高效双启动子PLEGFP-N1-spMyoD1绿色荧光逆转录病毒载体构建及使用方法

专利名称：高效双启动子PLEGFP-N1-spMyoD1绿色荧光逆转录病毒载体构建及使用方法
技术领域：
本发明属于动物基因工程及动物分子育种工程技术领域。
背景技术：
随着人们生活水平的不断提高和膳食结构的改变，市场对畜产品的需求逐渐由数 量向质量转变，传统的常规育种方法已经不能适应发展的需求。关于转基因动物的培育日 益引起世界诸多国家的高度重视并已投入了大量人力物力进行开发研究。从Hammer等 (1985)成功获得第1批转基因猪到现存，关于转基因猪的研究已经历20多年的历史，其 中，从对猪生产性能的遗传改良到用猪作为异种器官移植的供者等方面，均取得了一系列 突破性进展。1990年，我国首批转生长激素基因猪在湖北省农业科学院诞生。此后，多种 转基因猪相继问世。1991年美国DNA公司成功获得了能生产人血红蛋白的转基因猪。通 过这些能高效表达的转基因猪来提供大量安全、廉价的血红蛋白，既可节约医药费，又能避 免使用过期、有传染性(如肝炎、艾滋病等)的血液。1993年，Suetlali等将含有编码小鼠 Mxl蛋白的cDNA的3种基因构件分别转移到猪中，获得Mxl转基因猪。湖北省农业科学院 畜牧研究所与中国农业科学院兰州兽医研究所合作，将抗猪瘟病毒(HCV)的核酶基因导入 猪中，获得抗猪瘟病毒的转基因猪。1994年，德国成功培育出转入生长激素(GH)的转基因 猪，使世界上出现了壮如小牛的“超级猪”。2001年，加拿大的科学家培育出的携带大肠杆 菌phytase基因的转基因猪.这种猪可以在唾液中分泌phytase.从而提高对饲料中磷的 消化率.使猪粪中的磷含量比正常猪降低75%。2004年日本近畿大学Saeki K等将菠菜 Δ-12去饱和酶基因转入猪体内，培育出不饱和脂肪酸含量高的转基因猪。2006年底，东北 农业大学教授刘忠华带领的团队研制出中国首只转基因“荧光猪”。这种“荧光猪”在紫外 线的照射下，身体上会发散出晶莹的绿光。2006年3月，美国科学家培育出了体内含有大 量ω-3脂肪酸去饱和酶基因转基因健康猪。2009年，湖北省农业科学院与国内科研机构合 作，也培育出了含有ω-3脂肪酸去饱和酶基因的转基因保健猪，这种基因能在猪体内合成 大量的ω-3脂肪酸；可降低胆固醇和血压，有助于预防人类的心血管疾病。在此过程中，动 物转基因技术也同时得到了多方面的改进和创新。目前，优质转基因猪等的培育已经成为 国内外研究的热点之一。优质转基因猪培育的目的在于提高猪肉的品质、嫩度和风味等，在 转基因育种上游技术开发方面，具有重要育种价值的功能基因筛选和组织特异高效表达载 体的构建，一直被视为优质转基因猪培育的核心技术竞争焦点之一。在具有重要育种价值的功能基因筛选方面，人们通过不同的技术手段筛选了 许多与猪肉的品质、嫩度等密切相关的侯选基因或重要功能基因，其中，生肌决定因子 (MyoD)基因家族控制着肌细胞的增殖和分化，与肌纤维的数量、大小有着密切的关系，因 而对肉质和风味有非常重要的作用，MyoD基因家族可编码4种不同的转录因子，分别为 MyoDl (Myf 3)、Myogenin (MyoG)、Myf5、Myf6 (MRF4)，它们各自或协同控制着骨骼肌生成方面 的关键调节因子。
生肌因子I(MyoDl)是生肌调节因子(myogenic regulatory factors,MRFs)家族 四成员(MyoD、MRF5、MyoG、MRF4)之一，1987年首次被克隆。MyoDl基因不仅可促使静止期 的肌卫星细胞向成肌细胞转化，而且能把许多种类型细胞(如成纤维细胞、脂肪细胞等)转 化为成肌细胞，并可促进成肌细胞进一步融合、分化为成熟的肌纤维。在肌肉特异性基因转 录调控中起着总开关的作用。MyoDl可激活肌肉基因转录，使非肌细胞转变为肌细胞，因骨 骼肌细胞和心肌细胞具有基本相同的收缩装置，通过外源MyoDl诱导心肌成纤维细胞向骨 骼肌细胞转变。肌纤维早在胚胎发育早期就已经形成，并通过成肌细胞的增生和分化得以 生长。胎儿出生后，肌肉细胞的生长是基于成肌细胞和卫星细胞的增生和分化。肌卫星细 胞的增殖和分化可以影响个体的肌肉生长速度和产量，MyoDl基因的变异可能会影响一些 与肌肉相关的生产性状，在畜牧生产中具有潜在的应用价值。Knoll报道，猪的MyoDl内含 子1有1个Dde I PCR-RFLPs位点，MyoDl的A突变基因具有使肌纤维生长更充分，肌纤维 变粗，面积增大的作用。A基因还具有增加胴体瘦肉率和眼肌面积，降低皮脂含量，提高腿臀 比例，增加胴体长度等提高胴体品质的效应，但A基因也会导致肉质的劣变。2005年，朱砺 等对MyoDl基因在不同猪种中的PCR-RFLP遗传多态性及其遗传效应研究中，得到了相似的 结果。