专利名称：一种检测x染色体失活的双重pcr分子诊断试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物化学领域，具体涉及核酸的检测试剂。
背景技术：
现代分子生物学研究表明，雌性哺乳动物体细胞内仅有一条X染色体是有活性 的，另一条X染色体大部分失活。对于一个细胞来说，失活的染色体可能是父源的，也可 能是母源的，是随机的。对于一个个体来说，父源X染色体和母源X染色体失活比例接 近1 1。当这个比例偏离1 1时，称为X染色体失活偏移(shewed X-chromosome inactivation, SXCI)。由于X染色体失活的随机性，使得女性体内的部分细胞群带有母源 的X染色体，而另外部分细胞群带有父源的X染色体，其表型取决于体内两种细胞群的比 例。高比例的优势细胞群将表现出表型优势。因此相同的基因型的X染色体连锁女性杂合 子出现表型的差异。目前X染色体失活多用于X染色体连锁疾病的研究，如血友病、DMD(进 行性肌营养不良)、X染色体连锁智力低下等，X染色体失活的具体类型是上述疾病病因诊 断的重要指标。对X染色体失活的检测原理是基于女性体细胞组织的X染色体嵌合性和X染色体 基因多态性进行的。多态性表现为X染色体上的STR(short tandem r印eat，短串联重复) 的重复次数不同。嵌合性表现为在一个女性体内部分细胞群母源X染色体有活性，部分细 胞群父源X染色体有活性的。依据X染色体嵌合性的特点，X染色体可以区分为失活的X 染色体和有活性的染色体。其检测方法主要有表达方法和甲基化方法两种。表达方法是用 RT-PCR的方法仅使表达的XIST基因反转录成cDNA，然后用PCR扩增反转录DNA。表达方法 需进行反转录操作，过程烦琐、对技术人员要求较高。甲基化方法主要是利用失活的X染色 体为甲基化的，而有活性的X染色体是非甲基化的；用甲基化敏感性限制性内切酶对基因 组DNA进行消化后，有活性的X染色体由于酶切位点处于非甲基化状态而被消化成短的片 段，PCR扩增时没有产物；而失活的X染色体由于酶切位点处于甲基化状态而不被切断，可 扩增出STR片段，然后通过聚丙烯酰胺凝胶电泳对酶切前后的PCR产物进行检测，判断出两 条X染色体的失活比例。聚丙烯酰胺凝胶电泳法费时费力，不适用于临床推广。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种检测X染色体失活的双重PCR分子诊断试剂 盒，该试剂盒具有成本低和检测方法简便、快速的优点。本发明解决上述问题的技术方案具体是一种检测X染色体失活的双重PCR分子诊断试剂盒，该试剂盒由甲基化敏感性限 制性内切酶、一对扩增AR基因第一外显子的一个CAG三碱基STR位点的引物、一对扩增 MIC2基因的引物和DNA聚合酶组成，其特征在于所述的扩增AR基因第一外显子的一个CAG三碱基STR位点的引物的序列为 GCCGCCGTCCAAGACCTACC 或者 TGGGGAGAACCATCCTCACC ；
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所述的扩增MIC2基因的引物的序列为AGA GGTGCGTCCGATTCTT或者 CGCCGCAGATGGACAATTT。本发明所述的AR基因是指human androgen rec印tor，雄激素受体基因，位于X染 色体 qll-12。本发明所述的MIC2基因是指位于X和Y染色体短臂末端的MIC2基因。本发明所述的两对引物可以由本领域常用的方法合成。本发明所述的两对引物均 由上海英骏生物技术有限公司合成提供。本发明所述的检测X染色体失活的双重PCR分子诊断试剂盒中，甲基化敏感性 限制性内切酶为本领域常用的甲基化敏感性限制性内切酶，可以是美国Promega公司的 HpaII限制性内切酶。本发明所述的检测X染色体失活的双重PCR分子诊断试剂盒中，DNA聚合酶为本 领域常用的DNA聚合酶，可以是Taq酶。本发明所述的检测X染色体失活的双重PCR分子诊断试剂盒，还可以包括甲基化 敏感性限制性内切酶消化反应液。本发明所述的甲基化敏感性限制性内切酶消化反应液是 本领域常用的消化反应液。本发明所述的检测X染色体失活的双重PCR分子诊断试剂盒，还可以包括PCR扩 增反应液。本发明所述的PCR扩增反应可以是本领域常用的PCR扩增反应液。本发明所述的试剂盒设计跨越甲基化敏感性酶切位点的STR扩增引物，应用甲基 化敏感性限制性内切酶消化DNA标本后进行PCR扩增，有活性的X染色体由于酶切位点处 于非甲基化状态而被切断，无扩增产物；而失活的X染色体由于酶切位点处于甲基化状态 而不被切断，可扩增出STR片段，然后通过DHPLC(denaturing high performance liquid chromatography,变性高效液相色谱)对酶切前后的PCR产物进行检测，判断出两条X染色 体的失活比例。本发明所述的两对引物所对应靶基因的具体情况如下所述1.STR位点目的基因，为CAG三碱基重复，重复次数8-31次。选用的限制性内 切酶Hpall，识别序列及裂解位点为5' . . . C/CGG. . . 3'，不能识别经甲基化修饰的基因序 列，即失活的X染色体将扩增出200-300bp的产物，而活性的X染色体被HpaII切断而无扩 增产物。所述STR位点基因如
