表达羧酸转运蛋白基因的植物表达载体及其在改良苜蓿耐铝性状中的应用的制作方法

专利名称：表达羧酸转运蛋白基因的植物表达载体及其在改良苜蓿耐铝性状中的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于植物基因工程领域，具体涉及一种植物表达载体及其应用，尤其涉及 含有羧酸转运蛋白基因的植物表达载体及其在改良苜蓿耐铝性状中的应用。本发明还涉及 基于该植物表达载体的转基因植物的制备方法。
背景技术：
在全世界80亿公顷可耕地中，酸性土壤占30%左右，50%以上的耕地为潜在的酸 化土壤(von Uexkull and Mutert，1995)。酸性土壤大部分分布在热带和亚热带的发展中 国家，该地区酸性土壤约占世界的60%。就我国目前土地资源情况而言，我国南方处热带和 亚热带地区，酸性土面积约203. 5万km2，占全国总面积的21%。近年由于广泛使用氨肥和 半干旱土壤的长期浇水灌溉，也进一步加剧了耕作土壤的酸化进程。铝在地壳中的含量非 常丰富，当土壤PH小于5. 5时，有毒性的Al3+成为主要形式。因此，在酸性土地中常常伴随 铝毒害，铝毒成为酸性土壤中限制农作物产量的主要因子(Leon V. Kochian，1995)。紫花苜蓿(Medicago Sativa L.)简称苜蓿，是优良的多年生豆科牧草，素有“牧 草之王”的美称，是目前世界上最主要的生饲料作物之一。它不仅营养丰富品质好、产草量 高、适口性好，是家畜的优质饲料；而且其根系发达，根深可达10米以上，可蓄水保土、防风 固沙；此外，苜蓿还可通过根瘤固氮，增加土壤氮素，分解磷酸盐、改善土壤理化性质，起到 肥田作用。苜蓿喜温暖半干旱气候，对铝害较敏感。近年来，随着我国农业结构调整和南方 具有丰富的水热资源，苜蓿种植已大量南移，但长江流域及其以南等广大地区土壤偏酸性， 过多的游离铝和交换性铝离子对苜蓿产生毒害，铝毒成为限制苜蓿在南方酸性土壤中生长 最主要的因子，因而提高紫花苜蓿的对铝害的耐受性是解决苜蓿南移的关键。克服铝毒害的常用方法是通过大量施用石灰，提高土壤PH值，使游离铝沉淀，解 除铝毒害，但施用石灰仅对表层土壤发挥作用，深层土壤仍呈酸性，难以彻底解决土壤酸度 问题，并且在大量酸性土壤中施用石灰既增加农民经济负担，又存在潜在环境问题。相比之 下，培育耐铝毒的苜蓿品种是最为经济有效的方法。植物可通过根系有机酸的分泌来降低铝离子的毒害程度。在铝毒分子生物学方面 的研究中，较多集中于改变植物体内有机酸合成途径相关酶类的活性来获得耐铝的转基因 植物，并已取得成功的例子。如Fuente等将假单胞菌细胞质柠檬酸合酶(CS)基因在烟草 和番木瓜中超量表达，提高了转基因植株的柠檬酸含量并增加了柠檬酸的分泌，从而极大 地提高了烟草和番木瓜对铝的抗性。然而，当Delhaize等对Fuente等研究的同种转基因 系烟草及高效表达假单胞菌35S-CSB蛋白活性达100倍的转基因系烟草重新进行研究，却 没有发现此两种转基因系根系柠檬酸浓度及柠檬酸的分泌与对照相比有所增加，这两种转 基因烟草的抗铝性也没有提高。Koyama等也在拟南芥和胡萝卜细胞内高效表达线粒体柠檬 酸合酶基因，观察到转基因植株体内柠檬酸浓度及体外柠檬酸分泌量均明显增加，分别改 善了转基因拟南芥在缺磷土壤上的生长及转基因胡萝卜细胞在铝-磷酸盐介质中的生长。Tesfaye等通过提高苜蓿根瘤苹果酸脱氢酶(nodule-enhanced MDH, neMDH)活性，使柠檬 酸、草酸、苹果酸、琥珀酸及醋酸盐在苜蓿根系中的浓度和分泌量提高，并使转基因苜蓿的 耐铝性在水培或土培中都得到明显增强。