这些效应可能与MyoD基因在肌肉生成的早期表达，参与早期肌肉分化的作用有关。 但Jolanta等的研究表明，MyoDl基因对胴体性状的遗传效应依赖于所研究的品系。对此， 还需要进一步的研究。Cieslak等对波兰2个种猪场内7个品种共229头猪进行了 MyoD基 因型与胴体等级性状间的相关性分析，结果表明MyoDl基因型会对胴体的分割肉产生显著 影响，但是在两次重复试验间的试验结果却完全相反。据此，他们推断可能还存在一个未知 的连锁位点在影响相关性状的表型。TePas等的研究表明猪高水平的MyoG、Myf5和MyoDl 的mRNA表达，可以作为选择较高水平的增长率的一个指标。另外，在对瘦肉率进行选择的 过程中，MyoG与MyoDl的比率也可以作为肉色与肌纤维组成比率的指标。MyoDl是生肌调 节因子家族的一个重要的基因，在特异肌基因转录调控中起着总开关的作用。MyoDl介导 的肌分化机制作为研究细胞分化的最佳模型，已成为当前研究的焦点。随着现代分子生物 学的不断发展，人们越来越认识到MyoDl在成肌作用中的重要作用。有鉴于此，本研究对猪 MyoDl基因(pMyoDl)全长⑶S序列进行了克隆、骨骼肌组织特异性高效表达启动子(SP)合 成、SP与pMyoDl融合基因的重叠PCR扩增及逆转录病毒PLEGFP-Nl_spMyoDl表达载体构 建与真核表达鉴定等，为今后进一步用于转基因(PMyoDl基因)动物的制作奠定了基础。在转基因载体构建方面，目前用于转基因目的真核表达载体种类较多，但概括起 来，可用于外源性基因真核表达研究的载体分为病毒和非病毒载体两大类。病毒载体具有 转染效率高，表达稳定等特点，但因其易整合到靶细胞染色体内，故安全性差。非病毒载体 大部分为各种质粒，进入靶细胞后，以附加体的形式存在，具有安全性好，容量大等特点。此 外，报告基因的选择也真核表达载体构建的关键之一。近几年来，报告基因已普通应用于分 子生物学的研究中，常用的有β半乳糖苷酶(LacZ)、β _葡萄糖苷酸酶(⑶S)、分泌型胎盘 磷酸脂酶(SSEAP)、萤火虫荧光素酶(LUC)等。1994年一种新的报告基因增强型绿色荧光 蛋白(EGFP)基因引起了许多学者的注意，该蛋白能够自身催化形成发光结构，并在蓝色激 光下发出绿色荧光。绿色荧光蛋白最初是在多管水母中发现的一种蛋白质。现已证实EGFP 基因能够在多种生物，如细菌、粘菌、酵母、植物和哺乳动物中表达并发出荧光。EGFP之所以 能够作为报告基因是因为它具有以下几个特性(1)种属不依赖性，能够在多种生物中表达；(2)荧光强度高，可在普通荧光显微镜下观测；(3)不需要反应底物与辅助因子，因此不 同于以往常用的LacZ、LUC、CAT、GUS等报告基因；(4)相对较小的分子和单体蛋白使之易于 融合；(5)EGFP肽链中一些特定氨基酸的替代可使之产生不同颜色的光。增强型绿色荧光 蛋白(EGFP)是将Ser65用Thr代替，Phe64用Leu代替，使EGFP的荧光强度提高了 35倍， 而且转染16-24h后仍可稳定表达。由于EGFP作为报告基因具有直观、及时、应用范围广的 特点，因而在基因整合、细胞分选及转基因动物的研究是其它报告基因所无法比拟的。PLEGFP-N1载体的结构特点包括(l)PLEGFP-Nl载体是逆转录病毒载体的一种。 因在多克隆位点旁插入一个能表达绿色荧光的融合蛋白，所以能直接在荧光显微镜下进行 目的基因转染和感染效率的观察，更有利于研究和应用。(2) LEGFP-NI是切除了 gag、pol、 env等病毒结构基因的缺陷型病毒载体，不能形成子代病毒颗粒，必须借助包装细胞提供的 病毒结构蛋白完成包装，产生具有感染性但无复制能力的伪病毒颗粒；故安全性高。(3)含 有人巨细胞病毒(CMV)即刻早期启动子。(4)MCS下游紧接EGFP，外源目的基因插入后与 EGFP形成融合基因；若EGFP有表达，则外源目的基因一定是插人片段正确且有表达；EGFP 起始点插有Kozak序列以提高在真核细胞的翻译效率。(5)含有Amp、Neo基因，前者可用 氨苄青霉素筛选原核细胞；后者可用G418来筛选真核靶细胞。基于不同的研究和应用目的，张勇等(2003)构建鼠真核表达的双顺反子质粒载 体pIRES2-EGFP-MyoD，为研究MyoD对肌损伤的修复作用提供物质基础。为研究MASHl在间 充质干细胞神经分化中的作用，赵杰等(2006)构建了含小鼠MASHl基因的绿色荧光蛋白表 达载体PEGFP2-C3-MASH-1。刘芳等(2006)进行了 pEGFP-植酸酶基因质粒重组构建及其在 C0S7细胞中表达分析。王国栋等(2007)构建了 pEGFP-Nl-heNOS真核表达重组质粒。为分 析ZNF580-EGFP融合蛋白在人胚肾HEK293细胞中的表达和亚细胞定位，张文成等(2008) 构建了人ZNF580与增强型绿色荧光蛋白(EGFP)融合蛋白真核表达载体。