专利名称：长效干扰素融合蛋白及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物制药领域。具体涉及一种用于治疗病毒性感染疾病和肿瘤以及细 胞增殖性疾病的重组长效同源干扰素(ClFN)-人蛋白结合肽(ABP)融合蛋白，及其用途。
背景技术：
人们早期在研究病毒的干扰现象(virus interference)时发现了一种作为抗病 毒物质的蛋白称之为干扰素(interferon)。1957年Isaacs和Lindenmann证明流感病毒 感染的鸡细胞可分泌一种可溶性因子介导细胞对同源和异源病毒都产生抵抗作用。1958年 Nagano和Kojima也观察并得到了相似的结果。这些都为后来更详细地阐明生物机体干扰 素系统打下了早期的基础。1970年代，从白细胞中纯化出干扰素蛋白才使得干扰素真正可 用于研究用途。1980年，由于成功用基因工程方法可获得大量纯化干扰素制剂，这样人们能 够用干扰素对病毒感染疾病和肿瘤患者进行临床实验和治疗。干扰素是由一组诱导产生的细胞因子组成的多基因家族蛋白。干扰素具有广泛作 用，它可调控包括病毒增殖等一系列生物学功能。干扰素通常分为两种1型干扰素，也称 病毒干扰素(Viral IFNs)，包括α -干扰素(白细胞干扰素)和β _干扰素(成纤维细胞 干扰素)，以及ω-干扰素。II型干扰素也称免疫干扰素(Y-干扰素)。病毒干扰素由病 毒感染诱导生成。II型干扰素则由促有丝分裂或抗原刺激诱导生成。大部分病毒感染的细 胞在培养中可合成α/β-干扰素。然而Y-干扰素只能由免疫系统的活性细胞合成之，包 括自然杀伤细胞(NK)，OTfTh1细胞以及⑶8+胞毒/抑制性T细胞。人体有许多病毒干扰素编码基因，包括14种α-干扰素基因，1种β-干扰素和1 种ω-干扰素基因。它们都不含内含子(intron)，它们在人的第9号染色体短臂排列在一 起。小鼠则在它的4号染色体相应区域。Y -干扰素只有1种，它具有3个内含子，它位于人 的第12号染色体长臂；小鼠则为第10号染色体。尽管一些干扰素在机体内可经过一些翻译 后的修饰诸如N-和0-糖基化修饰，但主要的人α -干扰素没有被糖基化。α -干扰素主要 以单体发挥其生物学效应，而β-干扰素和Y-干扰素则以同源二聚源体形式起作用。现在 还不知道人体为什么会有这么多α _干扰素基因。当用基因敲除(gene knock-out)方法除 去小鼠单个β-干扰素基因，产生的小鼠则对病毒感染十分敏感，这说明众多的α-干扰素 基因并不能补偿干扰素基因的作用，干扰素在抗病毒感染过程中有其独特的作用。 由于在实验室中对干扰素进行了大量成功的基础研究，这才有了后来干扰素在临床治疗中 的应用。美国FDA已批准三种干扰素α _，β -和Y-干扰素作为临床治疗药物。对于α -干 扰素用于最广泛的病毒感染性疾病包括乙型和丙型肝炎。此外，α-干扰素还被批准用于 Kaposi氏肉瘤、性病疱疹、毛细胞性白血病、慢性髓性白血病和恶性骨髓瘤的治疗。β-干 扰素被批准用于多发性硬化复发后的治疗。Y“干扰素则被批准用于慢性遗传性免疫紊乱 (慢性肾小球疾病)的治疗。有数家生物制药公司生产治疗用的干扰素药物。Hoffman-La Roche公司生产商品名为RoferonA的干扰素-α 2a ；Schering公司生产商品名为Intron A 的干扰素-a 2b ；Amgen公司生产商品名Infergen的同源干扰素；Interferon Sciences公司生产了商品名为Alferon N的由人白细胞制备而成的干扰素-α N3 ；Glaxo Wellcome公 司生产了商品名为Avonex、Chiron公司商品名为Betaseron的β -干扰素。