一种基于片状锶铁氧体双重放大的乳腺癌易感基因免疫传感器的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种基于片状锶铁氧体双重放大的乳腺癌易感基因免疫传感器的制备，采用Ab-Ag@SrFe12019同时作为检测抗体和捕获抗体的标记物，制备一种检测乳腺癌易感基因的电化学免疫传感器，属于新型功能材料与生物传感检测技术领域。
【背景技术】
[0002]癌症是一大类恶性肿瘤的统称。肿瘤在发生发展过程中，肿瘤细胞异常表达或宿主细胞对肿瘤反应后产生的某些物质，可作为肿瘤标志物，用于临床某些肿瘤的诊断和辅助诊断。因此，在临床研究上，发展一种快速、简便、灵敏的检测肿瘤标志物方法是十分重要的。
[0003]电化学免疫传感器具有结构简单、选择性好、操作简便、灵敏度高、易于小型化、可连续、快速自动化检测分析等优点，因此本发明制备了一种基于片状锶铁氧体双重放大的电化学免疫传感器，实现了对乳腺癌易感基因的检测。
[0004]目前已有的肿瘤标志物的临床检测方法很多，但是大多都是需要大型设备和专业的操作人员。免疫传感器是将免疫学方法与分析化学方法相结合的一种生物传感器，通过抗原与抗体之间的特性性结合，使得它具有高灵敏性、高选择性、分析快速和操作简便等优点。
[0005]本发明采用N-GS0HPCS为基底材料，Ab-Ag@SrFe12019同时作为检测抗体和捕获抗体的标记物，过氧化氢产生电化学信号，增强了传感器的灵敏度，扩宽了线性范围，有效地降低了传感器的检出限，实现了对乳腺癌易感基因的超灵敏分析。该方法具有成本低、灵敏度高、特异性好、检测快速等优点，而且制备过程较为简单，有效克服了目前肿瘤标志物检测方法的不足。
【发明内容】
[0006]1.一种基于片状锶铁氧体双重放大的乳腺癌易感基因免疫传感器的制备
(1)将直径为4 mm的玻碳电极用A1203抛光粉打磨，超纯水清洗干净，将6 μ?、0.1 ~ 3mg/mL氮掺杂石墨烯@羟丙基壳聚糖N-GS0HPCS分散液滴加在电极表面上，室温下晾干成膜；
(2 )滴加6 μ?的抗体孵化物Ab-Ag@SrFe12019溶液于电极表面，超纯水冲洗，4°C冰箱中晾干；
(3)滴加6PL、质量分数为0.5 ~ 3.5溶液于电极表面，超纯水冲洗，4°C冰箱中晾干；
(4)滴加6μ?、0.001-35 ng/mL的不同浓度的乳腺癌易感基因抗原标准溶液至电极表面，超纯水冲洗，4 V冰箱中晾干；
(5 )滴加6 μ?抗体孵化物Ab-Ag@SrFe12019溶液于电极表面，超纯水冲洗，4°C冰箱中晾干。
[0007]2.氮掺杂石墨烯@羟丙基壳聚糖N-GS0HPCS分散液的制备
(1)氮掺杂石墨烯N-GS的制备
将0.5 mg氧化石墨稀分散于1 ~ 5 mL的N, N-二甲基甲酰胺中，超声30 min后，将氧化石墨烯的N，N- 二甲基甲酰胺分散液于153°C下加热0.5 ~ 5 h，将所得产品在7500 ~10000 r/min 离心 10 min，分离得到 N-GS ；
(2)氮掺杂石墨烯@羟丙基壳聚糖N-GS0HPCS分散液的制备
将1 ~ 10 mg N-GS与1 mL、0.1-10 mg/mL轻丙基壳聚糖溶液进行混合，超声1 ~ 10h，得到 N-GS0HPCS。
[0008]3.抗体孵化物Ab-Ag@SrFe12019的制备
(1)Ag@SrFe12019的合成
将0.1 g SrFe12019加入到8 mL无水乙醇中，加入0.1 ~ 3 mL 3-氨丙基三乙氧基娃烧，50 ~ 85°C回流2 h，离心分离，真空干燥，制得氨基化SrFe12019;将1 mg氨基化的SrFe 12019加入到50 mL质量分数为1 %的Ag纳米溶胶中，振荡30 h，在7500 r/min下离心10 min,将所得固体重新分散到1 mL超纯水中，制得Ag@SrFe12019分散液；
(2)抗体孵化物Ab-Ag@SrFe12019的制备
将1 ~ 10 mg Ag@SrFe12019加入到1 mL、10 ~ 500 Kg/mL的乳腺癌易感基因抗体Ab溶液中，充分混匀，震荡20 h，制得Ab-Ag@SrFe12019抗体孵化物溶液。
[0009]4.乳腺癌易感基因的检测
(1)使用电化学工作站进行测试，参比电极为饱和甘汞电极，对电极为铂电极，所制备的免疫传感器为工作电极，在10 mL、10 ~ 200 mmoL/L、pH 7.00 ~7.40的PBS缓冲溶液中进行测试；
(2)用时间-电流法对乳腺癌易感基因抗原标准溶液进行检测，输入电压为-0.6~ 0.2V，运行时间50 ~ 5000 s，取样间隔0.1 ~ 0.6 s ；