唐小龙等(2008) 构建了人胰腺十二指肠同源框蛋白 l(pancreatic and duodenal homeobox factorl,Pdxl) 转录因子真核表达质粒，并检测其在真核细胞中的表达能力及其生物活性。为肿瘤的诊断 及治疗提供新的线索，张姗妮等(2009)构建了人Caveolin-Ι基因PEGFP-Nl真核表达载 体。为研究PPl α对骨肉瘤细胞凋亡影响，崔笑等(2010)构建了 pEGFP-Nl-PPla真核表 达载体。黎静等(2010)克隆人类ZNF217基因cDNA全长，构建ZNF217的真核表达载体，并 在真核细胞中表达。韦光辉等(2010)克隆牛生长激素BGH基因并构建了 pEGFP-Nl-BGH真 核表达载体。综合以上的国内外研究资料可发现，绿色荧光PLEGFP-Nl-MyoDl转基因载体仍不 够完备，现有的检测技术方法仍存在如下两个方面的不足1并非专用于猪的骨骼肌组织特异高效表达。2本方法制备的绿色荧光PLEGFP-Nl-spMyoDl转基因载体是已经过包被处理的， 可直接用于转染待转的靶细胞或靶组织，阳性标本的确定试验仍为绿色荧光观察及目的基 因片段的PCR扩增方法检测鉴定。

发明内容
本发明的目的是提供一种高效双启动子PLEGFP-Nl-spMyoDl绿色荧光逆转录病 毒载体构建及使用方法，它旨在克隆猪的MyoDl基因，构建含有CMV和骨骼肌特异启动子SP (双启动子)、以真核绿色荧光EGFP为标记、以猪MyoDl (pMyoDl)为外源基因的高效表达 载体。在改进后的绿色荧光PLEGFP-Nl-SP-pMyoDl载体中，又增加了一个调控绿色荧光蛋 白(EGFP)或其融合蛋白表达的骨骼肌组织特异性高效表达启动子(SP)，从而实现了对绿 色荧光蛋白(EGFP)或其融合蛋白双启动子(Pqw和SP启动子)控制的骨骼肌组织特异性 表达目的。同过去的方法比较，不仅弥补了目的基因组织表达特异性的不足，而且提高了在 特异组织(骨骼肌)中的表达强度和敏感度，同时提高了对目的基因功能研究的针对性和 准确度。为进一步研究PMyoDl蛋白表达、重组蛋白活性鉴定和生物学功能奠定基础；同时 为用于转PMyoDl基因的模型动物制备创造了条件。本发明的技术方案是首先人工合成一骨骼肌特异启动子SP序列、采用RT-PCR方法从猪的骨骼肌组织中扩增MyoDl基因全长CDs序列；设计融合引物、利用重叠PCR扩 增方法获得启动子SP和pMyoDl的融合基因序列，T/A克隆到pMD18_T载体中，双酶切后 将融合基因亚克隆入以真核表达绿色荧光蛋白为标记的逆转录病毒PLEGFP-N1载体，构建 PLEGFP-Nl-spMyoDl双启动子高效表达载体，经限制性内切酶鉴定并测序。用脂质体法转染 293T细胞系包装、扩增，对病毒滴度和感染效率进行监测。本发明的具体技术方案是1引物设计根据GenBank中已发表的猪MyoDl基因mRNA序列(Accession No. ΝΜ_001002824)，应用 Primer Premier5. O, DNA Club 和 Oligo 6. O 设计特异性引物 Pl 和P2，预期扩增长度为960bp。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。上游引物Pl:5' -ATGGAGCTGCTGTCGCCACCGCTC-3‘；下游引物P2:5' -GTCGGATCCTCAGAGCACCTGGTAGATAGG-3'；2PCR扩增的反应条件用引物Pl和P2从RT-PCR产物cDNA扩增长度为960bp (lbp 960bp)的编码区 序列。反应程序95°C预变性5min，进入循环95°C变性30s，58°C退火40s，72°C延伸2min， 循环总数:30circles ；最后延伸72°C 4min。3骨骼肌组织特异性高效表达启动子(SP)的合成参考GenBank中已发表的老鼠染色体1和2基因组的部分5、侧翼调控区的保守 序列(Accession No. NT_039170,NW_001030694,NW_001030671)和鸡骨骼肌组织 α-actin 基因的顺式作用调控与转录控制区核心序列(AccessionNo. M13631)，优化并合成了骨骼肌 组织特异性高效表达启动子(SP)序列，启动子SP序列见附件2。在其;T末端人工接一长 为24bp的寡聚核苷酸接头。接头序列5'-TACCTCGACGACAGCGGTGGCGAG-3‘。4SP与pMyoDl融合基因的重叠PCR扩增根据已合成的带接头的SP启动子序列和扩增到的pMyoDl基因cDNA序列，应用 PrimerPremier5. 0和Oligo 6. 0设计特异性融合引物P3和P4，预期扩增长度为1240bp。