专利名称：一种rRNA嵌合启动子及含有该嵌合启动子的表达载体的制作方法
技术领域：
本发明属于分子生物学领域，涉及一种rRNA嵌合启动子及含有该嵌合启动子的 表达载体，特别涉及一种含DNA环调控元件的rRNA rrnB Pl嵌合启动子，及含有该嵌合启 动子的表达载体。
背景技术：
在大肠杆菌中，核糖体的数量是由染色体上七个拷贝的rRNA操纵元的转录水平 控制的。当大肠杆菌代时是20 min时，每个细胞中的核糖体数量约有7万个，当生长速率 较慢时，每个细胞中也大约有2万个。核糖体在细胞中如此巨大的数量说明了 rRNA操纵元 启动子的超强能力。E. coli rRNA操纵元中的启动子Pl是由包括_10区和-35区的核心启动子、位 于-35区上游的富含AT碱基的UP元件和位于UP元件上游的3到5个转录因子(Fis)的 结合位点组成的。尽管已经证明rRNA启动子Pl具有超强能力，但它仍未被用于E. coli进 行高水平表达，其主要原因是，rRNA的体内合成从属于细胞生长速度的控制。在细胞快速 增殖期，Pl是活化的，当细胞处于生长的静息期，则Pl被负调节。所以，rRNA启动子在前诱 导期将持续活化，故难以对其进行调控。因此，实现rRNA启动子Pl的可调控将对外源基因 进行高水平表达具有重要的意义。在目前常用的表达载体中，使用的大部分大肠杆菌启动子均来自相应操纵元，它 们都带有可与阻遏蛋白特异性结合的操纵子区域。在he操纵元中有3个操纵子，除了主要的操纵子(01)，还有两个辅助的 IacO,它们是lac02 (02)和lac03 (03)，02中心位于01下游401 bp处IacrL基因的内 部，03中心位于01上游92 bp处，它们都与阻遏作用有关，Lac阻遏蛋白可以同时结合在两 个操纵子位点上从而形成DNA环，稳定的DNA环使得阻遏效果达到最大程度的。在ara操纵元中有4个操纵子，分别是ara/7，araI2, araOl和ara02。当没有阿 拉伯糖存在时，调节蛋白同时结合在arall和膽02上，形成稳定的DNA环，Pbad启动子的转 录被抑制。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术难以对大肠杆菌rRNA启动子Pl进行调控的不 足，根据基因表达中的DNA环状调控结构设计特殊的rRNA rrnB Pl嵌合启动子，以期实现 rrnB Pl启动子的可控表达。本发明的另一目的是提供含有该嵌合启动子的表达载体。本发明的又一目的是提供一种β -1，4-葡聚糖内切酶基因重组表达载体以及利 用该重组表达载体表达β-1，4-葡聚糖内切酶的方法。本发明的目的可通过如下技术方案实现
一种rRNA rrnB Pl嵌合启动子，该嵌合启动子是在大肠杆菌rRNArrnB操纵元启动子Pl的上下游分别插入乳糖操纵元的两个启动子；或者在大肠杆菌rRNA操纵元启动 子Pl的上下游分别插入阿拉伯糖操纵元的ara/7和ara似启动子，形成环状DNA结构实现 对启动子Pl的控制。其中，所述的大肠杆菌rRNA操纵元启动子Pl的上下游分别插入乳糖操纵元的两 々IacOl启动子，rRNA rrnB Pl嵌合启动子序列为SEQ ID NO. 1，命名为P16S_2。所述的在大肠杆菌rRNA操纵元启动子Pl的上下游分别插入阿拉伯糖操纵元的 arall和ara似启动子，rRNA rrnB Pl嵌合启动子序列为SEQ ID NO. 2，命名为P16S_B。