专利名称：一种镰刀菌单端孢霉烯族b类毒素的分子鉴定方法
技术领域：
本发明属于植物检验检疫技术领域，具体涉及一种镰刀菌单端孢霉烯族B类毒素的分子鉴定方法。
背景技术：
由镰刀菌引起的赤霉病(Fusarium head blight or scab)是世界范围内危害小麦、大麦、玉米等作物的一种重要病害，不仅严重影响作物产量，而且镰刀菌可以产生多种对人畜有毒害作用的单端孢霉烯族毒素，使粮食或饲料的品质降低。镰刀菌毒素稳定性高、不易降解，可随食品、饲料加工过程进入食物链，进而威胁人畜健康。这些毒素可抑制真核生物细胞蛋白质合成，破坏人和动物的免疫系统，中毒后常伴有呕吐、腹泻、 头晕等症状，有的毒素甚至可能致癌。单端孢霉烯族毒素是最重要的镰刀菌毒素，主要包括A、B两类。依据化学结构的不同，B类单端孢霉烯毒素被划分为3-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇(3-acetyIdeoxynivalenol，简称3_AcD0N)、15-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇 (15-acetyldeoxynivalenol，简称 15-AcDON)和雪腐镰刀菌烯醇(nivalenol，简称 NIV)。在我国赤霉病发病区，禾谷镰刀菌(Fusariumgraminearum Schwabe)是产B类单端孢霉烯毒素的主要菌株。我国粮食及饲料中污染B类单端孢霉烯毒素的比例非常高，由于DON和NIV 严重威胁到人类和动物的安全，国内外育种界、病理学界、医学界以及各国政府检验检疫部门均十分重视对这类毒素的检测监控研究。目前，镰刀菌毒素的检测方法主要是化学测定法，但其提取纯化程序费时、复杂， 需要昂贵的仪器设备，且操作过程中毒素样品对操作者有一定的潜在威胁。免疫化学法如酶联免疫吸附法(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA)也用于镰刀菌毒素测定， 主要应用于粮食样品中真菌毒素的检测。由于A、B两类单端孢霉烯族毒素结构相似，在用 ELISA试剂盒进行检测时容易相互干扰，导致测定的结果往往偏高，而且容易出现假阳性。 随着国际贸易中各国之间粮食进出口规模不断扩大，各国口岸加强了对小麦和玉米的出入境管理，检疫实践中急需一种快速、灵敏、准确地检测出进口粮食中是否带有产B类毒素的病原菌或存在这些毒素污染，以判断其是否合格，能否进关。近年来，随着镰刀菌分子生物学研究的快速发展，对单端孢霉烯族毒素的合成、毒素基因表达调控方面已经取得了一些十分有意义的结果，B类毒素生物合成的分子特点逐渐清晰，许多基因及在毒素合成代谢途径中的作用已被证实。因此，基于这些最新的分子生物学研究结果和相关基因序列信息，建立一种简单、快速、低成本地鉴定出这些毒素及其产毒病原菌的方法成为可能。近几年，不同国家的研究人员做了一些有益的尝试。关于B类单端孢霉烯毒素分子鉴定的研究相对较多，Kim等通过Tri5、Tril3和Tri7基因序列信息， 检测分析来自大麦、小麦和棉花的禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)产DON和NIV毒素的情况(Kimet al. Polymorphism of trichothecene biosynthesis genes in deoxyni valenol-andnivalenol-producing Fusarium graminearum isolates. Mycol. Res. ,2003, 107 190-197)，其中Tri5检测法的操作过程涉及到Southern杂交技术，费用较高，很难在实际中大量应用，而且根据Tri5、Tril3和Tri7两种检测方法在三种作物大麦、小麦和棉花中出现了鉴定结果与化学分析检测结果不一致的情况，导致检测结果了出现一定的偏差；Chandler 等通过 Tri7 禾口 Tril3 检测了三禾中,廉刀菌 Fusarium graminearum，Fusarium culmorum 禾口 Fusarium cereali 产生毒素的情况(Chandler et al. Development of PCR assays to Tri7 and Tri13 trichothecene biosynthetic genes，and characterization of chemotypes of Fusarium graminearum，Fusarium culmorum and Fusariumcerealis. Physiol, and Mol. Plant Pathol.