在NCBI GENEBANK中找到基因序列后，看选择的酶切位点，在所要进行PCR的基因 序列中是否存在；用Primer primer5把序列反向互补；在应用Oligo 6.0引物设计时，上下游引物全长输入；上游引物位点的确定为5’端模板第一个碱基前面的所有碱基(包括酶 切位点+保护碱基)的负数值+1下游引物位点的确定为下游引物-酶切位点-保护性碱 基=A，序列全长-A+1 =下游引物位点。引物设计时候要考虑到序列的起始碱基和末尾碱 基中是否包含起始密码子(ATG)和终止密码子(TAA)，如果有，要考虑是否需要删除或者保 留。引物长度的选择要考虑到CG比例，酶切位点的选择要兼顾廉价，常用，而且要兼顾其加 入后引物的GC比例变化；还要考虑到酶切位点的序列是否在PCR的全序列中出现，如果出 现要选择其它酶切位点。前面适当加碱基调节GAC比例，5’端照抄；3’端反向互补；保护性 碱基和酶切位点加在引物前面。自身互补，二聚体(两个引物之间)<6，负数值越大能量 越大，退火温度越高，错配几率越小。上游融合引物P3:5' -GACCTCGAGCACCATTCCTCACGACACCCA-3‘；下游融合引物P4:5' -GTCGGATCCTCAGAGCACCTGGTAGATAGG-3‘；为下一步克隆需要，分别在上、下游引物中引入Xho I和BamH I酶切位点。重叠PCR扩增重叠PCR反应体系(50. 0 μ 1)见表2。反应程序95°C预变性3min， 进入循环94°C变形30s，53°C退火45s，72°C延伸3min，循环总数:30circles ；最后延伸 720C 5min。PCR反应产物在1 %琼脂糖凝胶电泳观察结果，并照相记录，最后切胶回收纯化 含有SP启动子的融合MyoDl基因cDNA(spMyoD11240bp)5spMyoDl融合基因的克隆spMyoDl基因连接到pMD18T-Simple载体。连接体系(20. 0 μ 1)见表3 ；连接条 件16°C，5h，然后涂板、挑克隆、培养(加Amp)。将spMyoDl基因连接到pMD18T-Simple载 体的菌种进行测序，菌种记作pMD-spMyoDl。6逆转录病毒PLEGFP-Nl-spMyoDl表达载体构建用BamH I 禾Π Xho I 进行亚克隆。将 spMyoDl 基因从 pMD-spMyoDl 用 XhoI、 BamH I酶切下来，亚克隆到同样用这两种内切酶切酶过的PLEGFP-N1载体上，记作为 PLEGFP-Nl-spMyoDl ο spMyoDl与PLEGFP-附片段载体连接体系见表5。7纯质粒的提取取Iul质粒加入到9ul的无菌水中，把IOul的混合液加到IOOul的DH5 α感受态 中，DH5 α感受态从负80度冰箱取出，冰上溶解，加入后冰上放置30分钟，42度水浴45秒 后放入冰上1分钟，加入890ul的LB培养基，37度摇床200转培养一个小时，取200ul培养 菌涂布到含抗生素的LB平板上，37度倒置培养16-18小时，挑取菌落到500ul含抗生素的 培养基中12小时以上培养，24小时后吸取培养液200ul到2ml的含抗生素的LB培养基中 继续12小时以上培养，吸取2ml培养菌，按照超纯质粒提取试剂盒中方法进行质粒提取。8细胞复苏从液氮中取出一支冻存的293T细胞，快速的在37°C水浴锅中溶解，把293T细胞吸 到装有IOml的培养液的50ml的离心管中，1500rpm离心5分钟，倒掉废液，加入2ml的培养 基(DMEM+10%的胎牛血清+1%双抗)，温和晃均勻，把2ml的细胞悬液加到6孔板中的一个 孔里，放入37度二氧化碳培养箱中培养48小时，根据细胞情况进行消化传代。细胞长满90%时可以传代，用37°C预热的PBS洗两遍，加入200ul的0. 25%的胰酶消化，细胞变形后(一般是10秒)加入2ml的培养基，反复吹打，倒置显微镜下观察细胞 成单个，停止吹打，把2ml悬液吸到50ml的离心管中，1500rpm离心5分钟，倒掉废液，加入 4ml的培养基，温和晃均勻，把每2ml的细胞悬液加到6孔板中的一个孔里，放入37°C CO2培 养箱中培养48小时，根据细胞情况进行消化传代。9细胞转染方法贴壁细胞转染前一天，每孔细胞长到50 %的时候，细胞加2ml的无抗生素 DMEM+10%胎牛血清培养基培养，细胞长到80% -90%，可以开始转染。取20ng/ul的质粒DNA 30ul加到在Opti-MEM 220ul无血清培养基，总体积 250ul，轻轻混合。放置5分钟。用脂质体2000转染293T细胞(1)取脂质体200010ul，加到在Opti-MEM 240ul无血清培养基，总体积250ul，轻
