检测茶叶中吡虫啉残留的酶联免疫试剂盒及使用方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于酶联免疫检测领域，具体涉及一种检测茶叶中吡虫啉残留的酶联免疫 试剂盒及其使用方法。
【背景技术】
[0002] 啦虫啉（Imidacloprid)，又称咪姐胺、姐虱净，是新一代氯代尼古丁杀虫剂，具有 广谱、高效、低毒、低残留，害虫不易产生抗性，对人、畜、植物和天敌安全等特点，并有触杀、 胃毒和内吸多重药效。害虫接触药剂后，中枢神经正常传导受阻，使其麻痹死亡。速效性好， 药后1天即有较高的防效，残留期长达25天左右。药效和温度呈正相关，温度高，杀虫效果 好，生产上主要用于防治刺吸式口器害虫。
[0003] 吡虫啉杀虫谱较广，包括同翅目、缨翅目、鞘翅目、双翅目及鳞翅目等，尤其对刺吸 式害虫具有内吸性和高残效的特点，目前，吡虫啉在世界范围内的销售额位列杀虫剂的首 位。吡虫啉制剂产品，在我国已获得在茶树上的登记使用，用于防治茶树上的主要害虫小绿 叶蝉、黑刺粉虱，效果优于噻嗪酮、醚菊酯、抗蚜威和杀螟丹等农药。日本规定吡虫啉在茶叶 中的限量标准为l〇mg/kg，我国规定茶叶中P比虫啉最大残留限量为0. 5mg/kg。
[0004] 我国茶叶品质优良、口感独特、营养丰富，是我国浙江、贵州、福建等省的重要经济 作物，我国茶文化源远流长，茶叶是我国百姓生活中，必不可少的饮品，同时，我国出产的茶 叶，深受国际市场的青睐，远销欧盟、日本、韩国、美国等国家和地区。
[0005] 从现有技术和相关检测标准看，目前针对吡虫啉残留的检测方法主要是仪器 方法，高效液相法（HPLC)、气相色谱法（GC)、电化学分析法（EA)、气相色谱质谱联用法 (GC-MS)等，仪器方法具备检测灵敏度高、特异性强等优势，但是检测样本前处理繁琐、耗 时，样品还需提取和净化处理，同时仪器检测方法需要昂贵的大型仪器和设备、配备专业的 检测技术人员，进行操作和管理，无法进行现场大规模检测，时效性差，难以推广。近年来药 物残留免疫检测技术已经在食品质量安全快速检测中，得到了广泛的应用，且逐渐被人们 所认可，酶联免疫检测技术具有样品前处理简单，检测快速、灵敏、特异性好、准确度高等特 点，能够满足现场快速检测的要求，从而弥补仪器检测的不足。
[0006] 在国际市场竞争日益激烈、食品安全日益重视的今天，寻求茶叶中快速检测农药 残留的有效手段至关重要。本发明提供的吡虫啉残留酶联免疫试剂盒只需一步反应，耗时 45分钟，即可得到检测结果，且检测限为100μg/kg，灵敏度可达lug/kg，优于同类产品。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的在于提供一种能够检测茶叶样本中吡虫啉残留量的酶联免疫试剂 盒，并提供一种高效、准确、简便、适于大批量样品筛选的定性、定量检测方法。
[0008] 本发明试剂盒，它包括：包被有包被原的酶标板、吡虫啉标准品溶液、酶标二抗、 底物显色液、终止液、洗涤液、复溶液，所述包被原为吡虫啉偶联抗原，所述酶标记物为酶标 记抗抗体。
[0009]所述吡虫啉偶联抗原是由吡虫啉半抗原与载体蛋白偶联得到，所述吡虫啉半抗原 是由氧化还原反应得到，所述载体蛋白可为鼠血清蛋白、甲状腺蛋白、牛血清白蛋白、兔血 清蛋白、人血清蛋白、卵清蛋白、血蓝蛋白或纤维蛋白原，优选牛血清蛋白和卵清蛋白。
[0010] 所述吡虫啉特异性抗体是以吡虫啉偶联抗原作为免疫原制备获得，所述吡虫啉特 异性抗体可为吡虫啉单克隆抗体或吡虫啉多克隆抗体，其中优选吡虫啉单克隆抗体。
[0011] 所述抗抗体为羊抗鼠抗抗体或羊抗兔抗抗体，其中优选羊抗鼠抗抗体。
[0012] 所述酶标二抗的标记酶为辣根过氧化物酶；酶标二抗是采用戊二醛法或过碘酸钠 法将标记酶与抗抗体进行偶联得到的。
[0013]为了更方便现场监控和大量样本筛查，所述试剂盒还包括吡虫啉标准品溶液、底 物显色液、终止液、洗涤液、复溶液。
