用于检测肿瘤标志物的夹心式电化学发光免疫传感器的制备方法及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及电化学发光免疫传感器，尤其是涉及用于检测肿瘤标志物的夹心式电 化学发光免疫传感器的制备方法及其应用。
【背景技术】
[0002] 肿瘤是人类健康的杀手。恶性肿瘤也称为癌症，是当前严重威胁人类健康和生命 的一类疾病，它是机体受各种内在或外在致癌因素作用下，局部组织的细胞在基因水平上 失掉了对其自身生长的正常调控，导致不正常增生而形成的新生物。据WHO研究，2012年全 球癌症患者和死亡病例都在令人不安地增加，新增癌症病例有近一半出现在亚洲，其中大 部分在中国，中国新增癌症病例高居世界第一位。WHO也指出，及早诊断和治疗是对抗肿瘤 疾病的有效手段之一，肿瘤的早期诊断是决定其预后的一个重要因素。肿瘤标志物是指在 肿瘤的发生和增殖过程中产生的、反映肿瘤存在和生长的一类物质，包括蛋白质、激素、酶、 基因等，是肿瘤早期诊断的重要指标。一般而言，肿瘤细胞越多，恶性程度越高，越晚期，月中 瘤标志物的浓度越高。随着肿瘤早期诊断进入蛋白质时代，越来越多的高特异性、低丰度肿 瘤标志物被发现，这就对建立快速、高灵敏度、高特异性肿瘤标志物检测技术提出了更高的 要求。
[0003] 免疫分析法是利用抗体与抗原之间的特异性识别与结合而建立的高选择性生物 化学方法。目前，检测肿瘤标志物的免疫分析方法主要有：放射免疫分析法（RIA)、酶联免 疫吸附分析法（ELISA)、化学发光免疫分析法（CLIA)、电化学免疫分析法（ECIA)、电化学发 光免疫分析法（ECLIA)和免疫电镜法等，这些方法都有一定的灵敏度和准确度，但也各有 一定的不足之处：有的仪器昂贵、操作复杂、技术要求高，有的步骤繁多、易出现假阳性和假 阴性，有的使用放射性试剂，有的特异性不强、灵敏度不高、选择性差，有的响应时间长、无 法重复测量。因此，开发灵敏、准确、快速、简便的肿瘤标志物检测方法仍是迫切需求。
[0004] 电化学发光免疫传感器是电化学发光和免疫传感器相结合的产物，由于其灵敏度 高、特异性好、重现性好、操作简便等优点，具有广阔的应用前景，并被广泛应用于临床分析 和环境检测领域。
[0005] 氧化石墨烯是石墨烯的氧化物，是一种性能优异的新型碳材料，具有较高的比表 面积和丰富的官能团，而基于氧化石墨烯制备的功能化氧化石墨烯稳定性高、制备简单，是 构建电化学发光传感器的理想材料。氮化碳材料（g_C 3N4)是一种类似石墨的纳米薄膜，具 有比表面积大、稳定性强、硬度大、导电性好、生物相容性良好等特点，并且氮化碳材料本身 具有极强的电化学发光的能力，非常适合用于开发电化学发光免疫传感器。目前国内外还 没有公开任何关于基于氧化石墨烯和氮化碳两种纳米复合材料的用于检测肿瘤标志物的 夹心式电化学发光免疫传感器的相关报道。
【发明内容】
[0006] 本发明所要解决的技术问题是提供一种检测速度快、检测结果灵敏度和准确性 高、特异性强的用于检测肿瘤标志物的夹心式电化学发光免疫传感器的制备方法及其应 用。
[0007] 本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种用于检测肿瘤标志物的夹心 式电化学发光免疫传感器的制备方法，包括以下步骤：
[0008] (1)功能化氧化石墨稀（AbfnanoFe3O4OGO)的制备