轻混合。放置5分钟。(2)把脂质体混合液加到DNA混合液中，轻轻混合；放置20分钟。(3)每20分钟内细胞换液，加入1. 5ml的无抗生素的培养基(DMEM+10%胎牛血 清)，把脂质体和DNA的混合液共500ul，逐滴加到6孔板中的一个孔里，依次类推。轻轻混 合，放入37°C CO2培养箱中培养，并分别于脂质体2000转染293T细胞36小时、42小时和 48小时观察培养效果。10重组蛋白MyoDl在293T细胞中的表达和检测在荧光显微镜下观察转染后，在37°C C02培养箱中已培养48小时的细胞293T阳 性结果。结果表明，PLEGFP-N1空质粒的转染效率可达80%，目的基因PLEGFP-Nl-spMyoDl 克隆质粒转染效率平均可达24%，最高达33 %。11利用本发明的载体建立转pMyoDl基因鼠①病毒包装取上述脂质体2000和DNA的混合液，用PT67细胞替代293T细胞，脂 质体转染后4天开始收集上清液。②病毒上清液Iml (6孔板一个孔)加到胚胎干细胞的培养基中，42小时荧光显微 镜下观察，确定荧光克隆。③荧光阳性克隆筛选进行G418筛选，保留目的基因的细胞克隆，收集病毒，进行 保种。④取受孕老鼠，经麻醉后，利用手术法从受孕的老鼠体内取囊胚，用自制持卵器在 体式显微镜下进行微注射，把注射成功的囊胚再移植到受体老鼠子宫。⑤受体老鼠妊娠、分娩、转基因老鼠诊断、哺育。⑥转基因仔鼠断乳、饲养。⑦转基因老鼠骨骼肌组织中目的基因(pMyoDl)的RT-PCR扩增检测分别取30日 龄转基因老鼠的骨骼肌、心脏、肝脏、肺脏、肠道、皮肤组织，参照步骤2. 1. 2提这6种组织的 总RNA，并进行目的基因的RT-PCR扩增检测。本发明的使用方法是采用发明制备的绿色荧光PLEGFP-Nl-SP-pMyoDl逆转录病 毒载体是已经过包被处理的，可直接用于转染待转的靶细胞或靶组织，在365nm波长紫外 光激发下，阳性标本为绿色荧光观察及目的基因片段的PCR扩增方法检测鉴定。测定结果判断⑴在波长为365nm紫外光下，阳性可观察到绿色荧光；(2)PCR扩增后可检测到目的基因片段的条带。本发明的有益效果是1根据GeneBank中已发表的猪MyoDl基因mRNA序列，应用Primer Premier5. O, DNA Club和Oligo 6.0自行设计出引物。2在逆转录病毒载体PLEGFP-N1中，除其5、病毒LTR区具有一个控制在真核细胞 中抗性选择的新霉素抗性标记基因(NecZ)表达的病毒启动子外，含有一个调控绿色荧光蛋 白(EGFP)或其融合蛋白表达的人类细胞性肥大病毒启动子(Pqw), —旦含有目的基因的逆 转录病毒载体PLEGFP-N1在动物早期胚胎中成功转染，则含目的基因编码的EGFP融合蛋 白可在该转基因动物的所有组织或器官中表达，不能实现目的基因的特异性组织或器官表 达。然而，绿色荧光PLEGFP-Nl-SP-pMyoDl逆转录病毒载体克服了过去PLEGFP-N1的目的 基因无法特异性组织表达的局限性。3在改进后的绿色荧光PLEGFP-Nl-SP-pMyoDl载体中，又增加了一个调控绿色荧 光蛋白(EGFP)或其融合蛋白表达的骨骼肌组织特异性高效表达启动子(SP)，从而实现了 对绿色荧光蛋白(EGFP)或其融合蛋白双启动子(Paw和SP启动子)控制的骨骼肌组织特 异性表达目的。同过去的方法比较，不仅弥补了目的基因组织表达特异性的不足，而且提高 了在特异组织(骨骼肌)中的表达强度和敏感度，同时提高了对目的基因功能研究的针对 性和准确度。4对绿色荧光PLEGFP-Nl-SP-pMyoDl载体在特异组织(骨骼肌)中的表达进行检 测，同改进前比较，不但不会影响对其直接荧光观察和EGFP的PCR法检测，而且可从被检动 物的骨骼肌组织中进行PCR法检测，具有双重PCR法检测快速、便捷，可靠性强的优点。


图1是pMyoDl基因PCR产物1. 0%琼脂糖凝胶电泳检测结果，其中M :DNA marker ； 泳道1,2,3 =PMyoDl基因的扩增产物；图2是构建的载体示意图；图3是用XhoI、BamH I进行双酶切鉴定结果；其中M =DNA marker ；泳道1 (空) 载体PLEGFP-N1酶切后的片段(另一条带仅47bp，图中观察不到):2 :PLEGFP-Nl-spMyoDl 酶切后的载体和spMyoDl片段(已含有SP序列)图4是目的基因的PCR扩增检测结果，其中M :DNA marker ；泳道1，2 :PMyoDl基因 的扩增产物；图5是目的基因的测序峰图谱；图6是37°C CO2培养箱中培养48小时的293T细胞；图7是在荧光显微镜下观察到转染后培养48小时的细胞293T阳性结果；其中(a) 细胞293T转染的阴性对照、(b)PLEGFP-Nl空载质粒转染对照、(c) PLEGFP-Nl-spMyoDl质粒 转染阳性结果；图8是被转染293T细胞RNA提取结果。图9是被检细胞或组织中的目的基因的RT-PCR扩增检测结果；其中M IOObp ladder ；泳道1-2 被转染的293T细胞；3 骨骼肌，4 心脏，5 肝脏，6 肺脏，7 肠道，8 皮 肤组织；9 阴性对照，10 阳性对照(315bp)；
