA和0.3g酵母，但是不加入另外的可发酵基质。对于处理C，除了1.0GAU/gDS的AnGA/AkAA和0.3g酵母之外，在15小时时间段时一次性加入15.4g磨碎玉米。对于处理D，在15、20和25小时，以5.1g的相等增量加入磨碎玉米，其总量为15.4g。磨碎玉米是用1.5mm筛和实验室锤磨机3100(瑞典)生产的。95%以上的磨碎玉米通过30目筛。谷物的含湿量用OHAUS，MB35Halogen湿度平衡仪(NJ)测量。对于处理C和D，累积DS为36%。0201在24、36、48和72小时对醪液样品取样，并通过HPLC(PhenomenexRezex8u)分析。用72小吋之后的醪液样品来测定残余淀粉含量。结果显示在表8中。0202表8<table>tableseeoriginaldocumentpage38</column></row><table>0203在表8中报告的结果表明，干固体分段发酵方法具有更高的碳转化效率。与处理A和B的13.29%和13.33%的乙醇产率相比，对于代表干固体分段方法的处理C和D而言，在72小时时的％乙醇分别为16.39%和16.34%。处理C和D的％残余淀粉分别为12.33%和14.40%,而处理A和B的％残余淀粉仅为1.86%和1.24%。权利要求1.一种用于生产酒精的干固体分段发酵方法，包括a)初始发酵步骤，其包括在3.0到6.0的pH、5℃到65℃的温度下，将可发酵基质、一种或多种淀粉水解酶和发酵生物在发酵容器内结合2到40小时，并得到发酵液，和b)装载步骤，其包括向所述容器内加入固体可发酵基质，并使其在3.0到6.0的pH、20℃到55℃的温度下继续发酵足够的时间期间，以生产酒精，其中所述发酵液的干固体百分比(％DS)随时间增加。2.根据权利要求1所述的干固体分段发酵方法，其中所述可发酵基质为固体可发酵基质。3.根据权利要求2所述的干固体分段发酵方法，进一步包括将所述固体可发酵基质直接加入所述发酵容器中。4.根据权利要求1所述的干固体分段发酵方法，其中所述可发酵基质为可发酵糖。5.根据权利要求1所述的干固体分段发酵方法，其中所述固体可发酵基质是选自玉米、黑麦、小麦、大麦、高粱或其组合的谷物。6.根据权利要求5所述的干固体分段发酵方法，其中所述谷物已经被分级。7.根据权利要求1所述的干固体分段发酵方法，其中累积。/。DS在IO与55%之间。8.根据权利要求7所述的干固体分段发酵方法，其中所述累积c/。DS在25与40W之间。9.根据权利要求1所述的干固体分段发酵方法，其中所述初始发酵步骤的所述发酵液的。/。DS为0到45%。10.根据权利要求1所述的干固体分段发酵方法，其中所述装载步骤期间所加入的%DS在5到20小时的期间内介于1与25%之间。11.根据权利要求1所述的干固体分段发酵方法，其中在所述装载步骤之前，所述初始发酵步骤持续至少5小时。12.根据权利要求1所述的干固体分段发酵方法，其中所述最终产物是乙醇。13.根据权利要求1所述的干固体分段发酵方法，进一步包括回收所述酒精。14.根据权利要求12所述的干固体分段发酵方法，其中乙醇的收率为至少10%。15.根据权利要求1所述的干固体分段发酵方法，其中所述一种或多种淀粉水解酶选自葡糖淀粉酶、a-淀粉酶、具有粒状淀粉水解活性的酶和它们的组合。16.根据权利要求1所述的干固体分段发酵方法，其中所述一种或多种淀粉水解酶是葡糖淀粉酶。17.根据权利要求1所述的干固体分段发酵方法，其中所述一种或多种淀粉水解酶是具有粒状淀粉水解活性的酶。18.根据权利要求1所述的干固体分段发酵方法，其中所述一种或多种淀粉水解酶包括葡糖淀粉酶和粒状淀粉水解酶的组合。19.根据权利要求18所述的干固体分段发酵方法，其中所述一种或多种淀粉水解酶包括黑曲霉葡糖淀粉酶和具有粒状淀粉水解活性的真菌a-淀粉酶的组合。20.根据权利要求1所述的干固体分段发酵方法，进一步包括将次级酶加入所述初始发酵步骤或装载步骤。21.根据权利要求20所述的干固体分段发酵方法，其中所述次级酶包括蛋白酶、淀粉酶、支链淀粉酶、纤维素酶或其组合。22.根据权利要求1所述的干固体分段发酵方法，进一步包括从所述发酵液中回收联产物。23.根据权利要求22所述的干固体分段发酵方法，其中所述联产物是干谷物酒糟或含可溶物的干谷物酒糟。24.根据权利要求23所述的干固体分段发酵方法，其中所述含可溶物的干谷物酒糟具有20%以下的残余淀粉含量。25.根据权利要求1所述的干固体分段发酵方法，其中所述方法共计进行30到92小时。26.根据权利要求l所述的干固体分段发酵方法，其中所述初始发酵步骤在3.5到5.5的pH、25'C到45'C的温度下进行2到IO小时，并且所述可发酵基质是干的磨碎谷物，其在所述发酵容器内与至少一种粒状淀粉水解酶和酵母结合。27.根据权利要求26所述的干固体分段发酵方法，其中初始发酵液的所述°/。DS在5%和20%之间，累积DS在25%和45%之间。28.根据权利要求26所述的干固体分段发酵方法，进一步包括将所述干的磨碎谷物直接加入所述发酵容器内。29.根据权利要求28所述的干固体分段发酵方法，其中所述干的磨碎谷物是玉米、黑麦、小麦、大麦、高粱或其组合。30.—种用于生产最终产物的干固体分段发酵方法，包括a)初始发酵步骤，其包括在3.0到7.0的pH、5"C到65'C的温度下，将第一可发酵基质与一种或多种淀粉水解酶和发酵生物在发酵容器内结合2到40小时，并得到发酵液，和b)装载步骤，其包括向含有所述发酵液的所述容器中加入第二固体可发酵基质，并使其在3.0到7.0的pH、2(TC到65'C的温度下继续发酵足够的时间期间，以生产最终产物，其中所述发酵液的干固体百分比(％DS)随时间增加。31.根据权利要求30所述的干固体分段发酵方法，进一步包括回收所述最终产物。全文摘要公开了干固体分段发酵方法，其用于生产最终产物，例如乙醇，所述方法包括初始发酵步骤，其包括将第一可发酵基质与一种或多种淀粉水解酶和发酵生物在发酵容器中结合，和装载步骤，其包括向发酵容器中添加第二可发酵基质，其中发酵液的干固体百分比(％DS)随时间增加。文档编号C12P7/14GK101155926SQ200680011530公开日2008年4月2日申请日期2006年6月5日优先权日2005年6月14日发明者C·E·皮尔格林,G·段,G·肖塔尼,J·K·谢蒂申请人:金克克国际有限公司