在通过提高植物体内有机酸合成酶基因的表达改 善植物对铝毒的耐受性的同时，也可通过降低植物体内有机酸的分解途径提高植物对铝毒 的耐受性。如Kihara等研究表明，降低胡萝卜细胞内分解柠檬酸基因NADP-异柠檬酸脱氢 酶(NADP-ICDH)的活性，而使此胡萝卜突变体细胞柠檬酸分泌显著增加。说明通过对植物 根系有机酸分泌的影响，可以提高植物对铝毒的耐受能力，将有机酸合成酶基因导入受体 植株可提高紫花苜蓿对酸性土壤的耐受性(Mesfin等，2001，罗小英等，2004)。羧酸转运蛋白(DTC, dicarboxylate-tricarboxylate carrier)参与植物中多种 羧酸的转运，能将线粒体内的三羧酸和二羧酸运输到胞质中，有可能会增加根系有机酸的 分泌，从而提高植物的耐铝能力。本发明人从适应南方酸性土壤环境生长的柑桔类植物中 克隆了编码羧酸转运蛋白基因，并转入饲料作物苜蓿中，得到耐铝形状改良的转基因苜蓿。 迄今为止还未见有通过利用编码羧酸转运蛋白的基因创造耐铝苜蓿品种的报道。

发明内容
本发明的目的是改良植物的耐铝性状，尤其解决苜蓿南移的瓶颈问题。本发明提 供一种表达羧酸转运蛋白基因的植物表达载体，通过构建编码羧酸转运蛋白基因的超量表 达载体，并将其整合到苜蓿基因组中，以改良苜蓿的耐铝性状，提高苜蓿对南方酸性土壤中 铝毒的耐受能力。本发明还提供所述植物表达载体在植物耐铝性状改良中的应用。本发明进一步提供一种含有该植物表达载体的转基因植物的制备方法。根据本发明的一个方面，本发明的植物表达载体至少含有由羧酸转运蛋白基因和 启动子组成的表达羧酸转运蛋白基因的核苷酸，所述核苷酸通过将编码羧酸转运蛋白的基 因与编码启动子的基因可操作地连接而构建。所述羧酸转运蛋白基因可以是由动物、植物或微生物中分离克隆得到的天然基 因，也可以是人工改造或设计的基因。优选地，所述编码羧酸转运蛋白基因为负责将有机 酸从线粒体中转运到胞质中的相关基因；更优选地，所述羧酸转运蛋白基因来源于在酸性 土壤环境中生长较好的香橙(Citrus junos)中的羧酸转运蛋白基因CjDTC^itrus junos Dicarboxylate/Tricarboxylate Carrier)。所述启动子可以是由动物、植物或微生物中分离克隆得到的天然启动子，也可 以是人工改造或设计合成的启动子。优选地，所述启动子为超量表达启动子，更优选为 CaMV35S0优选的植物表达载体具有如图2所示的结构。根据本发明的另一方面，提供一种转化体，将本发明的植物表达载体转染宿主而 获得转化体，该转化体可用于转化植物而获得转基因植物。根据本发明的再一方面，提供本发明的植物载体在苜蓿耐铝性状改良中的应用。 通过在植物体内超量表达羧酸转运蛋白的相关基因，调节植物体内有机酸含量，从而提高 苜蓿对酸性土壤中铝毒的耐受能力。根据本发明的再一方面，提供一种转基因植物的制备方法，将上述转化体转化植物，获得转基因植物。所述方法包括下述步骤1)将羧酸转运蛋白基因与植物超量表达启动子可操作地连接；2)构建含有羧酸转运蛋白基因与植物超量表达启动子的植物表达载体；3)用所述植物表达载体转化宿主，获得转化体；4)用所述转化体转化植物，获得转基因植物。根据该方法制备的转基因植物中有机酸含量增大，可以螯合更多游离的铝离子， 从而改良植物对铝毒的耐受性，尤其可以解决苜蓿在酸性土壤中铝毒害增强的问题。