专利名称：大豆疫霉无毒基因PsAvr3b的标记的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种大豆疫霉无毒基因的标记，具体涉及一种与大豆疫霉无毒基因 PsAvrfb基因共分离的分子标记基因PsAvh307，以及在无毒基因标记过程中所用的快速的 标记方法。
背景技术：
大豆疫霉菌属于鞭毛生物界卵菌门霜霉亚纲腐霉目腐霉科疫霉属(Tyler，2007)， 疫霉属包含有80多个疫霉种，很多种都是农业生产上重要的病原菌。与多数疫霉种不同， 大豆疫霉菌的寄主范围非常窄，主要侵染大豆，此外仅能侵染羽扇豆属(Lupinus spp.)的 几种植物。大豆疫霉菌侵染大豆，引起幼苗的猝死和成株的根腐，是世界范围内大豆生产的 主要威胁之一。每年给世界范围内的大豆生产造成直接经济损失高达十几亿美元(Tyler， 2007)。该病于1948年首次在美国的印地安那州发现，而后相继在澳大利亚、加拿大、巴西、 阿根廷、日本、意大利、新加坡、俄罗斯、白俄罗斯、乌克兰、哈萨克斯坦、匈牙利、德国、英国、 法国、瑞士、新西兰、埃及、尼日利亚、印度等国家都发现了该病害(Schmitthermer，1985 ； Jee et al.，1998 ；Wrather et al.，2001)。我国 1989 年由沈崇尧和苏彦纯(1991)首次在 东北大豆主产区分离到该病原菌，之后在黑龙江、吉林、北京、山东、安徽、河南、江苏、浙江、 内蒙古、湖北、福建、新疆、四川、天津和贵州(苏彦纯等，1993 ；朱振东等，2003 ；陈庆河等，
2004；王华等，2006 ；徐静静等，2009 ；唐庆华等，2009)等15个省(市区)也相继被报道分 离鉴定到大豆疫霉菌。其中在黑龙江和福建两省发生较为严重，其他省份零星发生，目前仍 是我国重要的对外检疫对象。在植物与卵菌的长期协同进化过程中，卵菌为了成功侵染植物，分泌大量效应分 子(effectors)到植物细胞的不同部位来破坏或延缓植物的防卫反应(Birch et al., 2006 ；Kamoun,2006 ；Vleeshouwers et al. ,2008) 大量研究表明大部分卵菌病害的发生 符合Flor的“基因对基因”假说，因此，与很多植物病原细菌和真菌一样，卵菌中也存在一 类效应分子可以被寄主植物的抗病基因产物(R protein)识别，从而引发强烈的植物免疫 反应进而阻止病害的发生，而编码这类效应分子的基因被称为无毒基因(Avr gene) 0卵菌 分泌的Avr protein与寄主植物的R protein之间的相互作用直接决定着卵菌病害的发 生，因此，围绕Avr基因的研究一直是卵菌病害研究的重点之一。以前，卵菌Avr基因的研 究主要集中在Avr基因的鉴定以及分子标记上，最近，由于疫霉菌基因组序列的公布以及 基因枪等新技术的广泛使用，十多个卵菌Avr基因陆续被克隆。目前，已经克隆到的卵菌 Avr 基因包括来自来Hyaloperonospora arabidopsis 的 ATRlNdwsB 禾日 ATR13 ；自 P. infestans 的 PiAvr3a、PiAvr4、PiAvrblbl 禾口 PiAvrblb2，以及来自 P. sojae 的 PsAvrlb, PsAvrla, PsAvr3a、PsAvr3c禾口PsAvr4/6(Allen et al. ,2004 ；Shan et al. ,2004 ；Armstrong etal.,
2005；Rehmany et al. ,2005 ；van Poppel et al. ,2008 ；Vleeshouwers et al. ,2008 ；Dong etal.，2009 ；Qutob et al.，2009 ；Sang-Keun et al.，2009 ；Dou et al.，2010)。此外这些 Avr基因在基因和基因组结构上的特征、进入植物细胞的转运机理以及在植物病害中具有的毒性功能研究也成为研究热点。从卵菌无毒基因的克隆入手，探索无毒基因的起源和进 化，明确其在病菌致病过程中的功能，了解无毒基因和抗病基因之间的协同进化机理，对于 近一步认识和防治该类病害具有重要意义。