Genentech公 司生产了商品名Actimmune的γ-干扰素。2001年1月，美国FDA批准了 Schering公司生 产的商品名PEG-Intron的聚乙二醇化干扰素-α 2b用于治疗此前未接受过干扰素治疗的 慢性丙型肝炎病人。Roche也生产聚乙二醇化得干扰素-a 2a(商品名为Pegasys)用于治 疗慢性丙型肝炎病人。同源干扰素(Consensus Interferen，cIFN)是一个全合成的I型干扰素。通过 分析比较14种天然α-干扰素亚型蛋白质序列结构，选取不同亚型相应每一位置上最常出 现的氨基酸组成一新的蛋白质序列(即同源序列)从而得到一全新的同源干扰素。已经比 较了同源干扰素与天然干扰素在抗病毒、抗细胞增殖、激活NK细胞活性、细胞因子诱导以 及干扰素刺激基因表达活性方面的作用。在所有这些作用方面，与干扰素- a 2a和- α 2b 相比较，同源干扰素作用都较二者强。这可能是由于细胞表面I型干扰素受体组成对同 源干扰素较α-干扰素亲和力较高的原因。相反，在诱导白介素生成方面同源干扰 素较α-干扰素弱。这些结果也可能反映了与I型干扰素受体相互作用的多种协同蛋白 (accessery proteins)不同结合作用的结果。这些独特的生物学特性使得同源干扰素比天 然产生和重组天然干扰素在临床治疗上有明显优势。临床试验证明同源干扰素可用于治疗一系列疾病包括慢性病毒感染和某些恶性 肿瘤。在多个临床实验中心进行的各种安全和有效性实验中对同源干扰素和淋巴细胞源性 α-干扰素IFN-α (NAMALWA)治疗感染了高滴度丙肝病毒慢性的肝炎患者进行了比较。 在不增加额外毒性作用的情况下同源干扰素(18MIU)的有效性明显优于IFN-α (NAMALWA) (9MIU)；特别是当患者干扰了基因型为Ib的病毒时效果更为显著。同源干扰素能安全、有 效地作用于治疗慢性丙型肝炎病人以及常规干扰素治疗失败和治疗后复发的患者。近来同 源干扰素也与其它抗肝类化学药物如ribavirin —起合用于治疗慢性丙型肝炎病人。同源 干扰素也成功地用于了乙型肝炎病人的治疗。然而，干扰素治疗与许多蛋白药物一样有明显不足之处就是血液中的半衰期短， α-干扰素注射入机体后迅速被清除之。在这种短循环半衰期条件下，为了达到有效地治 疗效果，往往采用多效量(每日或每周三次)长时间用药(6-12个月或更长)。为了改善 α -干扰素的药代动力学，减少用药频率。有些制药公司将α -干扰素与-12-KDa或30-KDa 大小的聚乙二醇分子结合在一起制备了一种半合成型的干扰素药物(Pegglated IFN)。这 种聚乙二醇化干扰素分子可使α-干扰素在体内作用时间延长，有其正面临床治疗效果。 对聚乙二醇化干扰素的物理化学和生物学特性进行研究揭示了这种半合成干扰素分子特 异的抗病毒活性与结合的聚乙二醇分子的组成和结合位置明显相关。这种聚乙二醇化作用 可降低α-干扰素的特异性生物学比活。白蛋白(分子量为约67KDa)是血液中最丰富的蛋白质，浓度为50mg/ml (600um)。 在人类半衰期为19天。白蛋白的功能包括维持血浆PH值，胶体渗透压，使送代谢产物、脂肪 酸等。并且它可作用血浆中的主要药物载体蛋白。人白蛋白(HSA)的长半衰期及稳定性使 其提供了一种理想的载体与一些短效治疗蛋白组成融合分子。将葡萄球菌G蛋白的白蛋白 结合功能区与人的补体受体-1组成融合蛋白可使后者在大鼠体内半衰期增加3倍达5小 时。将α-干扰素与白蛋白融合产生一种全新的融合蛋白分子。人类基因组公司将β-干扰素与HSA编码基因串联在一起从而表达出一种二者融合蛋白(Albuferon-β).这种重组 融合蛋白具有抗病毒和抗细胞增殖活性，可启动干扰素刺激应答元件(ISRE)介导的信号 传导作用。然而，这种融合蛋白的特异性生物学活性比活仍比α-干扰素低。这可能是由 于HSA与干扰素分子共价融合在一起时可影响后者的空间构象。与白蛋白非共价结合已证明也能延长一些短效蛋白的半衰期。但目前没有关于 干扰素的相关研究，而且如何进行实干扰素与白蛋白进行有效的非共价结合目前也是未知 的。