更具 体地，改良苜蓿耐铝性状的方法包括下述步骤1)获得超量表达启动子；2)获得编码羧酸 转运蛋白的相关基因；3)将步骤1)中分离克隆到的启动子与步骤2)中分离克隆到的羧酸 转运蛋白编码基因进行融合，构建超量表达羧酸转运蛋白基因的植物表达载体；4)将步骤 3)得到的植物表达载体整合到苜蓿基因组中；5)将通过步骤4)获得的苜蓿进行进一步的 培养、栽培，获得转基因的苜蓿植株。本发明中，所述的启动子与羧酸转运蛋白编码基因融合以及构建表达载体的方法 是本领域的常规方法，使用的载体可以是植物转基因领域所使用的常规载体。将表达载体 整合到苜蓿的基因组所使用的方法可以是常用的植物转基因方法，例如根癌农杆菌介导法 或基因枪法。本发明中所指的“苜蓿耐铝性状”是指苜蓿对铝毒表现出的耐受能力提高的性状， 包括植株生长状态、根的相对伸长量、有机酸含量、铝含量等。本发明中所指的“转基因苜蓿”是指通过分子生物学、生物技术手段，将其他生物 的基因转移到苜蓿中，从而使其遗传物质得到改造的苜蓿。用于改造的基因可以来源于植 物、动物以及微生物或者人工合成改造。本发明根据植物铝害机制以及有机酸合成转运与耐铝的关系，将来源于适应酸性 土壤生长香橙中的羧酸转运蛋白基因在超量启动子的控制下在苜蓿中表达，创造性地采用 了负责线粒体中羧酸转运的编码基因为主要元件构建新的基因表达载体，并建立起了与之 相适应的改良苜蓿耐铝性状的方法。本发明方法在选定了启动子和目的基因的情况下，本发明的启动子和目的基因融 合成新的基因的方式可以采用本领域常用的方式，并可以将融合成的新的基因转入本领域 常用的载体中构建成表达载体再转入苜蓿中。在使用本发明方法改良苜蓿耐铝性状的过程 中，既可以只在一个部位表达目的基因，也可以在多个部位和多个发育阶段表达，本发明方 法已经提供了技术方案。本发明改良苜蓿耐铝性状的方法，是通过在苜蓿基因组中超量表达羧酸转运蛋白 的相关基因，促进线粒体中所合成有机酸向胞质中的转运，增加苜蓿体内有机酸含量和苜 蓿根际有机酸的分泌量，螯合更多游离的铝离子，从而提高对铝毒的耐受性。试验结果证 明，经本发明改良苜蓿耐铝性状的方法所改良的苜蓿的根伸长量增加、有机酸含量增加、植 株体内铝的含量降低，苜蓿耐铝性状得到明显改良。本发明方法简便易行，效果显著，解决 苜蓿南移的瓶颈问题，为南方畜牧业带来高产、抗逆的饲草饲料新品种，促进畜牧业的发展 而产生巨大的经济效益。


图1 强启动子调控下的羧酸转运蛋白基因表达载体的构建流程图Km，卡那霉素抗性基因；Amp，氨苄青霉素抗性基因；NPTII，新霉素磷酸转移酶基 因；⑶S，β-葡萄糖酸苷酶基因；35S，来源于花椰菜花叶病毒的植物组成性启动子；Pnos， 冠瘿碱合成酶基因启动子；nos，冠瘿碱合成酶基因终止子；LB，T-DNA左边界；RB，T-DNA右 边界。用于构建植物表达载体的骨架载体为PBI121基础上改造的p5载体，具有CaMV 35S 启动子调控下的GUS基因，便于在植物遗传转化的过程中对转化子进行GUS染色的筛选。图2 本发明构建的植物表达载体结构3 转基因苜蓿的组织化学鉴定与分子验证图将经过抗生素筛选后的100多个转化植株进行组织化学鉴定，在此基础上提取苜 蓿基因组DNA，进行PCR扩增验证。结果有12个转化子中有30多个株系扩增呈阳性。图 3A左为转化后在抗生素培养基的筛选，右图为组织化学染色的部分结果。图3B为转基因苜 蓿经PCR扩增验证的部分图片。图4 超量表达CjDTC基因的转基因苜蓿株系CjDTC的定量PCR分析对30多个株系的转基因苜蓿提取RNA，反转录后进行普通RT-PCR表达分析，筛选 出12个独立转化子，32个株系的目的基因表达量都比野生型高。