，2003，62 :355-367)，应用了 10 对引物进行检测，毒素DON和OTV的特异性片断长度不确定，而且较多的毒素检测结果相互之间不吻合; Li 等(Liet al. Development of a generic PCR detection of deoxynivalenol-and ηivalenol-chemotypes ofFusarium graminearum. FEMS Microbiol.Lett.，2005，243 505-511)利用一对引物分析了中国364个菌株产DON和NIV毒素的情况。以上研究内容只在于区分DON和NIV毒素而忽略了乙酰化的毒素类型3-AcD0N和15_AcD0N。 Chmdler等基于1^7基因建立了特异鉴定3-AcDON毒素的分子鉴定方法(Chmdler et al. Development of PCR assays to Tri7 and Tri13trichothecene biosynthetic genes， and characterization of chemotypes of Fusarium graminearum， Fusarium culmorum and Fusarium cerealis. Physiol, and Mol. Plant Pathol.，2003，62 :355-367)； Jennings等应用7对引物分析了 153个黄色镰刀菌产DON及其乙酰化类型、NIV毒素的情况(Jennings et al. Determination of deoxynivalenol and nivalenol chemotypes of Fusariumculmorum isolates from England and Wales by PCR assay. Plant Pathol., 2004,53 :182-190),该鉴定过程繁琐、费用高。由于存在以上的一些缺限，导致这些方法距离在粮食和食品安全中毒素的检测实际应用相差较远。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术存在的缺限和不足，研制出能够快速准确检测一种镰刀菌单端孢霉烯族B类毒素的分子鉴定方法，以达到准确、快速、低成本的检测出B类 (3-AcD0N、15-AcD0N和NIV)镰刀菌毒素的目的。本发明是这样实现的利用NCBI database中已经公开发表的禾谷镰刀菌的毒素合成基因Trill序列 (http //www, ncbi. nlm. nih. rov/)，设计特异性引物，可分别从产 3_AcD0N、15-AcD0N 和 NIV毒素的禾谷镰刀菌基因组中扩增出大小不同的单一条带。PCR扩增后，产物经过琼脂糖凝胶电泳检测，根据PCR产物带型可直接快速检测出禾谷镰刀菌本身产毒类型，同时可用于田间谷物籽粒中镰刀菌毒素3-AcD0N、15-AcD0N和NIV的检测。具体步骤如下一种产 B 类单端孢霉烯毒素(3-AcD0N)镰刀菌(Fusarium graminearum Schwabe) Trill基因的特异片段，它的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO :1所示，序列全长为334bp。一种产B类单端孢霉烯毒素(15-AcD0N)镰刀菌(Fusarium graminearum ktwabeKrill基因的特异片段，它的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO :2所示，序列全长为 279bp。一种产 B 类单端孢霉烯毒素(NIV)镰刀菌(Fusarium graminearum Schwabe)
4Trill基因的特异片段，它的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO :3所示，序列全长为497bp。用于扩增上述镰刀菌毒素3-AcD0N、15-AcD0N、NIV的DNA特异片段的引物，它们的核苷酸序列如序列表 SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :5、SEQ ID NO 6 和 SEQ ID NO 7 所示。B类单端孢霉烯毒素(3-AcD0N、15-AcDON和NIV)的检测方法(1)分离、纯化禾谷镰刀菌，鉴定后保存；(2)将步骤(1)得到的菌株置于铺有灭菌玻璃纸的PDA平板上25°C、黑暗条件下培养7天，收集的菌丝在液氮中研磨成粉末，用常规CTAB法抽提菌丝DNA ；(3)取0. 