发明内容
本发明要解决的技术问题是在延长干扰素的体内半衰期的同时还能尽可能地保 持其活性。本发明解决上述技术问题的技术方案是提供一种长效干扰素融合蛋白。该长 效干扰素融合蛋白是由干扰素的C末端通过一段连接肽连接人白蛋白特异性亲和短肽 (HSA-BP)而成。优选的，上述长效干扰素融合蛋白中的干扰素为同源干扰素。其中，上述同源干扰素的氨基酸序列为SEQ ID NO. 1所示。H2N-MCDLPQTHSLGNRRALILLAQMRRISPFSCLKDRHDFGFPQEEFDGNQFQKAQAISVLHEMIQQT FNLFSTKDSSAAWDESLLEKFYTELYQQLNDLEACVIQEVGVEETPLMNVDSIIAVKKYFQRITLYLTEKKYSPCAW EVVRAEIMRSFSLSTNLQERLRRKE-COOH(SEQ ID NO. 1)。其中，上述长效干扰素融合蛋白中的人白蛋白特异性亲和短肽(HSA-BP)的氨基 酸序列为SEQ ID NO. 2所示。H2N-SQRLMEDICLPRffGCLffEDDF-COOH(SEQ ID NO. 2)。其中，上述长效干扰素融合蛋白的其氨基酸序列为SEQ ID NO. 3所示。H2N-MCDLPQTHSLGNRRALILLAQMRRISPFSCLKDRHDFGFPQEEFDGNQFQKAQAISVLHEMIQQT FNLFSTKDSSAAWDESLLEKFYTELYQQLNDLEACVIQEVGVEETPLMNVDSIIAVKKYFQRITLYLTEKKYSPCAW EVVRAEIMRSFSLSTNLQERLRRKEGGGSQRLMEDICLPRffGCLffEDDF-COOH(SEQ ID N0. 3)。其中的干扰素的C末端和人白蛋白特异性亲和短肽HSA-BP之间的连接肽的氨基 酸序列为GGG。本发明在提供上述长效干扰素融合蛋白的同时，也提供了编码上述的长效干扰素 融合蛋白的核苷酸序列。进一步的，编码本发明长效干扰素融合蛋白的核苷酸序列为SEQ ID N0. 4所示。ATGTGCGACCTGCCGCAGACCCACTCCCTGGGTAACCGTCGTGCTCTGATCCTGCTGGCTCAGATGCGT CGTATCTCCCCGTTCTCCTGCCTGAAAGACCGTCACGACTTCGGTTTCCCGCAGGAAGAATTCGACGGTAACCAGTT CCAGAAAGCTCAGGCTATCTCCGTTCTGCACGAAATGATCCAGCAGACCTTCAACCTGTTCTCCACCAAAGACTCCT CCGCTGCTTGGGACGAATCCCTGCTGGAAAAATTCTACACCGAACTGTACCAGCAGCTGAACGACCTGGAAGCTTGC GTTATCCAGGAAGTTGGTGTTGAAGAAACCCCGCTGATGAACGTTGACTCCATCCTGGCTGTTAAAAAATACTTCCA GCGTATCACCCTGTACCTGACCGAAAAAAAATACTCCCCGTGCGCTTGGGAAGTTGTTCGTGCTGAAATCATGCGTT CCTTCTCCCTGTCCACCAACCTGCAGGAACGTCTGCGTCGTAAAGAAGGCGGTGGCTCTCAGCGTCTGATGGAAGAT ATCTGCCTGCCGCGTTGGGGCTGCCTGTGGGAAGATGATTTCTAA(SEQ ID N0. 4)。