一种大肠杆菌诱导型表达载体，该诱导型表达载体由载体pET29a的T7启动子被 本发明所述的rRNA rrnB Pl嵌合启动子代替所得。所述的诱导型表达载体优选由载体pET29a的T7启动子被序列为SEQ ID NO. 1 的rRNA rrnB Pl嵌合启动子代替所得，命名为pRNP2。所述的诱导型表达载体优选由载体pET29a的T7启动子被序列为SEQ ID NO. 2 的rRNA rrnB Pl嵌合启动子代替所得，命名为pRBB。一种β -1，4-葡聚糖内切酶基因重组表达载体，该重组表达载体是将β -1，4-葡 聚糖内切酶基因⑶插入到本发明所述大肠杆菌诱导型表达载体的损ο 和MfeI位点之 间所得。所述的β-1，4-葡聚糖内切酶基因重组表达载体优选将β-1，4-葡聚糖内切酶 基因cel5G插入到大肠杆菌诱导型表达载体pRNP2的损ol和MfeI位点之间所得，命名为 pRNP2-ce75"G0所述的β-1，4-葡聚糖内切酶基因重组表达载体优选将β-1，4-葡聚糖内切酶 基因ce脱插入到大肠杆菌诱导型表达载体pRBB的损ol和MfeI位点之间所得，命名为 pRBB-ce 况。一种利用重组表达载体表达β -1，4_葡聚糖内切酶的方法，包括如下 步骤
(1)构建调节蛋白AraC重组表达载体以载体pET22b为出发载体，用含自身启动子的 araC基因替代载体pET22b中的T7启动子得到所述的调节蛋白AraC重组表达载体；
(2)构建重组表达载体；
(3)利用步骤(1)和步骤(2)构建的重组表达载体共转化大肠杆菌T0P10感受态细胞， 在同时含有氨苄青霉素和卡那霉素的双抗性LB平板上筛选单菌落；
(4)培养步骤(3)筛选得到的阳性菌株表达β-1，4-葡聚糖内切酶。本发明所述的表达载体pRNP2和pRBB构建方法，包括以下步骤
1)根据待合成的嵌合启动子序列设计一对重叠引物，其中上游引物包含一个调节蛋 白结合位点及rRNA rr/ B核心启动子序列、UP元件和转录因子(Fis)结合位点，下游引物 包含一个调节蛋白结合位点，使得扩增获得的启动子上下游各有一个调节蛋白位点，一个 位于核心启动子-10区下游，另外一个位于Fis结合位点上游。2)以PCR技术或重叠延伸PCR技术，用DNA聚合酶进行PCR扩增，获得嵌合启动 子片段P 16S-2 及 P16S-B ；
3)将扩增获得的嵌合启动子片段与商品化的PMD18-T载体混合，按照T载体使用说 明书上介绍的方法进行操作，通过转化子菌落颜色，筛选出菌落呈白色的阳性克隆，提取质粒，酶切并测序鉴定阳性克隆子，得到含目的片段的重组T载体pl6S-2和pl6S-B。4)将步骤3)中得到的含正确目的片段的重组T-载体用限制性内切酶双酶切，回 收目的片段，用T4 DNA连接酶与同样双酶切后回收的pET29a连接，转化克隆宿主菌，提取 转化子质粒，测序鉴定阳性重组子，得到表达载体PRNP2和pRBB。本发明的有益效果
1)通过DNA环来调控启动子的活性，实现了对rrnB Pl强启动子的人工控制并用于基 因表达，DNA环的形成在很大程度上提高了阻遏的水平，它大大地消除了在诱导前不希望的 本底转录。2)表达载体PRNP2可以利用多种不同类型的大肠杆菌作为宿主菌，比如五coli DH10B、DH5a 和 BL21 (DE3)，优选为五 coli DH10B，调控严谨性优选为五 coli BL21 (DE3) 。在BL21 (DE3)中，在没有诱导剂诱导的情况下，外源基因被完全抑制表达，因此不会造成 质粒的不稳定，细胞生长速度的下降和重组蛋白产量的降低。