在普通RT-PCR分析基础 上，进行定量PCR分析，筛选出DTC4-4、DTC5-2、DTC9-3、DTC13-4和DTC30-1等表达量高的 转基因株系，在这些株系中，DTC30-1株系的表达量最高，其次是DTC4-4、DTC5-2、DTC3-4和 DTC9-3。其中:wildtype，野生型；DTC4-4、DTC5-2、DTC9-3、DTC13—4 禾口 DTC30-1 为不同转 基因株系。纵坐标代表目的基因相对表达量(18S为内标基因)。图5 转基因苜蓿与野生型株系的有机酸含量的对比分析对上述表达水平高的转基因苜蓿植株，参照TeSfaye(2001)方法提取植株体 内有机酸，在HPLC上进行分析，结果显示转基因苜蓿植株中苹果酸含量均比野生型 高，DTC9-3，DTC13-4，DTC30-1等三个转基因株系的苹果酸含量增加最为明显。其中 wildtype，野生型；DTC4-4、DTC5-2、DTC9-3、DTC13-4 和 DTC30-1 为不同转基因株系。纵坐 标代表苹果酸含量(mg/g · Fff)图6和图7 转基因苜蓿与野生型株系的耐铝实验的对比分析图6为转基因苜蓿与野生型株系的根伸长量测定结果。收取转基因苜蓿种子在 无菌条件下萌发、生长5d后，将组织化学鉴定为阳性的幼苗置于Al3+浓度为50 μ mol/L的 MSB(pH4. 3)培养皿中竖直培养，处理2d后统计各株系根的相对伸长量。从统计数据结果可 以看出，转基因苜蓿根的相对伸长量均比野生型大，表明在铝胁迫处理环境中，转基因苜蓿 对铝毒的耐受能力得到提高。其中wildtype，野生型；DTC4-4、DTC5-2、DTC9-3、和DTC13-4 为不同转基因株系；纵坐标代表根相对伸长量(％ )。图7为超量表达CjDTC的转基因苜蓿与野生型株系在铝胁迫后根生长情况及根相 对伸长量统计结果。将生长5d的T1代苜蓿幼苗置于pH4. 3、浓度为50um Al3+的MSB培养 皿中竖直培养，2d后统计各株系根的相对伸长量。根相对伸长量=(铝处理的根伸长量/ 无铝处理的根伸长量)X 100%。其中A，野生型苜蓿未加铝处理；B，野生型苜蓿加铝处理； C，转基因苜蓿未加铝处理；D，转基因苜蓿加铝处理。图8 转基因苜蓿与野生型株系在铝胁迫处理与非处理后的伤害检测
转基因苜蓿与野生型株在胁迫后取根尖部分在Aniline blue fluorochrome染液 中染色进行荧光观察，可以见到染料结合愈创葡聚糖产生荧光。从染色结果来看，野生型与 转基因苜蓿在受到铝毒胁迫后，根尖都有荧光产生，均比未处理根尖的荧光强。在转基因株 系与野生型之间，转基因苜蓿植株根尖产生的荧光比野生型弱，表明转基因植株根尖积累 的愈创葡聚糖比野生型少，其受到铝毒伤害的程度比野生型轻。WT表示野生型苜蓿根尖， DTC表示转基因苜蓿根尖，-Al表示未加铝处理，+Al表示加铝处理。
具体实施例方式以下结合附图对本发明进行进一步的详细说明，但以下说明并不对本发明进行限 定，任何对本发明的变形和改变，只要不脱离本发明的精神，均属于本发明所附权利要求所 定义的范围。本发明实施例中的试剂药品未做具体说明的均为普通市售，材料方法未做具体说 明的均参考《分子克隆实验指南》(Sambrook和Russell，2001)。实施例一苜蓿基因组的制备1、DNA 的提取选取苜蓿幼叶0.5 lg，在液氮中迅速研磨成粉，加入3mL 65°C预热的CTAB提取 液(100mmol/L Tris-HCl (pH8. 0), 20mmol/L EDTA(ρΗ8· 0)，1. 5mol/L NaCl,2%CTAB (ff/V), 4% PVP40 (ff/V)和2%巯基乙醇(V/V)，PVP和巯基乙醇使用前加入)，快速振荡混勻。