图10是在荧光显微镜下观察到转染后培养48小时的细胞C2C12细胞阳性结果 (PLEGFP-Nl-spMyoDl质粒转染阳性结果)
具体实施例方式工艺条件一双启动子绿色荧光逆转录病毒PLEGFP-Nl-SP-pMyoDl高效真核表达载体的构 建及其真核表达主要器材药品与试剂DH5a感受态菌种，LB培养基固体和液体1000ml PH7. 0 ；蛋白胨 10. 0g，酵母抽提 5. 0g, NaCl 100g，琼脂粉 15. 0g, Amp 抗性工作浓度为 100ng/ml，0. Imo 1/ L的CaC12溶液。酶及相关试剂PLEGFP-N1载体质粒(Clontech公司)、核酸内切酶Xhol、 BamHI,T4 连接酶(Fermentas 公司)、ExTaq 聚合酶、pMD18T_simple 载体(TaKaRa) ,2XTaq PIusDNA聚合酶(大连宝生物工程有限公)、血液基因组提取试剂盒(离心柱型)TIANGEN TIANamp Genomic DNA Kit (TIANGEN公司)、质粒提取试剂盒、凝胶回收试剂盒(大连宝生 物工程有限公司)、反转录按RT reagents试剂盒(TAKARA公司)。实验方法(一).基因组DNA和骨骼肌组织mRNA的制备猪的血样和骨骼肌组织样分别采自吉林省农科院畜牧分院和长春博星食品有限 公司养猪场。1. 1猪基因组DNA的提取取新鲜猪血(加肝素钠及10% SDS液)20ul，加缓冲液GA180ul，加入20ul蛋白 酶K溶液，摇勻。加入200ul缓冲液GB，充分颠倒混勻，70°C放置lOmin，溶液应变清凉，短 暂离心后去除管盖内壁的水珠。加200ul无水乙醇，充分振荡混勻15s。将所得溶液和絮 状沉淀都加入一个吸附柱CB3中，12000rpm离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管 中。在吸附柱CB3中加入500ul缓冲液⑶，12000rpm离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放 入收集管中。向吸附柱CB3中加入700ul漂洗液PW，12000rpm离心30s，倒掉废液，将吸附 柱CB3放入收集管中。向吸附柱CB3中加入500ul漂洗液PW，12000rpm离心30s，倒掉洗 液。将吸附柱CB3放回收集管中，12000rpm离心2min，倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温 放置数分钟，以去除吸附材料中残余的漂洗液。将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向 吸附膜的中间部位悬空滴加IOOul洗脱缓冲液TE，室温放置2-5min，12000rpm离心2min， 将溶液收集到离心管中。DNA产物应保存在-20°C，以防DNA降解。1. 2猪骨骼肌组织mRNA的提取迅速取猪腿部骨骼肌，液氮冷冻，使用TRIzol RNA提取试剂盒(Gibco公司)提 取总RNA，参照RNA试剂盒操作说明用Trizol法进行猪骨骼肌组织总RNA的提取，_80°C保存。1. 3RT-PCR 与 cDNA 的合成反转录按RT reagents试剂盒说明书进行。(二)·猪 MyoDl 基因(pMyoDl)的扩增2. 1引物设计
根据GenBank中已发表的猪MyoDl基因mRNA序列(Accession No. ΝΜ_001002824)，应用 Primer Premier5. O, DNA Club 和 Oligo 6. O 设计特异性引物 Pl 和P2，预期扩增长度为960bp。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。上游引物Pl:5 ‘ -ATGGAGCTGCTGTCGCCACCGCTC-3‘；下游引物P2:5' -GTCGGATCCTCAGAGCACCTGGTAGATAGG-3'；2. 2PCR 扩增用引物Pl和P2从RT-PCR产物cDNA扩增长度为960bp (lbp 960bp)的编码区 序列。扩增反应体系(25ul)见表1。反应程序95°C预变性5min，进入循环95 °C变性30s，58 °C退火40s，72 °C延伸2min，循环总数30circles ；最后延伸 72 0C 4min。表1猪MyoDl基因cDNA的PCR扩增体系
权利要求