[0014] 所述吡虫啉标准品溶液5瓶，浓度分别为0 μg/L、1μg/L、3μg/L、9μg/L、27μg/ L〇
[0015] 当标记酶为辣根过氧化物酶时，所述底物显色液由底物显色A液和底物显色B液 组成，A液为过氧化氢或过氧化脲，B液为邻苯二胺或四甲基联苯胺，所述终止液为l~2mol/ L的硫酸或盐酸缓冲液。
[0016] 所述洗涤液优选为pH值7. 4,含有0. 5%~1. 0%吐温-20、0. 01%。~0. 03%。叠氮化钠 防腐剂、〇.l~〇. 3mol/L的磷酸盐缓冲液，所述百分比为重量体积百分比。
[0017] 所述复溶液优选为pH值7. 0,0. 02mol/L的磷酸盐缓冲液，所述百分比为重量体积 百分比。
[0018]其中在酶标板制备过程中所用到的包被缓冲液为pH值9. 6,0. 05mol/L的碳酸盐 缓冲液，封闭液为pH值7. 1~7. 5,含有1%~3%酪蛋白、0. 1~0. 3mol/L的磷酸盐缓冲液，所述 百分比为重量体积百分比。
[0019] 本发明中酶标板的制备过程为：用包被缓冲液将包被原稀释成20μg/ml，每孔加 入100μ1，37°C避光孵育2h或4°C过夜，倾去孔中液体，用洗涤液洗涤1次，每次30s，拍干， 然后在每孔中加入150μ1封闭液，37°C避光孵育l~2h，倾去孔内液体拍干，干燥后用铝膜 真空密封保存。
[0020] 本发明的检测原理为： 在微孔条上预包被吡虫啉偶联抗原，加入样本溶液或标准品溶液后，再加入吡虫啉特 异性抗体溶液，样本中的吡虫啉与酶标板上包被的吡虫啉偶联抗原竞争抗吡虫啉特异性抗 体，加入酶标记抗抗体进行放大作用，用显色液显色，样本吸光度值与吡虫啉的含量呈负相 关，与标准曲线比较即可得到样本中吡虫啉的残留量；同时根据酶标板上颜色的深浅，与系 列浓度的标准品溶液颜色的比较可粗略判断样品中吡虫啉残留量的浓度范围。若无酶标 仪，则不加终止液，用目测法可进行判定。
[0021] 本发明检测吡虫啉的酶联免疫试剂盒主要采用竞争ELISA方法定性或定量检测 样品中吡虫啉的含量；对样品的前处理要求低，样品前处理过程简单，能同时快速检测大批 量样品；主要试剂以工作液的形式提供，检验方法方便易行，具有特异性高、灵敏度高、精确 度高、准确度高等特点。本发明的酶联免疫试剂盒，结构简单、使用方便、价格便宜、携带便 利、检测方法高效、准确、简便的特点，适于大批量样品筛选的定性、定量。
【附图说明】
[0022] 图1 :吡虫啉半抗原合成路线图； 图2 :吡虫啉半抗原核磁共振氢谱图； 图3:试剂盒标准曲线图。
【具体实施方式】
[0023] 下面结合具体的实施例来进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本 发明，而不是来限制本发明的范围。
[0024] 实施例1试剂盒组分的制备 1、吡虫啉半抗原的制备 25ml三角瓶中加入吡虫啉0. 10g，加入适量二氯甲烷，使其完全溶解，加入5ml巯基丙 酸，加入1. 0-2. 0g氢氧化钾作为催化剂，加热回流，提取纯化，干燥所得淡黄色固体即为吡 虫啉半抗原，如图1所示。 取上述产物经核磁共振氢谱测定，如图2所示，4. 7ppm左右的峰为咪唑啉环上的两个 亚甲基信号峰，5.Oppm左右的峰为苄基信号峰，7. 2-8. 7ppm为氨基与芳环混合信号峰，说 明目标半抗原合成成功。
[0025] 2、抗原的制备 称取32. 5mg半抗原溶解于2mLDMF溶液中，加入60mgEDC和60mgNHS(溶于2mL水 中）进行活化30分钟，加入到100-250mg载体蛋白BSA(溶于3mL水中）进行偶联制备出免 疫原，用0. 02mol/LPB缓冲液透析3天，每天早晚更换透析液，透析完成后用于动物免疫制 备出抗体。同样的方法将半抗原与载体蛋白0VA进行偶联制出包被原用于抗体检测。
[0026] 3、吡虫啉单克隆抗体的制备 动物免疫：将上述步骤得到的免疫原注入到Balb/c小鼠体内，免疫剂量为200μg/只， 使其产生抗血清。
[0027] 细胞融合和克隆化：小鼠血清测定结