5g左右待检测的生物样品在液态氮中磨碎后，用常规CTAB法提取DNA， 用50ulTE溶解，加2ull0mg/ml RNA酶，37°C水浴30min后，用体积比为25 24 1的苯酚氯仿异戊醇溶液纯化DNA，重复沉淀DNA —次，最后再用50ul TE溶解DNA，其中待检测的生物样品是受镰刀菌毒素污染的籽粒、饲料或食品，或是受镰刀菌毒素病菌侵染的植物的植株和组织；(4)用表2中PI、P2、P3、和P4所示的引物一起进行PCR扩增，得到如序列表SEQ ID NO =USEQ IDNO 2和SEQ IDNO 3所示的特异基因片段；(5)用步骤⑵和⑶得到的特异基因片段检测所述的禾谷镰刀菌菌株的产毒类型或/和被测生物材料是否存在所述的毒素3-AcD0N、15-AcD0N、NIV ；镰刀菌毒素3_AcD0N、 15-AcDON和NIV的特异性条带分别为3;34bp、279bp和497bp。上述步骤(4)所说的PCR具体步骤是1)扩增反应体系在20ul PCR反应液中，含有80ng模板DNA，2ullOXPCR缓冲液 (配方20mM Tri-HCl, pH 8. 4,200mM KCl, IOOmM(NH4)2SO4, 20mM MgSO4)，2ull. 25mMdNTPs， 0. 6ul 引物Pl (10 μ Μ)，0· 2ul 引物 Ρ2 (10 μ Μ)，0· 2ul 引物 Ρ3 (10 μ Μ)，0· 2ul 引物 Ρ4(10 μ Μ) 和IU Taq DNA聚合酶；2) PCR 反应条件94°C 4min ；94°C 30s, 58 °C 30s, 72 °C 30s，25 个循环；及终延伸 72 °C 5min ；2)反应完成后，取如1 PCR产物在2. 0%琼脂糖凝胶上电泳，凝胶成像系统中紫外灯下照相，根据扩增产物的大小判定结果。很显然，应用上面的技术方案，本发明可应用于镰刀菌本身毒素的鉴定以及在粮食作物的籽粒、饲料或食品安全中的因潜在的镰刀菌毒素侵染或污染的生物材料或产品的快速检测。本发明的有益的效果禾谷镰刀菌可以产生3-AcDON、15-AcDON和NIV三种B类单端孢霉烯毒素，依据所产毒素的类型禾谷镰刀菌也被划分为3-AcDON型、15-AcDON型和NIV型。通过PCR分子鉴定方法确定某一禾谷镰刀菌菌株产生毒素的类型是研究的热点问题，然而，现有的分子鉴定方法要么操作繁琐、费用高，要么鉴定结果不准确。本发明利用已公布的毒素生物合成关键基因Trill的序列信息，设计了一组多重PCR引物，经一次PCR扩增，就可确定禾谷镰刀菌毒素的类型3-AcDON、15-AcDON或NIV。从附图中的附图2可以看出，经GC/MS化学检测的不同产毒类型的菌丝DNA扩增的PCR产物在2. 0%琼脂糖凝胶上可以清楚的分开，呈3种不同带型，分别为毒素3-AcDON (序列长度为334bp)、15-AcDON (序列长度为279bp)和NIV (序列长度497bp)的特异性带，15个菌株产生毒素经PCR扩增鉴定的结果与GC/MS化学分析法检测菌株本身的产毒类型均完全吻合(表3)。附图3采集的小麦籽粒样品DNA中扩增出于其大小的片段，健康的籽粒因为没有外来菌株的侵染，也就没有相关毒素的累积和污染， 故与阴性空白对照一样，没有出现任何一种毒素的特异性条带。这些都充分说明了本发明具有特异性高、准确度高和灵敏度高的特点。据此，可以用于鉴定某一禾谷镰刀菌的产毒类型，而且能简单快速地检测出粮食、饲料和食品安全中毒素3-AcD0N、15-AcD0N和NIV的污染状况。
SEQ ID NO 1是本发明镰刀菌毒素3_乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇(3_AcD0N)基因片段，序列全长为334bp。SEQ ID NO 2是本发明镰刀菌毒素15-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇(15-AcDON)基因片段，序列全长为279bp。SEQ ID NO :3是本发明镰刀菌毒素雪腐镰刀菌烯醇(NIV)基因片段，序列全长为 497bp。SEQ ID NO :4_7是本发明设计的特异引物序列。图1，是本发明的技术流程图。图2，是本发明中应用特异性PCR法扩增的禾谷镰刀菌DNA产生毒素3-AcDON、 15-AcDON和NIV的片断。泳道M为IOObp的分子量标记；泳道C为阴性空白对照，无模板 DNA ；泳道1 6为产生3-AcD0N毒素的菌株，对应的菌株编号依次为5039，7047，13081， B51046, B51066，7089 ；泳道7 12为产生15-AcDON毒素的菌株，对应的菌株编号依次为 5035，5226,4020, Gan, JYH, SQ ；泳道13 18为产生NIV毒素的菌株，对应的菌株编号依次为:2012,12002，B51059, B51082, M57034, M57046，菌株来源编号见表 1。