专利名称：一种牛肉嫩度选择的分子检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明属于检测试剂盒领域，具体涉及一种牛肉嫩度选择的分子检测试剂盒和牛 CAPNl基因的特异性引物。
背景技术：
嫩度是肉的主要使用品质之一，它是消费者评判肉质优劣的最常用指标。当前对 肉嫩度的主观评定主要根据其柔软性、易碎性和可咽性来判定。对肉的客观评定是借助于 仪器来衡量切断力、穿透力、咬力、剁碎力、压缩力、弹力和拉力等指标，而最通用的是切断 力，又称剪切力(shear force).即用一定钝度的刀切断一定粗细的肉所需的力量，以kg为 单位。但如对这一指标检测，则需要屠宰相关肉牛进行取样，无法达到育肥前筛选留用的目 的。所以常规检测仅用于屠宰后肉质检测目的，不能用于育肥前筛选。国外已有数种同类 分子检测试剂盒，但其所依据的靶位点不完全适用中国本土肉牛或杂交牛。
发明内容
为解决当前对肉牛嫩度进行育肥前筛选的难题，本分子检测试剂盒的研发是依据 分子遗传学研究的成果。我们以中国黄牛特异性基因位点为基础设计2对特异性引物，采 用标准化PCR-SSCP方法以及相对严格的PCR反应体系进行样品的PCR扩增与电泳，并根据 电泳结果进行阳性判定。我们以中国黄牛特异性基因位点(XAPN1基因Pl和P2位点)为基础设计2对特异 性引物，进行商业序列合成；采用标准化PCR-SSCP方法以及相对严格的PCR反应体系进 行样品的PCR扩增与电泳，并根据电泳结果进行阳性判定。本分子检测试剂盒包含有已设 计合成的2对特异性引物，以及PCR-SSCP相关所有试剂。实验者可以根据我们调试好的反 应条件进行实验，并观察判定结果。本发明所说的黄牛以/W/基因的两对特异性引物，是 第一对P1F: 5，-CAATCTCCCCGACGAGGT-3，(SEQ ID NO. 1)， P1R5‘ -CCGGGTGATCCAGGTAAACAG-3‘ (SEQ ID NO. 2), 第二对P2F: 5，-TGACTTTGTGCTGCGTTTCT-3，(SEQ ID NO. 3)， P2R:5，- AGACCAAGACACAGGACACCC-3，(SEQ ID NO. 4)。本发明还公开了一种牛肉嫩度选择的分子检测试剂盒，该试剂盒包括上述两对特 异性引物和PCR-SSCP试剂。本分子检测试剂盒可用于肉牛引入育肥前进行针对牛肉嫩度的遗传标记筛选，仅 通过采集耳组织或少量血液，用于提取基因组DNA，经过分子检测试剂盒检测，阳性牛的肉 质嫩度比阴性牛平均提高15% (以剪切力衡量)。自耳组织或血样送检起，2天内可获得结 果，每件样品检测费用仅需50元左右，若大批量同时检测，成本低至20元左右。
图1是Pl位点扩增产物SSCP图谱。图2是P2位点扩增产物SSCP图谱。
具体实施例方式本分子检测试剂盒包含有已设计合成的2对特异性引物，以及PCR-SSCP相关所有 试剂(包括10Xbuffer、25 mmol/L Mg2+、dNTP和Taq DNA聚合酶)，以及各类基因型对应的 条带比对图一份(如图1和图2)；所说的两对特异性引物是
PlF: 5’ -CAATCTCCCCGACGAGGT-3，，
P1R5，-CCGGGTGATCCAGGTAAACAG-3’
上述Pl位点引物的PCR扩增片段大小为244bp ；
P2F: 5， -TGACTTTGTGCTGCGTTTCT-3，，
P2R:5’ - AGACCAAGACACAGGACACCC-3，，
上述P2位点引物的PCR扩增片段大小为247bp。实验者可以根据以下调试好的反应条件进行实验，并观察判定结果。PCR 反应体系如下总体积 20 μ L, IOXbuffer 2.0 μ L,25 mmol/L Mg2+ 1.5 μ L, dNTP (10 mmol/L) 0.5 μ L，Taq DNA 聚合酶(5 U/ μ L) 0.3yL，上下游引物各(10 pmol/ μ L) 1. 0 μ L,模板 DNA (100 ng/ μ L) 1. 0 μ L，ddH20 12. 7 μ L。PCR 反应程序为 94°C预变性5 min，94°C变性40 s, 58°C复性40 s, 72°C延伸1 min，30个循环，最后72°C 延伸10 min, 4°C保存。取PCR扩增产物2yL于灭菌离心管中，加入IOyL变性上样缓冲液 (95 %去离子甲酰胺、10 mmol/L EDTA(ρΗ 8. 0)、0· 25 %二甲苯青FF、0. 25 %溴酚蓝)，98°C 变性10 min后，冰浴IOmin以上，直至上样时取出。电泳采用10%的Acr_bis (29 1)聚 丙烯酰胺凝胶，120V过夜，电泳结束后凝胶银染。利用本分子检测试剂盒的Pl和P2引物，对扩增产物SSCP分析结果如图1和图2 所示。根据电泳条带带型，将TT+GG的个体记录为阳性个体。实施例一检测实例
根据实施方法，应用本发明试剂盒对中国西门塔尔牛中114头实行检测，阳性牛为12 头，占10.5%。验证实验过程和数据见表1。其中GGTT基因型阳性个体剪切力值比其它基 因型的平均剪切力值小15. 2%，即阳性牛肉质嫩度比阴性牛提高15. 2%。
权利要求
黄牛CAPN1基因的两对特异性引物，是第一对P1F: 5’ CAATCTCCCCGACGAGGT 3’,P1R:5’ CCGGGTGATCCAGGTAAACAG 3’,第二对P2F: 5’ TGACTTTGTGCTGCGTTTCT 3’ ，P2R:5’ AGACCAAGACACAGGACACCC 3’。
2.一种牛肉嫩度选择的分子检测试剂盒，其特征在于包括权利要求1所述的两对特异 性引物和PCR-SSCP试剂。
全文摘要
本发明属于检测试剂盒领域，具体涉及一种牛肉嫩度选择的分子检测试剂盒和牛CAPN1基因的特异性引物。所说的牛CAPN1基因特异性引物，第一对的序列如SEQIDNO.1-2所示,第二对的序列如SEQIDNO.3-4所示。本发明还公开了包括上述两对引物和PCR-SSCP试剂的牛肉嫩度选择的分子检测试剂盒。应用本发明的牛肉嫩度选择的分子检测试剂盒进行检测，具有快速、高效、成本低的优点。
文档编号C12N15/11GK101935655SQ201010506858
公开日2011年1月5日 申请日期2010年10月14日 优先权日2010年10月14日
发明者冀德君, 施雪奎, 杨章平, 武秀香, 毛永江 申请人:扬州大学