[0009] a.磁性氧化石墨稀的合成：在洁净的三颈烧瓶中加入30~50mL lmg/mL的氧化 石墨稀，超声Ih ;然后在氮气氛保护下逐滴加入20~30mL 0. 05~0. 07mol/L的氯化亚铁 溶液和20~30mL 0. 10~0. 15mol/L的氯化高铁溶液，于70~90°C搅拌回流，同时缓慢滴 加10~15mL 20~30wt%的氨水至溶液的pH = 10~11，搅拌回流处理3~5h ;冷却后， 外加磁铁磁性分离后用二次水洗涤至溶液的pH = 7,定容到50mL，即得纳米四氧化三铁颗 粒OianoFe3O4)均勾覆盖在氧化石墨稀（GO)表面的磁性氧化石墨稀（nanoFe 304@G0)溶液， 4 °C储存备用；
[0010] 13.取步骤（&)中所得的磁性氧化石墨烯（仙11#630 4哪0)溶液20(^1^置于玻璃 瓶中，超声lh，然后加入200~400 μ L偶联试剂，混合均匀，同时滴加稀盐酸至溶液pH = 4~6,振荡孵育lh，外加磁铁磁性分离后用二次水洗涤以去除偶联试剂，定容至200~ 300 μ L ;用 0.1 ~0.2mol/L NaOH 溶液调 pH 为 8.0 ~10.0,再加入 30 ~50 μ L 10 4~ 10 6mg/mL肿瘤标志物一抗（Ab1)孵育3~5h后，再加入50~100 μ L 2wt %牛血清白蛋白 溶液以封闭非特异性吸附位点，继续孵育1~2h，外加磁铁磁性分离后用二次水洗涤至中 性后，定容至100~200 μ L，即得到功能化氧化石墨稀（Ab1-IianoFe3O4OGO)溶液；
[0011] ⑵功能化氮化碳（Ab2-AuOg-C3N4)的制备
[0012] a.氮化碳薄膜的合成：将三聚氰胺在500~600°C下加热3~5h，真空干燥后，得 到氮化碳粉末；取〇. 8~I. 5g氮化碳粉末加入到80~120mL 4~6mol/L硝酸溶液中，于 120~150°C下回流24~48小时后，自然冷却至室温，12000rpm离心后弃去上清液，加入二 次水洗涤；重复离心去上清洗涤步骤，直至上清液为中性；取沉淀加入50~IOOmL水，超声 4个小时，SOOOrpm离心半个小时，保留上清液，即得到氮化碳薄膜溶液；
[0013] b.取30~70mL氮化碳薄膜溶液加入到30~70mL直径10~30nm的胶体金溶液 中，室温下搅拌16~24h，6000~8000rpm离心半个小时后，取上部溶液即得到表面均匀结 合有纳米金颗粒的氮化碳薄膜溶液；取200 μ L表面均匀结合有纳米金颗粒的氮化碳薄膜 溶液于玻璃瓶中，加入30~50 μ LlO 4~10 6mg/mL肿瘤标志物二抗（Ab2)后孵育3~5h， 通过抗体表面的氨基与纳米金的结合作用，将肿瘤标志物二抗Ab 2固载到氮化碳薄膜表面； 然后加入50~100 μ L 2wt%牛血清白蛋白溶液以封闭非特异性吸附位点，继续孵育1~ 2h ;12000rpm离心，去除上清液后加入水清洗；重复离心去上清洗涤3次后，取沉淀加入水 定容至200~300 μ L，即得功能化氮化碳（Ab2-AuOg-C3N4)溶液；
[0014] (3)电化学发光免疫传感器的组装
[0015] a.将直径为3~5mm的磁性玻碳电极依次用1. 0、0. 3和0. 05 μ m的Al2O3抛光粉 在麂皮上抛光至镜面，然后依次用体积比为50%的乙醇水溶液、体积比为50%的硝酸水溶 液和蒸馏水超声清洗2min ;
