无 RNA酶的水对RNA进行溶解。
[0084] 2.3片段化反应验证(2h):
[008引用质量浓度为1.5%的琼脂糖凝胶，对上述片段化后得到的RNA O.Siig进行电泳检 ，在120V的电压下电泳30min后进行检测，检测结果见图1，其中1表示现有方法所得到片 段的检测大小，2表示本发明改进后的片段化流程所得片段的检测大小。从图1可W看出，相 比现有方法所得片段，改进后的片段化的RNA长度相对较长，且符合预期大小，主要集中在 150nt。
[0086] 3.免疫沉淀（IP)(约需要化）
[0087] 在进行IP之前，留取部分片段化后的RNA作为上样量的定量（i叩Ut,记为上样文 库），用来做RNA-seq的对照，上样文库用来与甲基化富集后的文库做比对。
[008引3.1抗体解育
[0089] 按照表5所示的抗体捕获体系配制如下反应(其中一管不加 Hi6A特异性抗体，作为 只有磁珠的对照），然后在旋转混匀仪上解育化，4°C。
[0090] 表5:
[0092] 上表5中，RNasin代表RNA酶抑制剂;RVC代表氧饥核巧复合物。
[0093] 3.2蛋白A磁珠的预封闭
[0094] 为去除背景的影响，样品解育的同时对蛋白A磁珠用BSA进行预封闭（preblock)， 预封闭方法为：取200化蛋白A磁珠(含BSA 0.5mg/ml)，用Iml IP缓冲液（IX，含BSA 0.5mg/ ml)重悬，颠倒混匀化。将磁珠等量分到1.7ml离屯、管中，然后对离屯、管进行瞬时离屯、，弃离 屯、后所得上清，用IP缓冲液(IX)洗涂磁珠两次，每次0.5ml。弃上清。
[0095] 注：（I)IP缓冲液中应加入R化Sin和RVC。（2)磁珠的使用量已经过量，若再增加使 用量，背景也会增加。
[0096] 3.3免疫沉淀
[0097] 将上述解育好的样品（力化6A特异性抗体和不加加 Hi6A特异性抗体只加磁珠的对照） 转移到含磁珠的1.7ml离屯、管中，于4°C颠倒混匀化。
[009引 3.4收集
[0099] 将反应液瞬时离屯、，吸去上清，用Iml IP缓冲液（IX)洗涂磁珠=次，吸去上清。
[0100] 4.洗脱（2.5h):
[0101] 4.1向离屯、后的磁珠中加入300化含蛋白酶K的洗脱液50°C解育化。
[0102] 4.2瞬时离屯、，吸取上清并将上清(含有洗脱的RNA片段)置于新的离屯、管中。
[0103] 4.3对新的离屯、管所洗脱的上清进行化izol和氯仿抽提，向RNA上清中加入2倍体 积的Trizoiw及0.4倍体积的氯仿进行抽提。
[0104] 4.4向化izol和氯仿抽提后的上清中加入1/10体积的3M醋酸钢(pH 5.2)和2.5倍 体积的无水乙醇。混匀后置于-80°C，沉淀过夜或更长时间。
[0105] 4.5将沉淀后的RNA于4 °C条件下W15，OOOg的转速离屯、25min，然后弃上清，用Iml 体积浓度为75%的乙醇洗涂沉淀(此时沉淀是不可见的），然后再于4°C下，Wl5,000g的转 速离屯、15min。
[0106] 4.6小屯、吸走上清，使离屯、管沉淀自然干燥，然后再用ISiiL无 RNA酶水重悬沉淀。
[0107] 二、RNA文库构建 [010 引 1. CDNA 合成
[0109] 参考NEBNe对吸UltraTMRNA文库构建试剂盒化7530L，肥B)的说明书，对上样量 (input)、只有磁珠的对照(control)和免疫沉淀组（IP)共S组样品进行CDNA的合成。
[0110] 理论上只有磁珠的对照（bead-only control)样品不会产生文库，可W使用 Agilent Technologies 2100生物分析仪进行验证。该步骤中只有磁珠的对照可W只做 2100检测，不建库。
[0111] 1.1按照下表6的逆转录体系，在冰上配置逆转录反应体系。
[0112] 表6:
[0114] 1.2将PCR管放在PCR仪中，于72°C解育2min(不用热盖)后，取出PCR管并立即放于 冰上，冰浴时间大于Imin。
[0115] 1.3冰上继续向PCR管中加入下表7所列试剂。
[0116] 表7:
[0118] 简单满旋混匀溶液后离屯、收集溶液至管底。
[0119] 1.4接着，按照表8所示PCR程序如下（不用热盖)进行反应。
[0120] 表8:
[0122] 1.5冰上继续向PCR管中加入表9所示第二链反应试剂。
