一种鸭细小病毒间接elisa检测试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及兽医病原抗体检测技术领域，提供了一种鸭细小病毒间接ELISA检测 试剂盒。
【背景技术】
[0002] 鸭细小病毒是细小病毒的一种，主要侵害1~3周龄的雏鸭，临床以腹泻、呼吸困 难和脚软为主要症状，一年四季均有发生，给鸭饲养带来极大的经济损失，是鸭饲养中主要 的疾病之一，发病率和死亡率也较高。
[0003] 2015年3月以来，我国山东、江苏和安徽等地肉鸭群出现了一种疾病，经验证为鸭 细小病毒，该病以鸭喙发育不良，舌头外伸为特征，本病主要发生在14日龄以上的商品鸭， 鸭群发病率为10 % -20 %，最高可达50 %，大群感染率最高可达100 %，但该病不造成患鸭 死亡。患鸭发育迟缓，体温略升高，喙短，弹性降低，舌肿胀，外伸，感染后期患鸭胫骨和翅骨 易发生骨折。该病主要导致鸭群料肉比上升，养殖成本升高，鸭出栏合格率降低。对肉鸭养 殖业造成巨大的经济损失。
[0004] 细小病毒属（Parvovirus)是一种核酸为单股线状的DNA病毒，病毒结构多肽有3 种，分别为VP1、VP2、VP3,其中VP3为主要的结构多肽。该病毒不能凝集鸡红细胞，是构成 细小病毒外部的主要蛋白，含有能保护机体抵抗DPV感染的中和性抗原表位，利用含有中 和抗原表位的重组病毒蛋白建立ELISA检测试剂盒对于该病的诊断具有重要的意义。
【发明内容】
[0005] 针对上述情况，本发明的发明人提供了一种鸭细小病毒间接ELISA检测试剂盒， 发明人首先提供了一种鸭细小病毒的VP3蛋白，该蛋白氨基酸序列如SEQ ID No. 1所示，表 达该蛋白的核苷酸序列，如SEQ ID No. 2所示。研究表明，该蛋白具有良好的免疫反应原性， 可以用于DPV抗体的检测，进而利用该蛋白提供了鸭细小病毒抗体ELISA检测试剂盒，该试 剂盒具有快速、稳定、特异性高、灵敏度强，能够快速检测血清中鸭细小病毒的抗体水平，为 该病的预防和控制具有明显的推动作用。
[0006] 发明人首先提供了一种鸭细小病毒的VP3蛋白，该蛋白氨基酸序列如SEQ ID No. 1 所示，表达该蛋白的核苷酸序列，如SEQ ID No. 2所示。研究表明，该蛋白具有良好的免疫 反应原性，可以用于DPV抗体的检测。
[0007] 在此基础上，发明人获得了鸭细小病毒间接ELISA检测试剂盒，所述试剂盒包括： 鸭细小病毒VP3重组蛋白包被的ELISA板，酶标二抗，阳性对照，阴性对照，洗涤液，样品稀 释液，显色液和终止液；
[0008] 其中酶标二抗为辣根过氧化物标记羊抗鸭单克隆抗体，所述阳性对照为自然感染 鸭细小病毒GT2015株鸭血清；所述阴性对照为正常鸭血清，所述重组VP3蛋白包被量为 150ng/well〇
[0009] 所述的包被液，洗涤液，封闭液，样品稀释液，显色液和终止液的组分及配比如 下：
[0010] 包被液：1 X碳酸盐缓冲液=Na2CO3 0. 2756g，NaHCO3 0. 6216g，用蒸馏水溶解并定 容至 100mL，pH 值 9. 5-9. 7,4°C保存；
[0011] PBS 溶液：NaCl 4. 25g，NaH2PO4 · 2H20 0· 178g，Na2HPO4 · 12H20 I. 386g，用蒸馏水 溶解并定容至500mL，pH值L 1-7. 3 ;
[0012] 洗涤液：每IL PBS加入Tween-20 0· 5mL，充分混匀；
[0013] 封闭液，稀释液：将5g drymilk溶解于IOOmL PBST稀释液中，短期保存于4°C，长 期保存于_20°C ;
[0014] 酶标二抗：Peroxidase-Labeled Antibody To Duck IgG (H+L)，Produced in Goat ；