另外在表达有毒蛋白时，可以 使目的基因完全处于沉默状态而不转录，从而避免目的基因毒性对宿主细胞以及质粒稳定 性的影响。表达载体PRBB可以高效的用于外源基因的表达，在AraC缺乏的大肠杆菌菌株 中，该载体可以不受控表达，并且广泛的宿主范围，因此可以用于外源基因的定向进化。3) pAC+pRBB共表达体系中通过pAC的高表达，实现了 pRBB的严谨控制表达。4)本发明所述嵌合启动子及表达载体PRNP2和pRBB可以方便的实现在多种大肠 杆菌菌株中进行外源基因的高效表达，其中PRBB还可以用于基因的定向进化。
图1 E. coli rRNA启动子Pl结构图 图2嵌合启动子P16S_2结构图
图3嵌合启动子P16S_2调控图 图4表达载体pRNP2构建示意图 图5嵌合启动子P16S_B结构图 图6嵌合启动子P16S_2调控图 图7表达载体pRBB构建示意图 图8重组质粒pAC构建示意图。
具体实施例方式实施例1 启动子片段P16S_2的扩增及中间质粒P16S-2的构建
根据五coli rRNA rrnB Pl启动子序列及Iac操纵子IeicO序列设计PCR引物，具体
为
上游引物S1:SEQ ID NO. 3(含酶切位点)，下游引物S2 :SEQ ID NO. 4。用重叠 长引物对S1/S2互为模板扩增获得P16S_2启动子片段。PCR条件为10 μ L 5XPrimeSTAR Buffer (Mg2+ plus) ,50 μ M dNTP Mixture, 0. 5 μΜ S1,0. 5 μ M S2,1. 25 U PrimeSTAR HS DNA聚合酶(TAKARA)，用无菌水调反应体积至50 μ L0 PCR扩增反应程序为98 °C，10 s, 55 "C, 15 s, 72 "C, 30 s，循环 29 次；72 "C, 10 min。用2%的琼脂糖凝胶电泳提纯PCR产物，并利用Tacl酶能使扩增片段末端加脱氧腺苷的特性，再次进行PCR使每个片段的粘性末端都被补平并加上一个dA0 PCR条件为2. 5 μ L IOX Taq Buffer (Mg2+ plus) ,50 μ M dNTP Mixture, 10 ng DNA 回收片段，1 UTa^DNA 聚合酶，用无菌水调反应体积至25yL。PCR扩增反应程序为72 °C, 20 min ； 10 °C，10min。Τ/Α克隆是对PCR产物直接克隆的一种方法，利用Taq酶具有延伸酶活性，将一个 A残基添加到已完全延伸的PCR产物的3’末端，然后利用含有单个胸腺嘧啶(T) 3’突出 端的线性化载体与带有单个腺苷酸(A) 3’突出端的插入片段来进行的。pMDlS-T simple 载体是由改建而成的，具有同PUC18载体完全相同的功能。该载体的多接头区域位于基因 内部，因此能用蓝/白斑筛选来鉴定含有插入片段的阳性克隆。载体含有氨苄青霉素抗性 基因，可用于筛选含有载体的细菌。经PCR加“A”尾反应后的DNA片段与pMD18-T Vector按2 1比例混合，在连接 液作用下，16 °C水浴过夜。酶连产物转化大肠杆菌DHlOB感受态细胞，在氨苄青霉素(100 μ g ^mL-I) LB平板上于37 ！培养过夜。转化子经PCR及测序鉴定后得到中间质粒pl6S_2。 酶连采用Takara公司的酶连试剂盒进行，其反应体系为
权利要求