[0123] 表9:
[0125] ~简单满旋混匀溶液后离屯、收集溶液至管底，并置于16°C解育化。
[0126] 2.CDNA 纯化
[0127] 2.1满旋混匀AMPure XP磁珠，室溫解育SOmin备用。
[0128] 2.2按样品数准备好干净的1.5ml离屯、管，加入90化（1.8X)重悬好的AMPure XP磁 珠，并将对应的编号写好。将上一步的CDNA加入准备好的XP磁珠内，并用枪头混匀。室溫解 育5min。
[0129] 2.3如管壁上有液体可瞬时离屯、，置于磁力架上，静置5min。待溶液清亮后，用枪头 小屯、吸取丢弃上清液。
[0130] 2.4加入2(K)化体积浓度为80 %的乙醇漂洗，于磁力架上静置30 s。用枪头小屯、吸取 丢弃上清液。注:80%乙醇使用无核酸酶的水配制。
[0131] 2.5重复步骤2.4-次。最后使用IOiiL枪头吸净离屯、管底部残留的液体。
[0132] 2.6室溫干燥一段时间，使乙醇尽量挥发干净。
[0133] 2.7加入5祉L无核酸酶的水，枪头吹吸混匀，瞬时离屯、，置于磁力架上，静置5min。 准备PCR管，并将编号写好。用枪头小屯、吸取56iiL上清液到准备好的PCR管内。
[0134] 3.末端修复加 A
[0135] 3.1在PCR管中配制如下表10所示的修复反应体系，混匀。
[0136] 表10;
[0138] 按照表11所示的PCR程序进行末端修复反应(不用热盖）。
[0139] 表11;
[0141] 3.2修复反应结束后，按下表12所示的接头连接体系向PCR管中继续加入下列试 剂。
[0142] 表12:
[0144] 轻柔混匀，瞬时离屯、后置于PCR仪中在20°C下进行反应30min(不用热盖）。反应结 束后立即放入冰上，加入化L US邸酶，PCR仪37 °C，15min。
[0145] 4.片段大小选择
[0146] 4.1满旋混匀AMPure XP磁珠。
[0147] 4.2准备干净的1.5ml离屯、管，写好对应编号，加入13.5化无核酸酶的水，再加入57 化(0.57X)重悬的AMPure XP磁珠。
[0148] 4.3将接头连接的DNA产物加入上步准备好的1.5ml离屯、管中，枪头混匀，室溫解育 5min。
[0149] 4.4瞬时离屯、。将1.5ml离屯、管置于磁力架上，静置5min。待溶液清亮后，用枪头小 屯、吸取上清液到另一个干净的1.5ml离屯、管中，12,0(K)rpm离屯、3min后置于磁力架上。准备 干净的离屯、管并将对应的编号写好。将上清液转入对应的离屯、管中（此步磁珠上吸的为大 片段DNA，离屯、帮助去除磁珠）。
[0150] 4.5加入63化(0.63X)重悬好的AMPure XP磁珠，并用枪头混匀。室溫解育5min(该 步骤为去接头等小片段）。
[0151] 4.6置于磁力架上，静置5min。待溶液清亮后，用枪头小屯、吸取丢弃上清液。
[0152] 4.7加入20化L 80%乙醇漂洗，于磁力架上静置30s。用枪头小屯、吸取丢弃上清液。
[0153] 4.8重复步骤4.7-次。最后使用10化枪头吸取离屯、管底部残留的液体。
[0154] 4.9室溫干燥一段时间，使乙醇尽量挥发干净。
[0155] 4.10加入52iiL无核酸酶的水，枪头吹吸混匀，瞬时离屯、，置于磁力架上，静置5min。
[0156] 4.11准备干净的离屯、管，写好对应编号，加入50化满旋混匀好的AM化re XP磁珠。 吸取上步50化上清至对应AM化re XP磁珠管内，枪头混匀，静置5min。置于磁力架上，静置 5min。于磁力架上小屯、吸取丢弃上清液。
[0157] 4.12加入200化80%乙醇漂洗，于磁力架上静置30s。用枪头小屯、吸取丢弃上清 液。
[0158] 4.13重复步骤4.12-次。最后使用IOiiL枪头吸取离屯、管底部残留的液体。
[0159] 4.14室溫干燥一段时间，使乙醇尽量挥发干净。
[0160] 4.15加入24.5化无核酸酶的水，枪头吹吸混匀，瞬时离屯、，置于磁力架上，静置 5min。待溶液清亮后，用10化枪头小屯、吸取2化L上清至干净的PCR管内。
[0161] 4.16取化L进行如bit定量。将浓度低于0.化g/化的标注。用后的如bit管置于黑暗 处备用。
[0162] 5. PCR文库扩增
[0163] 5.1向PCR管中加入W下表13所