65°C 水浴30min，然后加入ImL 5mol/L KAc，冰浴20min后，用等体积的氯仿异戊醇(24 1) 抽提1次(10，000r/min，4°C离心5min)，取上清，加入2/3倍体积的-20°C预冷异丙醇， 混勻，静置约30min，用玻棒挑出絮状沉淀，用75%的乙醇反复漂洗数次，再用无水乙醇漂 洗1次，吹干，重悬于500 μ L TE中。加入IyL RNaseA (10mg/ml)，37°C处理lh。再用酚 (ρΗ8· 0)氯仿异戊醇(25 24 1)和氯仿异戊醇(24 1)各抽提1次(10，OOOr/ min，4°C离心5min)，取上清，乙醇沉淀。沉淀用75 %的乙醇漂洗，风干，溶于200 μ L TE 中，-20°C保存备用。2、RNA 的提取选取约0. 5 Ig新鲜苜蓿叶片材料，在液氮中迅速磨成精细粉末，装入IOmL 离心管，加入 5mL 65 "C 预热的 RNA 提取液(2 % CTAB (W/V), 2 % PVP (W/V)，IOOmmol/L Tris-HCl (pH8. 0) ,0. 5g/L Spermidine, 2. 0mol/L NaCl，2%巯基乙醇(V/V，使用前加入))， 颠倒混勻。65°C水浴 3min，期间混勻2 3次。氯仿异戊醇(24 1)抽提2次(10, OOOr/ min，室温，5min)。取上清，加入1/4体积lOmol/L LiCl溶液，4°C放置6h，以氯仿异戊醇 (25 24 1)各抽提1次(10，000r/min，室温，5min)。加2倍体积的无水乙醇，在_70°C 冰箱沉淀30min以上。12，000r/min，4°C离心20min，弃上清。沉淀用200 μ L的DEPC处 理水溶解。酚(ΡΗ4. 5)氯仿异戊醇(25 24 1)、氯仿异戊醇(24 1)各抽提1 次(10，000r/min,室温，5min)。加1/10体积3mol/L NaAc溶液和2. 5倍体积的无水乙醇， 在-70°C冰箱沉淀30min以上。12，000r/min，4°C离心20min，弃上清。沉淀用70%的酒精 漂洗一次，风干。加20μ L的DEPC处理水溶解。用非变性琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度 计扫描检测RNA的质量。3、基因组序列的PCR扩增
IOXEx PCR buffer (Mg2+free)2. 5 μ L2. 5mmol/L dNTPs2μ L25mmol/L MgCl22μ L引物 l(5ymol/L)1 μ L弓丨物 2(5ymol/L)1 μ LEx Taq DNA 聚合酶IU基因组DNA约 60ng_25 μ L的扩增体系扩增程序为94°C，5min;94°C，30sec，57°C，30sec，72°C，1. 5min，35 个循环；72°C 延伸lOmin。实施例二表达羧酸转运蛋白基因的核苷酸和植物表达载体的制备将含有CjDTC编码基因序列的pUC-CjDTC克隆载体和植物表达载体p5 ( 500ng) 的细菌菌株在5mL LB液体培养基(含相应抗生素)中，37°C振荡培养12 16小时。载体 构建流程见图1。构建的植物表达载体结构如图2所示，其包括表达羧酸转运蛋白基因的核 苷酸(SEQ ID NO. 1)以及表达筛选所需的各元件。pUC-CjDTC为含有目的基因的普通克隆 载体，P5是用于构建植物表达载体的骨架载体为PBI121基础上改造的p5载体，具有CaMV 35S启动子调控下的GUS基因，便于在植物遗传转化的过程中对转化子进行GUS染色的筛 选。