一种rRNA rrnB P1嵌合启动子，其特征在于该嵌合启动子是在大肠杆菌rRNA rrnB操纵元启动子P1的上下游分别插入乳糖操纵元的两个lacO1启动子；或者在大肠杆菌rRNA操纵元启动子P1的上下游分别插入阿拉伯糖操纵元的araI1和araO2启动子，形成环状DNA结构实现对启动子P1的控制。
2.根据权利要求1所述的rRNArrnB Pl嵌合启动子，其特征在于所述的rRNA rrnB Pl 嵌合启动子序列为SEQ ID NO. 1。
3.根据权利要求1所述的rRNArrnB Pl嵌合启动子，其特征在于所述的rRNA rrnB Pl 嵌合启动子序列为SEQ ID NO. 2。
4.一种大肠杆菌诱导型表达载体，其特征在于该诱导型表达载体由载体pET29a的T7 启动子被权力要求1所述的rRNA rrnB Pl嵌合启动子代替所得。
5.根据权利要求4所述的大肠杆菌诱导型表达载体，其特征在于所述的诱导型表达载 体由载体pET29a的T7启动子被序列为SEQ ID NO. 1的rRNA rrnB Pl嵌合启动子代替所 得。
6.根据权利要求4所述的大肠杆菌诱导型表达载体，其特征在于所述的诱导型表达载 体由载体pET29a的T7启动子被序列为SEQ ID NO. 2的rRNA rrnB Pl嵌合启动子代替所得。
7.—种β_1，4-葡聚糖内切酶基因重组表达载体，其特征在于该重组表达载体是将 β-1，4-葡聚糖内切酶基因⑶/^G插入到权利要求4所述大肠杆菌诱导型表达载体的损ο 和MfeI位点之间所得。
8.根据权利要求7所述的重组表达载体，其特征在于该重组表达载体是将β-1，4-葡 聚糖内切酶基因ce脱插入到权利要求5所述大肠杆菌诱导型表达载体的损ο 和MfeI位 点之间所得。
9.根据权利要求7所述的重组表达载体，其特征在于该重组表达载体是将β-1，4-葡 聚糖内切酶基因ce脱插入到权利要求6所述大肠杆菌诱导型表达载体的损Ol和MfeI位 点之间所得。
10.一种利用权利要求9所述的重组表达载体表达β-1，4-葡聚糖内切酶的方法，其特 征在于包括如下步骤(1)构建调节蛋白AraC重组表达载体以载体pET22b为出发载体，用含自身启动子的 araC基因替代载体pET22b中的T7启动子得到所述的调节蛋白AraC重组表达载体；(2)构建权利要求9所述的β-1，4-葡聚糖内切酶基因重组表达载体；(3)利用步骤(1)和步骤(2)构建的重组表达载体共转化大肠杆菌TOPlO感受态细胞， 在同时含有氨苄青霉素和卡那霉素的双抗性LB平板上筛选单菌落；(4)培养步骤(3)筛选得到的阳性菌株表达β-1，4-葡聚糖内切酶。
全文摘要
本发明属于分子生物学领域，公开了一种rRNA嵌合启动子及含有该嵌合启动子的表达载体。该嵌合启动子是在大肠杆菌rRNArrnB操纵元启动子P1的上下游分别插入乳糖操纵元的两个lacO1启动子；或者在大肠杆菌rRNA操纵元启动子P1的上下游分别插入阿拉伯糖操纵元的araI1和araO2启动子，形成环状DNA结构实现对启动子P1的控制。该诱导型表达载体由载体pET29a的T7启动子被所述的rRNArrnBP1嵌合启动子代替所得。本发明所述嵌合启动子及表达载体pRNP2和pRBB可以方便的实现在多种大肠杆菌菌株中进行外源基因的高效表达，其中pRBB还可以用于基因的定向进化。
文档编号C12N15/70GK101993878SQ20101050635
公开日2011年3月30日 申请日期2010年10月14日 优先权日2010年10月14日
发明者刘娟, 崔中利, 曹慧, 赵晓丽 申请人:南京农业大学