，代表清除 自由基效果越差。由图2可知，维生素C，没食子酸，芦丁与ABTS自由基在2min内均反应 迅速，2min之后反应速率相对缓和。其中芦丁与ABTS自由基反应测得的吸光值最大，维生 素C次之，没食子酸最小。维生素C，没食子酸，芦丁与DPPH自由基溶液在2min内反应迅 速，2min之后反应速率趋于缓和。测得的DPPH自由基吸光值由大到小的顺序和ABTS法 测得的结果一致，结果如表1所示。实验结果表明两种自由基与没食子酸，芦丁两种酚类物 质反应迅速灵敏，Waters柱后自由基衍生系统的管路长短，以本章节选定的流速分析样品 也大概在2分钟左右完成检测，ABTS自由基和DPPH自由基均适合作为在线系统柱后反应 试剂。
[0036] 表1ABTS法和DPPH法测定维生素C，没食子酸，芦丁 15分钟内吸光值变化
DPPH和ABTS自由基溶液一周内稳定性结果显示（见图3和表2所示），随着时间的延 长，DPPH自由基溶液和ABTS自由基溶液的吸光值呈现下降的趋势。两种自由基溶液均在 第二天吸光值差值变化幅度最大。随后其吸光值变化幅度相对较缓和。实验结果显示自由 基溶液最好现配现用，最长不可以超过24小时。
[0037] 表2DPPH和ABTS自由基溶液1周内吸光值变化
实施例2高效液相色谱分析色谱条件的选择 1、样品处理 柑橘果实清洗干净后，将柑橘果实分为柑橘果皮，囊衣，种子和果汁四个部分。果汁由 三层纱布包裹柑橘囊瓣，手动挤压获得。将柑橘固体部分放置于50 °C鼓风干燥箱内干 燥2-3天。粉碎柑橘果皮干燥样品，并过60目筛（0.280 _)，室温保存于干燥器内，分析 待用。准确称取柑橘干燥粉末样品250mg，种子625mg或2mL柑橘果汁于50mL离心管 中，加入80%甲醇至25mL体积，充分混匀，55 °C超声提取30min，震荡提取12h。之后 将样品以5000g的速度离心10min，取上清液保存于-80度。HPLC-FRSD在线分析柑橘提 取液时，需要将上清液经0. 22微米有机滤膜过滤到1. 5mL棕色进样瓶。
[0038]2、HPLC-FRSD在线抗氧化方法条件优化 为了建立在线快速测定柑橘果品总抗氧化性的方法，分别对以下因素进行优化：（1) 检测波长：PAD检测波长2D通道分别设置为283nm，245nm，330nm和290nm，并且3D通 道分别设置为从200nm到800nm的全波段扫描，来检测酚类物质从HPLC系统的洗脱色谱 峰效果。利用紫外分光光度计检测DPPH自由基溶液和ABTS自由基溶液的最大吸收波长。 (2)色谱柱的选择：第一种WatersX-TerraMSC18 保护柱（3. 9mmX20mm,5Mm)和 SunFire_C18 分析柱（4· 6mmX250mm,5Mm)(Milford，MA，USA)配合使用；第二种只使 用WatersΧ-TerraMSC18 保护柱（3. 9mmX20mm，5Mm)。（3)流动相种类的选择：第一 种组合：水/色谱级醋酸（99. 9:0. 1，v/v)㈧和色谱级甲醇⑶；第二种组合：水/甲酸 (99. 9:0. 1，v/v) (A)和色谱级甲醇（B)。（4)流动相的混合比例的选择：分别设置A相/ B相体积比例分别为80/20,60/40,50/50,37/63,20/80和0/100。（5)柱后自由基浓度的 选择：分别选择〇. 05mM，0. 10mM和0. 20mMDPPH自由基溶液进行实验；比较ABTS自 由基反应溶液分别为400nm下0. 70 ± 0. 02AU和1. 00 ± 0. 02AU吸光值的ABTS自 由基溶液浓度。（6)流速：柱后流速一定的前提下（0. 5mLmin4，HPLC系统流动相流速分 别设置为〇. 50,0. 85,0. 91,1.00mLmin1进行实验。在柱前流速一定的前提下（0. 91mL min^，柱后自由基流速分别设置为0. 10,0. 20,0. 40,0. 60,0. 80和1. 00mLmin1进行实 验。（7)系统温度：整个在线系统分别设置为25 °C，30 °C和35 °C进行实验。（8) 柑橘样品提取液进样体积：分别注射5μL，10μL，15μL和25μL的样品甲醇提取液进行 比较。