[0015] TMB显色液：可溶型单组分TMB底物溶液；
[0016] 终止液为3mol/L硫酸溶液。
[0017] 其中所述的作为酶标板包被抗原的鸭细小病毒VP3蛋白的重组蛋白制备，包括以 下步骤：利用苯酚-氯仿法抽提病鸭组织中的病毒DNA，用PCR技术进行检测，将PCR扩增 片段（SEQ ID No. 2)进行胶回收纯化，用限制性内切酶BamH I和Hind III双酶切后转入 PET_28a (+)载体，转化至DH5 α大肠杆菌感受态细胞中，经菌液PCR鉴定为阳性克隆子，震 荡培养16小时提取质粒测序。将阳性质粒转入BL21大肠杆菌感受态细胞中，鉴定为阳性 的进行IPTG诱导表达，用尿素法进行洗涤纯化，然后分别用SDS-PAGE和Western blot验 证蛋白（SEQ ID No. 1)纯化结果和免疫原性结果。结果显示目的条带为本发明诱导表达的 鸭细小病毒VP3蛋白。
[0018] 发明人进一步提供了上述鸭细小病毒间接ELISA检测试剂盒的使用方法，具体如 下：
[0019] UELISA检测程序
[0020] (1)以150ng/well重组鸭细小病毒VP3蛋白包被ELISA反应板，4°C过夜孵育，应 用PBST洗涤ELISA反应板3次；
[0021] (2)以5g/100mL的脱脂奶粉溶液封闭ELISA反应板，37°C，封闭Ih后，应用PBST 洗涤ELISA反应板3次；
[0022] (3)将待检血清用5g/100mL脱脂奶粉溶液做1:10倍w/v稀释，按100 μ L加入 ELISA反应板，37°C作用I. 5h后，应用PBST洗涤ELISA反应板3次；
[0023] (4)将羊抗鸭IgG-HRP按100 μ L/wel 1加入ELISA反应板，37°C作用Ih后，应用 PBST洗涤ELISA反应板3次；
[0024] (5)将100 μ L底物显色液加入ELISA反应板，避光37°C显色15min，加入50 μ L终 止液，立即在酶标仪450nm波长下读取OD值。
[0025] 2、间接ELISA方法判定标准的确定
[0026] 用酶标仪读取酶标板的0D450nm值，计算出阴性血清平均值（'X) +标准差（SD)，得 到阴阳性临界值为〇. 239,结果判定标准为X多0. 25,可判断为阳性，即待检样品中含有鸭 细小病毒抗体，否则为阴性。
[0027] 综上所述，本发明提供的鸭细小病毒间接ELISA检测试剂盒及其使用方法具有快 速、稳定、特异性高、灵敏度强，能够快速检测血清中鸭细小病毒的抗体水平，为该病的预防 和控制具有明显的推动作用。
[0028] 保藏信息
[0029] 保藏时间：2015年8月28日
[0030] 保藏单位名称：中国典型培养物保藏中心CCTCC
[0031] 保藏编号：CCTCC NO :V201527
[0032] 保藏单位地址：中国武汉大学
[0033] 分类命名：鸭细小病毒GT2015
【附图说明】
[0034] 图1为鸭细小病毒VP3蛋白的重组蛋白SDS-PAGE电泳图，
[0035] 图中M为Blue Plus" II Protein Marker，1为未诱导表达重组蛋白，2为4h诱导 表达重组蛋白，3为纯化后重组蛋白，
[0036] 从图中可以显现出未诱导蛋白1没有目的蛋白，只有部分大肠杆菌蛋白；诱导未 纯化蛋白2有目的蛋白，但同时也有很多大肠杆菌自身的蛋白；而纯化的重组蛋白3只有目 的蛋白没有其他杂蛋白。
【具体实施方式】
[0037] 实施例1纯化重组鸭细小病毒VP3蛋白的获得
[0038] A、病毒DNA的提取：取部分患鸭肝脏匀浆悬液消化后，采用酚氯仿法进行总DNA的 提取，最后用50 μ LddH2O溶解，置于-20°C保存；
[0039] B、引物的设计与合成：根据已发表的鸭细小病毒全基因组序列，结合我们对多株 鸭细小病毒分离株VP3测序结果，利用Primer Premier5. 0设计1对引物并加