[0016] b.取5~10 μ L步骤⑴得到的功能化氧化石墨稀（AbfnanoFe3O4OGO)溶液，滴 在上述预处理过的磁性玻碳电极表面，功能化氧化石墨烯即被均匀、牢固地吸附于电极表 面；将吸附有功能化氧化石墨烯的磁性玻碳电极浸入在待测肿瘤标志物溶液中，置于35°C 孵育1~2h后，清洗；再置于5~10 μ L步骤⑵得到的功能化氮化碳溶液中，于35°C中 孵育1~2h后，清洗，即得到用于检测肿瘤标志物的夹心式电化学发光免疫传感器。
[0017] 步骤（l)b中所述的偶联试剂为1-(3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐 (EDC)与N-羟基琥珀酰亚胺（NHS)溶于水中得到，所述的偶联试剂中1-(3-二甲氨基丙 基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC)的摩尔浓度为10~100mmol/L，所述的N-羟基琥珀酰 亚胺（NHS)的摩尔浓度为1~10mmol/L。
[0018] 步骤（2) b中所述的胶体金溶液制备方法如下：将1~3mL Iwt%氯金酸溶液加入 到80~120mL蒸馏水，在磁力搅拌下加热至沸腾，然后迅速加入3~5mL的lwt%朽1檬酸钠 水溶液，继续煮沸直至溶液变为深红色，沸腾状态下继续加热搅拌20min，即得到胶体金溶 液，4°C密封保存。
[0019] 所述的肿瘤标志物为：鳞状细胞癌抗原（SCCA)、甲胎蛋白（AFP)、癌胚抗原（CEA)、 前列腺特异性抗原（PSA)、碱性磷酸酶（ALP)、组织多肽抗原（TPA)。
[0020] 利用上述夹心式电化学发光免疫传感器检测肿瘤标志物的方法，具体步骤如下： 将上述夹心式电化学发光免疫传感器作为工作电极；采用铂电极作为对电极，Ag/AgCl电 极或者饱和甘汞电极作为参比电极，构成三电极体系；将上述三电极体系放入含共反应试 剂的缓冲溶液，启动电化学反应，测量电化学发光强度，获得待测肿瘤标志物溶液对应的电 化学发光强度值；根据电化学发光强度值与肿瘤标志物溶液浓度对数之间的定量关系，计 算得到待测样品溶液中肿瘤标志物的准确浓度。
[0021] 所述的缓冲溶液为：含有10~30mmol/L K2S2O8和80~lOOmmol/L KCl的pH为 7. 5~8. 5的磷酸盐缓冲溶液，。
[0022] 所述的电化学反应的条件如下：电位阶跃计时电流法，脉冲宽度：0. 25秒；脉冲间 隔：30秒；初始电压：0V ;脉冲电压：1. 6V。
[0023] 发明原理：本发明利用免疫反应的高特异性，结合两种片层网状纳米结构材料，制 备了一种电化学发光免疫传感器并用来检测多种肿瘤标志物。多功能化氧化石墨烯材料 是在氧化石墨烯上同时修饰有四氧化三铁纳米磁珠和第一抗体的复合材料；多功能化氮化 碳材料是在氮化碳上同时负载有纳米金和第二抗体；这两种纳米复合材料具有多种功能： (1)氧化石墨烯和氮化碳材料均具有巨大的表面积、丰富的表面基团和良好的生物相容性， 可以负载大量肿瘤标志物抗体和其他纳米粒子，并且具有良好的导电性，有利于电子传递， 增强电化学发光；（2)氮化碳材料自身具有极强的电化学发光，不需要另外标记电化学发 光体，大大简化了制备步骤；（3)负载的肿瘤标志物抗体，可以特异性识别肿瘤标志物；(4) 使用两种大表面积片层网状结构的纳米材料，通过形成"第一抗体-抗原-第二抗体"夹心 式免疫复合物，氧化石墨烯和氮化碳这两种网状结构的材料就会搭接在一起，结合在免疫 复合物中的所有氮化碳都如同直接固载在电极表面，都可以直接参与电极反应，大大增强 电化学发光信号。
[0024] 本发明构建的电化学发光免疫传感器，可以特异性地俘获样品中的肿瘤标志物， 当多功能化氮化碳材料通过形成"第一抗体-抗