一种高效双启动子PLEGFP N1 spMyoD1绿色荧光逆转录病毒载体构建，其特征是首先人工合成一骨骼肌特异启动子SP序列、采用RT PCR方法从猪的骨骼肌组织中扩增MyoD1基因全长CDs序列；设计融合引物、利用重叠PCR扩增方法获得启动子SP和pMyoD1的融合基因序列，T/A克隆到pMD18 T载体中，双酶切后将融合基因亚克隆入以真核表达绿色荧光蛋白为标记的逆转录病毒PLEGFP N1载体，构建PLEGFP N1 spMyoD1双启动子高效表达载体，经限制性内切酶鉴定并测序；用脂质体法转染293T细胞系包装、扩增，对病毒滴度和感染效率进行监测。
2.根据权利要求1所述的一种高效双启动子PLEGFP-Nl-spMyoDl绿色荧光逆转录病毒 载体构建，其特征是a、引物设计根据猪 MyoDl 基因 mRNA 序列 Accession No. NM_001002824,应用 Primer Premier5. 0， DNAClub和Oligo 6. 0设计特异性引物PI和P2，扩增长度为960bp ；上游引物PI(5 ‘ -ATGGAGCTGCTGTCGCCACCGCTC-3‘；下游引物P2(5 ‘ -GTCGGATCCTCAGAGCACCTGGTAGATAGG-3‘；b、PCR扩增的反应条件用引物P1和P2从RT-PCR产物cDNA扩增长度为lbp 960bp的编码区序列；反应程 序是95°C预变性5min，进入循环95°C变性30s，58°C退火40s，72°C延伸2min，循环总数 30circles ；最后延伸 72°C 4min ；c、骨骼肌组织特异性高效表达启动子SP的合成老鼠染色体1和2基因组的部分5、侧翼调控区的保守序列Accession No. NT_039170、 NW_001030694、NW_001030671和鸡骨骼肌组织a -actin基因的顺式作用调控与转录控制 区核心序列Accession No. M13631，优化并合成了骨骼肌组织特异性高效表达启动子SP序 列，启动子SP序列；在其3、末端人工接一长为24bp的寡聚核苷酸接头；接头序列 5' -TACCTCGACGACAGCGGTGGCGAG-3 ‘；d、SP与pMyoDl融合基因的重叠PCR扩增根据已合成的带接头的SP启动子序列和扩增到的pMyoD 1基因cDNA序列，应用 PrimerPremier5. 0和Oligo 6. 0设计特异性融合引物P3和P4，扩增长度为1240bp ；在NCBI GENEBANK中找到基因序列后，看选择的酶切位点，在所要进行PCR的基因序列 中是否存在；用Primer primer5把序列反向互补；在应用Oligo 6. 0引物设计时，上下游引 物全长输入；上游引物位点的确定为5’端模板第一个碱基前面的所有碱基的负数值+1下 游引物位点的确定为，下游引物-酶切位点-保护性碱基=A，序列全长-A+1 =下游引物位 点；引物设计时候要考虑到序列的起始碱基和末尾碱基中是否包含起始密码子ATG和终止 密码子TAA，如果有，要考虑是否需要删除或者保留；引物长度的选择要考虑到CG比例，前 面适当加碱基调节GAC比例，5’端照抄；3’端反向互补；保护性碱基和酶切位点加在引物前 面；自身互补，二聚体两个引物之间<6，负数值越大能量越大，退火温度越高，错配几率越上游融合引物P3(5 ‘ -GACCTCGAGCACCATTCCTCACGACACCCA-3‘； 下游融合引物P4(5 ‘ -GTCGGATCCTCAGAGCACCTGGTAGATAGG-3‘；为下一步克隆需要，分别在上、下游引物中引入Xho I和BamH I酶切位点； 重叠PCR扩增重叠PCR反应体系；反应程序95°C预变性3min，进入循环94°C变形30s， 53°C退火45s，72°C延伸3min，循环总数30circles ；最后延伸72°C 5min ；PCR反应产物在 琼脂糖凝胶电泳观察结果，并照相记录，最后切胶回收纯化含有SP启动子的融合MyoDl 基因cDNA ；e、spMyoDl融合基因的克隆spMyoDl基因连接到pMD18T-Simple载体。连接体系；连接条件16°C，5h，然后涂板、挑 克隆、培养加Amp ；将spMyoDl基因连接到pMD18T-Simple载体的菌种进行测序，菌种记作 pMD-spMyoDl ；f、逆转录病毒PLEGFP-Nl-spMyoDl表达载体构建用BamH I禾P Xho I进行亚克隆，将spMyoDl基因从pMD-spMyoDl用Xhol、 BamH I酶切下来，亚克隆到同样用这两种内切酶切酶过的PLEGFP-N1载体上，记作为 PLEGFP-Nl-spMyoDl, spMyoDl 与 PLEGFP-N1 片段载体连接；g、纯质粒的提取取lul质粒加入到9ul的无菌水中，把10ul的混合液加到lOOul的DH5 a感受态中， DH5 a感受态从负80度冰箱取出，冰上溶解，加入后冰上放置30分钟，42度水浴45秒后放 入冰上1分钟，加入890ul的LB培养基，37度摇床200转培养一个小时，取200ul培养菌涂 