用质粒DNA提取试剂盒(Omega公司产品)提取其质粒DNA，电泳检测DNA质量。取质 粒 pUC-CjDTC ( 3OOng)和 p5 ( 500ng) DNA,经 XbaI 和 SmaI (Roche 公司产品)在酶切 Buffer A中，置于37°C水浴2小时。在1. 0%的琼脂糖凝胶上，100V电压电泳10 20分 钟，按如下方法回收、连接和转化。长度在2. Okb以下的片段采用离心法回收。紫外灯下，用洁净的刀片切下含有目 的片段的琼脂糖凝胶块。用5号缝衣针在0. 5mL的离心管底部钻一小孔并填入大小合适 的玻璃棉。将含有目的片段的琼脂糖块放入填有玻璃棉的0. 5mL离心管中，液N2速冻，将 速冻的0. 5mL离心管套入到一 1. 5mL的离心管中，13，000r/min离心3min。向流出液(含 DNA)中加入1/10倍体积的3mol/LNaAc (pH5. 2)，3倍体积的无水乙醇，混勻后于_70°C放置 30min。13，000r/min、4°C离心15min收集DNA沉淀，用预冷的75%的乙醇洗涤沉淀。室温 干燥，用适量的TE溶解沉淀即得到目的片段。p5载体回收用GE公司产品进行回收。回收 片段在琼脂糖凝胶上电泳定量。回收的片段与P5载体建立如下连接体系10 X T4DNA 连接缓冲液 1 μ Lρ5 载体 DNA 片段50 IOOng外源连接产物DNA片段 50ngT4DNA 连接酶1 μ L_用双蒸水补足体积至10 μ L的连接体系载体DNA片段与外源连接产物DNA片段摩尔比为1 3，16°C连接12h。之后将连 接产物转化大肠杆菌DH5 α。实施例三转化体和转基因植物的制备
8
1、用电激法将构建的植物表达载体质粒导入农杆菌LBA4404参考Bio-RAD MicroPulser用户说明书，将上述载体通过电激转化法导入农杆菌 LBA4404。2、超量表达CjDTC基因的载体整合到苜蓿基因组通过根癌农杆菌介导的方法进行苜蓿的遗传转化。表1根癌农杆菌介导的苜蓿遗传转化用培养基配方
权利要求
一种表达羧酸转运蛋白基因的植物表达载体，其至少含有由羧酸转运蛋白基因和启动子组成的表达羧酸转运蛋白基因的核苷酸。
2.权利要求1所述的植物表达载体，其特征在于，所述植物表达载体具有如图2所示的 结构。
3.一种转化体，以权利要求1所述的植物表达载体转化宿主获得。
4.权利要求1-3任一项所述的植物表达载体在苜蓿耐铝性状改良中的应用。
5.一种含有权利要求1所述的植物表达载体的转基因植物的制备方法，包括下述步骤1)将羧酸转运蛋白基因与植物超量表达启动子可操作地连接；2)构建含有羧酸转运蛋白基因与植物超量表达启动子的植物表达载体；3)用所述植物表达载体转化宿主，获得转化体；4)用所述转化体转化植物，获得转基因植物。
全文摘要
本发明公开了一种改良苜蓿耐铝性状的方法，通过将超量表达启动子调控下的羧酸转运蛋白基因整合到苜蓿基因组中，实现羧酸转运蛋白基因在苜蓿中的超量表达，得到转基因苜蓿。该方法显著增加苜蓿中有机酸的含量，铝胁迫下转基因苜蓿根相对伸长量大于野生型对照，其根尖受到的伤害比野生型小，植株累积的铝含量低，苜蓿耐铝性状得到明显改良。
文档编号C12N15/82GK101993891SQ201010506110
公开日2011年3月30日 申请日期2010年12月20日 优先权日2010年12月20日
发明者侯磊, 张觅, 李德谋, 白文钦, 罗小英, 裴炎, 邓伟, 陈佐友 申请人:西南大学