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种简便、快速鉴定大豆疫霉无毒基因 PsAvrfb的分子标记、方法及其引物。本发明提供的技术方案是一种通过分子标记鉴定在大豆疫霉菌株中无毒基因 PsAvrfb的引物，其上游引物为SEQ ID NO. 1，下游引物为SEQ ID NO. 2。一种利用所述的引物鉴定大豆疫霉无毒基因PsAvrfb的方法，包括如下步骤提取大豆疫霉基因组DNA ；以大豆疫霉基因组DNA为模板，用权利要求1所述的引物进行扩增；回收扩增片段，用Dra I进行酶切；检测量酶切后的片段大小，若得到大小为1271bp的片段，则表明所述大豆疫霉是 毒性菌株；若得到大小为349bp和928bp的片段，则表明所述大豆疫霉为无毒菌株。 所述大豆疫霉无毒基因PsAvr3b为PsAvh307基因。本发明具有以下有益效果利用本发明所述的引物及方法能够简便、快速鉴定大 豆疫霉菌株是有毒菌株还是无毒菌株。本发明人利用不同毒力的菌株杂交产生Fl代杂合 子，再自交产生F2代。通过致病性测定和候选基因的CAPS标记对F2代表现型和基因型进 行比较，发现PsAvh307的基因型和PsAvr3b的表现型相吻合，从而确定PsAvh307与该无毒 基因为共分离，证明Avh307是无毒基因Avr3b。本发明不仅可以研究该无毒基因在自然群 体中的分布情况，揭示大豆疫霉菌在田间致病型分化变异的特点，而且为克隆该无毒基因 奠定了基础，同时可以对含有大豆疫霉抗病基因Rps3b的大豆抗病品种抗性鉴定提供相关 的借鉴。
图1表明F2中PsAvh307的基因型和PsAvr3b的表现型相吻合。
具体实施例方式下面通过具体实施方式
的详细描述来进一步阐明本发明，但并不是对本发明的限 制，仅仅作示例说明。实施例11、无毒基因的候选基因根据无毒基因可能的基因组结构特征和无毒基因可能的转录特征，将两者结合找 到同时具有多拷贝和在某一侵染阶段高量特异转录的RXLR基因。找到了符合条件的Avh 基因，即PsAvh307。该基因被认为是大豆疫霉无毒基因的最佳候选基因。2、设计CAPS标记根据候选基因在2个菌株R2 (P6497)和R19 (P7076)中核苷酸的序列差异 (PsAvr3b 在 R2 (P6497)菌株中的核苷酸序列见 SEQ ID NO. 3，PsAvr3b 在 R19 (P7076)菌株中的核苷酸序列见SEQ ID NO. 4)，从而产生不同的酶切位点，根据酶切位点的不同设计出 如下候选基因的CAPS标记(见表1)。表1候选无毒基因的CAPS标记
权利要求
一种通过分子标记鉴定在大豆疫霉菌株中无毒基因PsAvr3b的引物，其特征在于上游引物为SEQ ID NO.1，下游引物为SEQ ID NO.2。
2.利用权利要求1所述的引物鉴定大豆疫霉无毒基因PsAvrfb的方法，其特征在于 提取大豆疫霉基因组DNA ；以大豆疫霉基因组DNA为模板，用权利要求1所述的引物进行扩增； 回收扩增片段，用Dra I进行酶切；检测量酶切后的片段大小，若得到大小为1271bp的片段，则表明所述大豆疫霉含有无 毒基因Avrfb ；若得到大小为349bp和928bp的片段，则表明所述大豆疫霉不含有无毒基因 Avr3b。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述大豆疫霉无毒基因PsAvrfb为 PsAvh307 基因。
全文摘要
本发明公开了大豆疫霉菌(Phytophthora sojae)一种无毒基因PsAvr3b特异的分子标记PsAvh307，属于生物技术领域。通过利用CAPS分子标记技术，对大豆疫霉病菌两亲本菌株及杂交后代群体鉴定获得的无毒基因进行分子标记。获得1个与大豆疫霉无毒基因PsAvr3b共分离的分子标记。本发明不仅可以研究该无毒基因在自然群体中的分布情况，揭示大豆疫霉菌在田间致病型分化变异的特点，而且为克隆该无毒基因奠定了基础，同时可以对含有大豆疫霉抗病基因Rps3b的大豆抗病品种抗性鉴定提供相关的借鉴。
文档编号C12Q1/04GK101942520SQ201010506148
公开日2011年1月12日 申请日期2010年10月14日 优先权日2010年10月14日
发明者王源超, 董莎萌, 郑小波, 阴伟晓 申请人:南京农业大学