CAA-3' (Ncol)。引 物末端分别添加化ndin和化0I的酶切位点。
[0036] 采用CTAB法提取大麦品种GoldenPromise的叶片基因组DNA。取提取的基因 组DNA500ng为模板，W1310F1和1310R为引物，进行PCR反应，PCR程序为；98°C预变性 5min;然后94°C变性30s，55°C退火30s，72°C延伸90s，35个循环；最后72°C延伸lOmin。
[0037]PCR产物经1%的琼脂糖凝胶电泳后，结果表明PCR获得约1258bp的条带，将其回 收纯化，连接到PMD19-T克隆载体，并转化大肠杆菌菌株畑5a，提取重组质粒进行测序验 证，结果表明上述PCR获得的片段具有序列1的核巧酸序列，将具有序列1的核巧酸序列的 启动子命名为Hvl310p。
[003引利用PLACE和PLANTCARE在线启动子分析工具对HvmOpl的顺式作用元件进行 预测分析，发现该序列除了含有TATA框和CAAT框等基础启动子元件，还具有1个根毛特 异性元件RHERPATEXPA7,4个根特异表达元件R00TM0TIFTAP0X1，1个环境胁迫响应的DRE/ CRT(转录因子）顺式作用元件DRECRTC0REAT，2个MYC和肌B识别位点，二者均受ABA和干 旱的诱导。
[0039] 2、HvTIP2 ;1启动子5'端缺失突变序列的获得
[0040] 为了对Hvl310pl进行功能分析，利用大麦品种GoldenPromise的叶片基因组DNA 为模板，在HvTIP2 ;1基因上游514bp处设计正向引物131(F2:5'-AAGCTTCTGCATTATCAGAC AGAACT-3'(加化ndlll位点），利用1310R为反向引物进行PCR扩增，结果表明1310巧与 1310R扩增得到约514bp的片段。将上述PCR获得的片段，连接到PMD19-T克隆载体，转化 大肠杆菌菌株D册a，获得重组质粒并进行测序验证，结果表明，上述PCR获得的片段具有 序列2的核巧酸序列，将具有序列2的核巧酸序列的启动子命名为Hvl310p2。
[0041] 3、Hvl310Pl启动子及其5'缺失突变体驱动GUS基因表达的植物表达载体的构建
[0042] 利用hyg潮霉素抗性基因作为表达载体的选择标记基因，采用化ndlll/化〇1双酶 切PCAMBIA1301基础表达载体与含启动子片段的PMD19-T克隆载体，分别回收PCAMBIA1301 质粒酶切的大片段与克隆载体酶切的启动子片段，然后用T4DNA连接酶连接相应的酶切片 段，构建融合GUS基因的植物表达载体，并转化大肠杆菌。将利用1258bp和514bp长度片 段启动子构建的植物表达载体分别命名为pCAM-Hvl310pl和pCAM-Hvl310p2。阳性克隆载 体进一步经酶切和测序验证后，导入农杆菌菌株EHA105。
[0043] 4、烟草的转化及转基因阳性植株的获得
[0044] 采用农杆菌介导的叶盘转化法将新构建的表达载体转入普通烟草，通过对hyg选 择标记基因的PCR分子检测，将鉴定结果为阳性的TO代转基因植株移植到营养±鉢中继续 生长。
[004引 5、转基因烟草GUS活性的定性和定量检测
[0046]W未转化的烟草为对照，在成株期阶段对2种不同片段长度启动子驱动的GUS转 基因植株进行组织化学染色比较分析。取转基因烟草的根、茎、叶、花器官，于37°CGUS染 液中温浴过夜，经70%己醇稱色5min，再转到100%己醇中直至背景无色。GUS染液配方 为lOOmMNaH2P04，10mMNa2EDTA，0. 5mMK4 田e(CN)6] .3肥0,0. 5mMK3[Fe(CN)6]，0. 1% Triton?X-100。
[0047] 进一步采用考马斯亮兰法作GUS蛋白定量检测。取转基因烟草的根、茎、叶、花 各lOOmg，液氮研磨后加入1血GUS蛋白提取液，4°C、12000巧111离屯、5min，取500yL上清 液于新EP管中，置于冰上备用。取100uL上清液于新EP管中，加入预热的GUS酶提取液 400liL和 500liLMUG(4-methylumbellife巧l|3-D-glucu;ronide)反应底物（浓度2mmol/ L)，37°C水浴并分别于0、15、30、45、60min时取200yL反应液于新EP管中并加入800yL 化2C03(浓度0. 2mol/L)终止液于冰上避光保存。用酶标仪在激发光波长365nm，发射光波 长455nm下测定巧光产物MU(4-methylumbelliferone)的含量。GUS巧光活性测定W单位 时间内每毫克蛋白分解底物MUG的纳摩尔数表示GUS酶活性。