(3)当背景电流趋于稳定后，每隔50s向10 mL、10 ~ 200 mmoL/L的PBS中注入10yL、5 ~ 20 mol/L的双氧水溶液，然后记录电流变化，绘制工作曲线。
[0010]本发明的有益成果
(l)N-GSiHPCS的使用，增大了电极表面的比表面积，同时能够很好的促进电极表面的电子传递，并且HPCS在能够很好的固定N-GS、连接抗体，提高传感器的稳定性。
[0011](2)片状SrFe12019的使用，能够更多连接有效的乳腺癌易感基因抗体，实现对更多抗原的检测。
[0012](3)基于Ab-Ag@SrFe1201E^固定相，构建了双重放大的电化学免疫传感器，该传感器的检测抗体和捕获抗体同时用Ag@SrFei2019进行了孵化，该方法是首次构建的新型传感器构建方法。
[0013](4)本发明制备的电化学免疫传感器用于乳腺癌易感基因的检测，响应时间短，检测限低，线性范围宽，可以实现简单、快速、高灵敏和特异性检测，对乳腺癌易感基因检出限达到0.33 pg/mL，可以实现对乳腺癌的早期预警。
【具体实施方式】
[0014]实施例1 一种基于片状锶铁氧体双重放大的乳腺癌易感基因免疫传感器的制备
(1)将直径为4 mm的玻碳电极用A1203抛光粉打磨，超纯水清洗干净，将6 μ?、0.1 mg/
mL氮掺杂石墨烯@羟丙基壳聚糖N-GS0HPCS分散液滴加在电极表面上，室温下晾干成膜；(2 )滴加6 μ?的抗体孵化物Ab-Ag@SrFe12019溶液于电极表面，超纯水冲洗，4°C冰箱中晾干；
(3)滴加6PL、质量分数为0.5 %的BSA溶液于电极表面，超纯水冲洗，4°C冰箱中晾干;
(4)滴加6μ?、0.001-35 ng/mL的不同浓度的乳腺癌易感基因抗原标准溶液至电极表面，超纯水冲洗，4 V冰箱中晾干；
(5 )滴加6 μ?抗体孵化物Ab-Ag@SrFe12019溶液于电极表面，超纯水冲洗，4°C冰箱中晾干。
[0015]实施例2—种基于片状锶铁氧体双重放大的乳腺癌易感基因免疫传感器的制备
(1)将直径为4 mm的玻碳电极用A1203抛光粉打磨，超纯水清洗干净，将6 μ?、1 mg/mL氮掺杂石墨烯@羟丙基壳聚糖N-GS0HPCS分散液滴加在电极表面上，室温下晾干成膜；
(2 )滴加6 μ?的抗体孵化物Ab-Ag@SrFe12019溶液于电极表面，超纯水冲洗，4°C冰箱中晾干；
(3)滴加6PL、质量分数为2 %的BSA溶液于电极表面，超纯水冲洗，4°C冰箱中晾干；
(4)滴加6μ?、0.001-35 ng/mL的不同浓度的乳腺癌易感基因抗原标准溶液至电极表面，超纯水冲洗，4 V冰箱中晾干；
(5 )滴加6 μ?抗体孵化物Ab-Ag@SrFe12019溶液于电极表面，超纯水冲洗，4°C冰箱中晾干。
[0016]实施例3—种基于片状锶铁氧体双重放大的乳腺癌易感基因免疫传感器的制备
(1)将直径为4 mm的玻碳电极用A1203抛光粉打磨，超纯水清洗干净，将6 μ?、0.1 ~ 3
mg/mL氮掺杂石墨烯@羟丙基壳聚糖N-GS0HPCS分散液滴加在电极表面上，室温下晾干成膜；
(2 )滴加6 μ?的抗体孵化物Ab-Ag@SrFe12019溶液于电极表面，超纯水冲洗，4°C冰箱中晾干；
(3)滴加6PL、质量分数为0.5 ~ 3.5溶液于电极表面，超纯水冲洗，4°C冰箱中晾干；
(4)滴加6μ?、0.001-35 ng/mL的不同浓度的乳腺癌易感基因抗原标准溶液至电极表面，超纯水冲洗，4 V冰箱中晾干；
(5 )滴加6 μ?抗体孵化物Ab-Ag@SrFe12019溶液于电极表面，超纯水冲洗，4°C冰箱中晾干。
[0017]实施例4氮掺杂石墨烯@羟丙基壳聚糖N-GS0HPCS分散液的制备
(1)氮掺杂石墨烯N-GS的制备
将0.5 mg氧化石墨烯分散于1 mL的N，N-二甲基甲酰胺中，超声30 min后，将氧化石墨烯的N，N-二甲基甲酰胺分散液于153°C下加热0.5 h，将所得产品在7500 r/min离心10min,分离得到N-GS ；
(2)氮掺杂石墨烯@羟丙基壳聚糖N-GS0HPCS分散液的制备将1 mg N-GS与1 mL、0.1 mg/mL轻丙基壳聚糖溶液进行混合，超声1 h，得到N-GSOHPCS。
[0018]实施例5氮掺杂石墨烯@羟丙基壳聚糖N-GS0HPCS分散液的制备
(1)氮掺杂石墨烯N-GS的制备
将0.5 mg氧化石墨烯分散于2 mL的N，N-二甲基甲酰胺中，超声30 min后，将氧化石墨烯的N，N- 二甲基甲酰胺分散液于153°C下加热2 h，将所得产品在8500 r/min离心10min