[0039] 3、结果 HPLC系统检测波长：在200nm-800nm的范围内，对柑橘样品进行全波段扫描。以及283nm，245nm，330nm和290nm下2D通道扫描，发现柑橘样品普遍在283nm，或在245nm具 有最大吸收正色谱峰。所以选择283nm和245nm作为检测有无酚类物质洗脱出来的检测波 长，即正色谱峰检测波长。
[0040]柱后系统自由基检测波长（如图4所示）：结合传统紫外分光光度计对DPPH自由 基和ABTS自由基溶液进行200-600nm全波段扫描发现：（1)DPPH自由基溶液其在517nm 具有最大吸收峰，所以选择517nm作为在线HPLC-DPPH-FRSD在线系统柱后倒峰检测的检 测波长；⑵ABTS自由基溶液在350nm和400-420nm都具有较大吸收峰。
[0041] 4、最终HPLC-FRSD在线抗氧化检测方法学建立的分析条件 最终HPLC-FRSD方法学建立的条件如下。HPLC分析系统：配有WatersXTerraMSC18 保护柱芯（3. 9X20mm，5Mm);流动相：A为0. 1%(V醋酸：V水=1:999醋酸水溶液，B为 甲醇；等度洗脱程序条件：37%A，63%B;流速：0. 91mLmin1 ;保护柱柱温：30°C;进样体积 25PL;PAD检测波长：2D通道分别设置283nm和245nm。柱后分析系统：DPPH自由基溶液 (0.2mM)和ABTS自由基溶液（400nm吸光度为0.70 ± 0.02AU吸光值时的浓度）弓丨入 流速均为0. 80mLmin、DPPH自由基溶液检测波长517nm;ABTS自由基溶液检测波长为 400nm;柱后自由基衍生反应系统温度为30°C。每个样品抗氧化活性分析时间为5min。 在线HPLC-FRSD在线抗氧化检测系统结构示意图见图1。
[0042] 在本发明中：为了缩短酚类物质出峰时间，实现在线快速检测酚类物质的总抗氧 化性。本实验移去了C18色谱分析分离柱（SunFire_C18,4.6mmX250mm，5Mm)，只使用该 系统原来的保护柱（WatersX-TerraMSC18,3. 9mmX20mm，5Mm)进行分析。结果表明， 只使用保护柱大大缩短了酚类物质出峰时间，整个分析可以在5min内完成，且色谱倒峰峰 型尖锐对称。
[0043] 分别配置不同的DPPH自由基浓度（0. 05mM，0. 10mM和0. 20mM)进行在线 HPLC-FRSD系统试验，结果显示自由基浓度越大，DPPH自由基溶液倒峰检测效果越佳。本 试验选用0. 20mMDPPH自由基浓度。比较不同ABTS自由基溶液浓度（0. 70±0. 02和 1.00±0. 02吸光值下的浓度，400nm)作为柱后反应自由基浓度，进行HPLC-FRSD系统分 析，两者出现倒峰效果均很灵敏。本试验选用400nm下吸光度为0. 7±0. 02的ABTS自由 基溶液作为HPLC-ABTS-FRSD系统的柱后衍生浓度。
[0044] 实施例3在线HPLC-FRSD方法学考察 1、线性关系考察以及检出限、定量限测定 分别精密吸取芦丁、没食子酸、阿魏酸、咖啡酸和绿原酸贮备液至5个25mL棕色容量 瓶。采用逐渐稀释法，配置一系列不同浓度标准品溶液，按照"HPLC-FRSD在线抗氧化方法 条件优化"，最后优化建立的分析条件在线分析，分别进样各标准品溶液25μL。以酚类标准 品溶液浓度为横坐标（X)，以负峰面积为纵坐标（Υ)，绘制标准曲线并计算回归方程和相关 系数。
[0045] 采用逐渐稀释法将标准品液进行稀释，并设定信噪比（RSN)为3时，测定各标准 品的最低检出限（L0D);设定信噪