[0048] 结果显示，两种载体转化的转基因烟草植株根部均有明显的GUS化学染色，而茎、 叶和花组织中没有表现GUS活性，表明HVTIP2 ;1基因的启动子能够在根组织特异地驱动 外源基因表达。GUS巧光活性的定量检测结果亦发现，转基因烟草的根器官显示较高的GUS 活性（〉30nmol.mg-lmin-1)，而茎、叶和花器官中< 1. 2nmol.mg-lmin-1的极低巧光活性水 平，系样本中其它本底杂质的干扰。此外，两种载体的转基因烟草根部GUS活性水平没有显 著差别，说明不同片段长度的两种启动子均有较好的启动活性。
[0049] W上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用W限制本发明，凡在本发明的精 神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 一种大麦根特异性启动子，其特征在于，该启动子是如下1)或2)或3)或4)的DNA 分子： 1) 由序列表中序列1所示的脱氧核糖核苷酸组成的DNA分子； 2) 由序列表中序列2所示的脱氧核糖核苷酸组成的DNA分子； 3) 与1)或2)限定的DNA序列杂交的DNA分子； 4) 与1)或2)限定的DNA序列有90%以上的同源性且能调控目的基因在植物的根中 特异表达的DNA分子。2. 根据权利要求1所述的启动子，其特征在于能有效驱动外源基因在植物根中特异性 表达，所述启动子克隆方法的步骤如下： 根据HvTIP2 ;1基因的mRNA转录起始位点上游序列，设计两条上游引物1310F1 (5< -AAGCTTCGAAGGAAAGGCATTAGAAA-3')和 1310F2(5' -AAGCTTCTGCATTATCAGACAGAACT-3') 以及一条共用的下游引物1310R(5' -CCATGGTGCGGATGATTACCACAA-3')，并在上、下游引 物5'端分别引入Hind III和Nco I限制性内切酶位点； 以大麦基因组DNA为模版，利用上游引物分别与下游引物组成的引物对，通过PCR方法 扩增两条不同长度的启动子片段。3. 根据权利要求2所述的启动子，其特征在于，所述PCR反应体系为：模板 DNA 500ng，上、下游引物（10 y M)各 I y 1，10XPCR Buffer (Mg2+plus) 2 y 1，dNTP Mixture (2. 5mM) I. 6 y I，Ex-Taq DNA 聚合酶（5U/ y I) 0? 2 y I，加双蒸水至 20 y 1。PCR 程序 为：98。〇51^11;941：3〇8,551：3〇8,721：9〇8,35个循环 ；721：延伸1〇111111。4. 根据权利要求2所述的启动子，其特征在于，所述启动子克隆方法进一步包括PCR产 物的回收与质粒重组，具体为：PCR扩增产物经2%的琼脂糖凝胶电泳分离，将目的条带的 回收产物与PMD19-T载体连接，将连接产物转化大肠杆菌感受态细胞，经蓝白斑筛选获得 阳性克隆。5. -种含有权利要求1-4任意一项所述启动子的表达盒和表达载体。6. -种含有权利要求1-4任意一项所述启动子在培育目的基因根特异性表达植物中 的应用。7. -种含有权利要求1-4任意一项所述启动子在转基因植物新品种培育中的应用。
【专利摘要】本发明公开了一种大麦根特异启动子及其应用，该启动子是如下1)或2)或3)或4)的DNA分子：1)由序列表中序列1所示的脱氧核糖核苷酸组成的DNA分子；2)由序列表中序列2所示的脱氧核糖核苷酸组成的DNA分子；3)与1)或2)限定的DNA序列杂交的DNA分子；4)与1)或2)限定的DNA序列有90％以上的同源性且能调控目的基因在植物的根中特异表达的DNA分子。本发明提供的启动子可以启动外源基因在植物根中特异性表达，对根构型重建和根功能改善的作物性状遗传改良具有重要的意义。本发明还提供了含有该启动子的表达盒、重组表达载体，可应用于培育在植物根中特异表达目的基因、生物安全性高的转基因植物品种。
【IPC分类】C12N15/82, A01H5/00, C12N15/113, C12N15/10
【公开号】CN104988153
【申请号】CN201510466125
【发明人】陈静, 徐登安, 余懋群
【申请人】中国科学院成都生物研究所
【公开日】2015年10月21日
【申请日】2015年7月31日