布到含抗生素的LB平板上，37度倒置培养16-18小时，挑取菌落到500ul含抗生素的培养 基中12小时以上培养，24小时后吸取培养液200ul到2ml的含抗生素的LB培养基中继续 12小时以上培养，吸取2ml培养菌，按照超纯质粒提取试剂盒中方法进行质粒提取；h、细胞复苏从液氮中取出一支冻存的293T细胞，快速的在37°C水浴锅中溶解，把293T细胞吸到装 有10ml的培养液的50ml的离心管中，1500rpm离心5分钟，倒掉废液，加入2ml的培养基， 温和晃均勻，把2ml的细胞悬液加到6孔板中的一个孔里，放入37度二氧化碳培养箱中培 养48小时，根据细胞情况进行消化传代；细胞长满90%时可以传代，用37°C预热的PBS洗两遍，加入200ul的0. 25%的胰酶消 化，细胞变形后10秒加入2ml的培养基，反复吹打，倒置显微镜下观察细胞成单个，停止吹 打，把2ml悬液吸到50ml的离心管中，1500rpm离心5分钟，倒掉废液，加入4ml的培养基， 温和晃均勻，把每2ml的细胞悬液加到6孔板中的一个孔里，放入37°C C02培养箱中培养48 小时，根据细胞情况进行消化传代； j、细胞转染方法贴壁细胞，转染前一天，每孔细胞长到50%的时候，细胞加2ml的无抗生素DMEM+10% 胎牛血清培养基培养，细胞长到80% -90%，可以开始转染；取20ng/ul的质粒DNA 30ul加到在0pti_MEM 220ul无血清培养基，总体积250ul，轻 轻混合。放置5分钟；用脂质体2000转染293T细胞(1)取脂质体200010ul，加到在Opti-MEM240ul无血清培养基，总体积250ul，轻轻混 合。放置5分钟；(2)把脂质体混合液加到DNA混合液中，轻轻混合；放置20分钟；(3)每20分钟内细胞换液，加入1.5ml的无抗生素的培养基DMEM+10%胎牛血清，把脂 质体和DNA的混合液共500ul，逐滴加到6孔板中的一个孔里，依次类推。轻轻混合，放入 37°C C02培养箱中培养，并分别于脂质体2000转染293T细胞36小时、42小时和48小时观 察培养效果；k、重组蛋白MyoDl在293T细胞中的表达和检测在荧光显微镜下观察转染后，在37°C C02培养箱中已培养48小时的细胞293T阳性结 果。结果表明，PLEGFP-N1空质粒的转染效率可达80%，目的基因PLEGFP-Nl-spMyoDl克隆 质粒转染效率平均可达24%，最高达33% ；.1、利用本发明的载体建立转pMyoDl基因鼠①病毒包装取上述脂质体2000和DNA的混合液，用PT67细胞替代293T细胞，脂质体 转染后4天开始收集上清液；②病毒上清液1ml加到胚胎干细胞的培养基中，42小时荧光显微镜下观察，确定荧光 克隆；③荧光阳性克隆筛选进行G418筛选，保留目的基因的细胞克隆，收集病毒，进行保种；④取受孕老鼠，经麻醉后，利用手术法从受孕的老鼠体内取囊胚，用自制持卵器在体式 显微镜下进行微注射，把注射成功的囊胚再移植到受体老鼠子宫；⑤受体老鼠妊娠、分娩、转基因老鼠诊断、哺育；⑥转基因仔鼠断乳、饲养；⑦转基因老鼠骨骼肌组织中目的基因PMyoDl的RT-PCR扩增检测分别取30日龄转基 因老鼠的骨骼肌、心脏、肝脏、肺脏、肠道、皮肤组织，并进行目的基因的RT-PCR扩增检测。
3. 一种高效双启动子PLEGFP-Nl-spMyoDl绿色荧光逆转录病毒载体构建的使用方法， 其使用方法是绿色荧光PLEGFP-Nl-SP-pMyoDl逆转录病毒载体是已经过包被处理的，可 直接用于转染待转的靶细胞或靶组织，在365nm波长紫外光激发下，阳性标本为绿色荧光 观察及目的基因片段的PCR扩增方法检测鉴定。
全文摘要
一种高效双启动子PLEGFP-N1-spMyoD1绿色荧光逆转录病毒载体构建，属于动物基因工程及动物分子育种工程技术领域，其特征是人工合成一骨骼肌特异启动子序列、采用RT-PCR方法从猪的骨骼肌组织中扩增基因全长序列；设计融合引物、利用重叠PCR扩增方法获得启动子和融合基因序列，T/A克隆到pMD18-T载体中，构建PLEGFP-N1-spMyoD1双启动子高效表达载体，经限制性内切酶鉴定并测序；用脂质体法包装、扩增，对病毒滴度和感染效率进行监测。有益效果是1.应用Primer Premier5.0，DNA Club和Oligo 6.0自行设计出引物。2.克服了过去的目的基因无法特异性组织表达的局限性。3.同时提高了对目的基因功能研究的针对性和准确度。4.具有检测快速、便捷，可靠性强的优点。
文档编号C12N15/66GK101993895SQ201010506230
公开日2011年3月30日 申请日期2010年10月14日 优先权日2010年10月14日
发明者包艳波, 徐日福, 王志贤, 秦宁 申请人:徐日福;秦宁;王志贤;包艳波