本发明还提供了含有权利要求6或7所述的核苷酸序列的载体。本发明还提供了含有权利要求6或7所述的核苷酸序列的宿主细胞。同时，本发明还提供了上述长效干扰素融合蛋白在制备治疗抗病毒药物或抗肿瘤 药物中的用途。本发明还提供了一种治疗抗病毒药物或抗肿瘤药物，该抗病毒药物或抗肿瘤药物 是以上述长效干扰素融合蛋白为主要活性成分添加药学上可接受的辅助性成分制备而成 的。采用高通量筛选方法(HTS)，发现了一个短肽(HSA-BP)能选择性地与人白蛋白进 行高亲和力结合。本发明设计和合成了这一短肽的DNA编码序列，将其与干扰素的编码序 列通过一甘氨酸链编码序列链接在一起，从而编码干扰素-HSA-BP融合蛋白。HSA-BP位于 干扰素的C-末端。将这一融合蛋白的编码序列克隆到大肠杆菌高效表达载体中去，可通过 含有表达载体的大肠杆菌高效表达干扰素-HSA-BP(cIFN-HSA-BP)融合蛋白。采用生化分 离纯化方法从大肠杆菌裂解物中得到高纯度的cIFN-HSA-BP融合蛋白。体外实验证明该融 合蛋白与同源干扰素有相同的抗病毒和抗细胞增殖作用。实验证明，本发明融合蛋白注射到小鼠体内其半衰期比单用ClFN延长12倍。这 说明cIFN-ABP融合蛋白在具有干扰素的抗病毒、抗细胞增殖生物学活性同时，它在体内的 半衰期显著延长，从而其临床治疗作用比干扰素本身有明显的优势。
图1、0. 7KB大小的cIFN-GGG-ABP编码DNA片段的凝胶电泳验证结果图。图 2、凝胶电泳验证结果图。Lane 1 :1KD DNA ladder marker (1 μ g/ΙΟμ 1) ,Lane 2 :pBAD-cIFN 质粒 Nhel+SphI 酶切物 20 μ 1，Lane 3 :pBAD_cIFN 质粒 Xbal+SacI 酶切物 20 μ 1，Lane 4 禾口 5 =PCRI I 反应产物 20 μ 1。图3、凝胶电泳验证结果图。l:lkb DNA ladden Marker (1 μ g/10 μ 1) ;2 集落 ISacI+xbal酶的结果；3 集落2SacI+xbaI酶的结果；4 集落3SacI+xbaI酶的结果；5 集 落4SacI+xbaI酶的结果；6 集落5SacI+xbaI酶的结果。图4、pBAD-cIFN的ECoRV酶切凝胶电泳结果图。1 :ECoRV酶切后的pBAD-cIFN质 粒；2 未经酶切的 pBAD-cIFN 质粒；3 =Ikb DNA Ladder marker (1 μ g/10 μ 1)。结果显示， ECoRV酶切可使pBAD-cIFN质粒线性化。图 5、pBAD-cIFNm 的酶切结果图 1 :lkb DNA ladder make (1 μ/10 μ 1) ；2 pBAD-cIFNm#l质粒经ECORV酶切；3 :pBAD_cIFNm#l质粒Sacl+Xba双酶切；4 =PCR-Blunt II Topo-cIFN 质粒经 Sacl+Xbal 双酶切。图6、生产纯化过程的免疫印迹(Western Blot)鉴定图1、未用L-阿拉伯糖诱导 的细菌裂解液；2、L-阿拉伯糖诱导后的细菌裂解液；3、过Q-Siipharose柱的样品；4最后纯 化完成的蛋白。图7、WeStern blot免疫印迹结果图。第1道为重组cIFN-ABP可被人白蛋白抗体 与人血清白蛋白一起免疫共沉淀下来，第2道为重组cIFN，没有发生免疫共沉淀。图8、重组cIFN-ABP融合蛋白与其它的动物血清白蛋白结合试验结果。1人白蛋 白做对照；2 犬白蛋白；3 大鼠白蛋白；4 猴子白蛋白；5 家兔白蛋白；6 :小鼠白蛋白。