图3，是应用特异性PCR法检测小麦感染赤霉病籽粒中的毒素3-AcDON、15-AcDON 和NIV的片断。泳道M为IOObp的分子量标记；泳道C为阴性空白对照，无模板DNA ；泳道 1为健康籽粒样品DNA扩增结果；泳道2和3分别为产生3-AcDON毒素的菌株B51046和 B51066感染的籽粒样品DNA扩增的片段；泳道4和5分别为产生15-AcDON毒素的菌株5035 和52 感染的籽粒样品DNA扩增的片段；泳道7、8和9分别为产生NIV毒素的菌株B51059、 12002和B51082感染的籽粒样品DNA扩增的片段。菌株来源编号见表1。
具体实施例方式1.检测用相关菌株的收集从中国不同地区收集的小麦、大麦和玉米赤霉病病穗样品，经过组织分离和单孢纯化培养，经形态标准程序鉴定后，得到的禾谷镰刀菌菌株如表1所示。表1本发明所采用的不同地理来源的产毒素的禾谷镰刀菌菌株
权利要求
1.一种镰刀菌毒素3-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇基因片段，它的核苷酸序列如序列表 SEQ IDNO 1所示，序列全长为334bp。
2.一种镰刀菌毒素15-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇基因片段，它的核苷酸序列如序列表 SEQID NO 2所示，序列全长为279bp。
3.一种镰刀菌毒素雪腐镰刀菌烯醇基因片段，它的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO 3 所示，序列全长为497bp。
4.用于扩增权利要求1、2、3所述的基因片段的引物，其核苷酸序列分别如下所示Pl GACTGCTCATGGAGACGCTG ；P2 TCCTCATGCTCGGTGGACTCG ；P3 :TGGTCCAGTTGTCCGTATT ；P4 :GTAGGTTCCATTGCTTGTTC。
5.一种镰刀菌单端孢霉烯族B类毒素的分子鉴定方法，其步骤包括(1)从被测的生物材料中抽提总DNA，得到DNA样品；(2)用权利要求4中P1、P2、P3和P4所示的引物同时对步骤(1)所述的DNA样品进行 PCR扩增，得到如序列表SEQ ID NO =USEQ ID NO 2禾口 SEQ ID NO :3所示的基因片段;(3)用步骤(2)得到的基因片段，检测所述的生物材料中是否存在所述的镰刀菌单端孢霉烯族B类毒素；其中步骤(2)所述的PCR步骤包括1)扩增反应体系在20ulPCR反应液中，含有约80ng模板DNA，2ul 10XPCR缓冲液， 2ul 1. 25mM dNTPs，0. 6ul 引物 P3 (10 μ Μ)，0. 2ul 引物 P4 (10 μ Μ)，0. 2ul 引物 Ρ5(10μΜ)， 0. 2ul 引物 P6 (10 μ Μ)和 IUTaqDNA 聚合酶；2)PCR反应条件94°C 4min ；94°C 30s, 58°C 30s, 72°C 30s, 25 个循环；最后 72°C延伸 5min ；3)电泳检测反应完成后，取4ulPCR产物在2.0%琼脂糖凝胶上电泳，凝胶成像系统中紫外灯下照相，根据扩增产物的大小判定结果，其中步骤1)所述的缓冲液组成如下20mM Tri-HCl, pH 8. 4,200mM KCl, IOOmM(NH4)2SO4, 20mM MgS04。
6.权利要求5所述的方法在检测镰刀菌毒素中的应用，其中包括在检测谷物籽粒、饲料或食品中的镰刀菌毒素中的应用。
7.权利要求1、2、3所述的基因片段在检测镰刀菌毒素中的应用。
8.权利要求4所述的引物在鉴定镰刀菌产毒类型中的应用，其中包括在在检测谷物籽粒、饲料或食品中的镰刀菌毒素中的应用。
全文摘要
本发明属于植物检验检疫技术领域，具体涉及一种镰刀菌B类毒素的分子检测方法及应用。其特征是，针对单端孢霉烯B类毒素，同过Tri11基因信息设计的一组多重PCR引物，从产3-AcDON、15-AcDON和NIV毒素的禾谷镰刀菌中分离得到334bp、279bp、497bp的特异片段，采用PCR反应，利用琼脂糖凝胶电泳检测产物，直接根据产物片段的大小，即可检测出禾谷镰刀菌产生毒素的类型。本发明可用于谷物、饲料和食品安全中镰刀菌B类毒素的检测。
文档编号C12Q1/04GK102443589SQ20101050609
公开日2012年5月9日 申请日期2010年10月9日 优先权日2010年10月9日
发明者廖玉才, 张静柏, 李和平, 王建华, 黄涛 申请人:华中农业大学