图1所示。2.MIC2基因位点作为内参基因用于报告酶切效果。在酶切的过程中，若酶切不 完全，则可能导致假阳性的结果。为了确保酶切效果，予以加入MIC2基因作为内参基因。 MIC2基因上的HTF(Hpall tiny fragment)岛包含了 3个HpaII酶切位点，并且无论其位 于失活与否的X染色体或Y染色体上，HTF岛均始终保持非甲基化状态。因此当酶切不完 全时，则将会出现MIC2基因(位于X和Y染色体短臂的末端)的扩增片段长度375bp的产 物。所述MIC2基因位点如图2所示。本发明所述的试剂盒的使用方法为1.对女性标本进行基因组DNA抽提后获得DNA样本。2.使用甲基化敏感性限制性内切酶HpaII消化步骤1获得的DNA样本，反应条件 为37°C过夜消化。3.采用本发明所述的双重PCR引物对酶切前后的DNA进行PCR扩增，其中双重PCR
4扩增条件为95°C预变性5min，94°C 30s, 62°C 45s, 72°C 45s，共28个循环，最后72°C延伸 7min，4°C 保存。4.在50°C下，使用DHPLC仪对PCR产物进行分析，得到DHPLC图谱。5.对DHPLC图谱进行分析，方法如下首先，根据图谱上峰的迁移时间确定DHPLC 图谱中每一个峰所对应的基因；然后，分析DHPLC图谱中MIC2基因酶切前后的PCR产物所 对应的峰；最后，判读X染色体失活情况和对自然流产进行家系分析；其中，对X染色体失活情况进行判读的方法由下列步骤组成通过分析AR位点酶切前后的扩增产物判断X染色体失活情况，若AR位点为单峰， 说明该STR位点为纯合子，无法判断X染色体失活是否正常，当AR为双峰时，根据公式(dl/ ul)/(dl/ul+d2/u2)计算失活比例；所述公式中，dl表示酶切后较高的峰的峰高，ul表示与 之相对应的酶切前的峰的峰高，d2表示酶切后较矮的峰的峰高，u2表示与d2相对应的酶切 前的峰的峰高。其中，对自然流产进行家系分析的方法由下列步骤组成将家系中绕毛、母亲、父亲标本PCR产物检测所得DHPLC图谱排布在同一界面，纵 向比较，在同一位置所出峰片段长度相同。通过家系比对，可以判断两个X染色体的来源 (父源或母源)，从遗传上追踪异常染色体的传递途径。本发明所述的试剂盒的使用方法中女性标本是指经G带核型分析，结果显示具有 两个X、没有Y染色体的标本。本发明所述的试剂盒的使用方法中，女性标本是任何来源的 女性器官组织或体细胞，可以是女性的外周血、脐带血、绒毛、骨髓或上皮细胞等。本发明所述的试剂盒的使用方法步骤2中，使用甲基化敏感性限制性内切酶 HpaII消化的反应体系采用本领域常用的反应体系。本发明所述的试剂盒的使用方法，步骤 2中，使用甲基化敏感性限制性内切酶HpaII消化的反应体系可以如表1所示。表IHpaII消化的反应体系
权利要求
一种检测X染色体失活的双重PCR分子诊断试剂盒，该试剂盒由甲基化敏感性限制性内切酶、一对扩增AR基因第一外显子的一个CAG三碱基STR位点的引物、一对扩增MIC2基因的引物和DNA聚合酶组成，其特征在于所述的扩增AR基因第一外显子的一个CAG三碱基STR位点的引物的序列为GCCGCCGTCCAAGACCTACC或者TGGGGAGAACCATCCTCACC；所述的扩增MIC2基因的引物的序列为AGA GGTGCGTCCGATTCTT或者CGCCGCAGATGGACAATTT。
全文摘要
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种检测X染色体失活的双重PCR分子诊断试剂盒，该试剂盒由甲基化敏感性限制性内切酶、一对扩增AR基因第一外显子的一个CAG三碱基STR位点的引物、一对扩增MIC2基因的引物和DNA聚合酶组成。采用本试剂盒诊断和家系分析，可判断异常X染色体的来源。本试剂盒含有双重PCR引物进行扩增，扩增条件稳定、特异、灵敏。
文档编号C12N15/11GK101962680SQ201010506300
公开日2011年2月2日 申请日期2010年10月13日 优先权日2010年10月13日
发明者刘丽娟, 曾嵘 申请人:南方医科大学