具体实施例方式以下结合附图通过具体实施式进一步说明但不限定本发明。实施例一重组cIFN-ABP蛋白编码基因的获得及其高效表达工程菌的构建人工化学合成ClFN编码基因序列，并克隆到PBAD18质粒载体中(购自英俊公 司 Invitrogen, Carlsbad, USA,其序列参见 J. Bacteriol. 177，4121-4130 (1995))，得到 pBAD-cIFN。首先以该质粒中的cIFN编码序列为模板，用PCR方法在其C-末端加入人白蛋白 特异性亲和短肽(HSA-BP，简称ABP)编码序列及连接序列。PBAD18质粒是大肠杆菌高效表 达质粒。cIFN编码序列是克隆到该质粒的XbaI和SacI酶切位点处。因此，用PCR方法分 2步加入ABP、连接肽以及酶切位点的编码序列以便其cIFN-ABP融合蛋白编码序列能够重 新克隆到该PBAD18表达载体中去高效表达。 PCR反应I 在cIFN编码序列C末端引入连接肽(GGG)及ABP (SQRLMEDICLPRff GCLWEDDF)的编码序列，在0. 2mlPCR管中加入下列成分混勻之
dH2062μ1
5 X HF缓冲液20μ1
10 mM dNTP2μ1
50 mM MgCl24μ1
20 mM pBAD 上游引物(SEQ IDNO. 5) 5μ1
20 mM ABP 编码下游引物(SEQID NO. 8) 5μ1
pBAD-cIFN 质粒( μβ/5μ1) μ
Phusion DNA 聚合酶(2ιι/μ1) μ PCR反应周期为I :98°C 2 分钟11:25 个周期
权利要求
长效干扰素融合蛋白，其特征在于由干扰素的C末端通过连接肽连接人白蛋白特异性亲和短肽HSA BP而成。
2.根据权利要求1所述的长效同源干扰素融合蛋白，其特征在于所述的干扰素为同 源干扰素。
3.根据权利要求2所述的长效同源干扰素融合蛋白，其特征在于所述的同源干扰素 的氨基酸序列为SEQ ID NO. 1所示。
4.根据权利要求2所述的长效同源干扰素融合蛋白，其特征在于所述的人白蛋白特 异性亲和短肽的氨基酸序列为SEQ ID NO. 2所示。
5.根据权利要求2、3或4任一项所述的长效干扰素融合蛋白，其特征在于其氨基酸 序列为SEQ ID N0.3所示，其中的干扰素的C末端和人白蛋白特异性亲和短肽HSA-BP之间 的连接肽的氨基酸序列为GGG。
6.编码权利要求1 5任一项所述的长效干扰素融合蛋白的核苷酸序列。
7.根据权利要求6所述的编码长效干扰素融合蛋白的核苷酸序列，其特征在于其序 列为SEQ ID NO. 4所示。
8.含有权利要求6或7所述的核苷酸序列的载体。
9.含有权利要求6或7所述的核苷酸序列的宿主细胞。
10.权利要求1 5任一项所述的长效干扰素融合蛋白在制备治疗抗病毒药物或抗肿 瘤药物中的用途。
全文摘要
本发明涉及生物制药领域。具体涉及一种重组长效干扰素融合蛋白及其用途。本发明要解决的技术问题是提高干扰素的体内作用时间。解决该问题的技术方案是提供一种融合蛋白。该融合蛋白由N-端的干扰素和C-末端的人白蛋白结合肽以及链接二者之间的甘氨酸链接肽所组成。该蛋白可在大肠杆菌中高效表达，而且纯化工艺简单，可用于大规模工业化生产制备药物级的rcIFN-ABP融合蛋白纯品。与重组同源干扰素(rcIFN)本身相比较，本发明所获得的rcIFN-ABP融合蛋白具有血清半衰期更长的特点。同时其特异性抗病毒比活性与cIFN相当。该rcIFN-ABP融合蛋白可用于治疗病毒感染性疾病，诸如艾滋病、肝炎、SARS、禽流感等；同时也可用于肿瘤以及其它细胞增殖性疾病的治疗。
文档编号C12N15/63GK101942026SQ201010507000
公开日2011年1月12日 申请日期2010年10月14日 优先权日2010年10月14日
发明者吴炯, 易兴旺, 白敏 申请人:成都正能生物技术有限责任公司