一种猪Sox6蛋白的体外表达及其多克隆抗体的制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种猪Sox6蛋白的体外表达、多克隆抗体的制备的方法。该体外表达方法包括：设计引物PCR扩增猪Sox6基因；构建大肠杆菌重组表达载体pET-30a(+)-pSox6；将构建的且经DNA测序鉴定正确的重组表达载体pET-30a(+)-pSox6转化到大肠杆菌Rosetta(DE3)中；构建猪Sox6重组表达菌株；通过重组菌株诱导表达条件的优化最大限度的获得重组猪Sox6蛋白；镍柱亲和层析法纯化得到高纯度的重组猪Sox6蛋白。多克隆抗体的制备包括：以纯化的重组猪Sox6蛋白为抗原多次注射免疫大鼠获得猪Sox6多克隆抗体，采用ELISA法测定抗体效价和Western blot法鉴定抗体特异性。通过本发明方法，实现了猪Sox6蛋白的体外表达和制备出了抗体效价高、抗体特异性良好的猪Sox6多克隆抗体，完全可以满足相关实验的需要。
【专利说明】一种猪Sox6蛋白的体外表达及其多克隆抗体的制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物工程【技术领域】，特别涉及一种猪S〇x6蛋白的体外表达及其多克 隆抗体的制备方法。
【背景技术】
[0002] 猪肉是当今世界消费量最大的肉类产品。传统的饮食习惯使猪肉及猪肉制品长期 以来占据着我国肉类消费的榜首。但随着人们生活水平的提高，消费者对猪肉品质的要求 也越来越高。猪肉品质与肌纤维类型密切相关。提高I型肌纤维在肌肉中的比例可有效地 改善猪肉品质。Sox6是转录因子Sox基因家族的重要成员，参与肌纤维类型转化的调节，影 响肌肉中I型肌纤维的比例。因此，Sox6在猪肉品质调控方面有潜在的应用。天然猪Sox6 存在于多种组织中，且以骨骼肌中的含量最丰富，但分离纯化难度大，而化学合成猪Sox6 成本高，所以利用基因工程技术制备重组猪Sox6是解决上述问题的一个有效途径。
[0003] 利用基因工程技术制备重组蛋白具有广阔的应用前景。到目前为止，已发展了多 种蛋白质表达系统，如原核表达系统、酵母表达系统、1?等真核细胞表达系统等。大肠杆菌 表达系统是最常用的一套原核表达系统，具有遗传背景和生化特性清楚、生长快，成本低、 表达量高、表达产物分离纯化相对简单和便于工业化生产等优点。长期以来，人们用大肠杆 菌表达系统制备了无数种重组蛋白。
[0004] 申请号：201410006972.1，发明名称：一种克隆猪Sox6基因编码区全序列的方法 的专利申请公开了猪Sox6基因编码区全序列，其完整编码区的核苷酸序列如该申请中SEQ IDNo. 1所示，其编码氨基酸序列如该申请中SEQIDNo. 2所示。但猪Sox6功能研究和应 用中迫切需要开发低成本、高产率、易纯化的制备重组猪Sox6的方法。猪Sox6蛋白质表达 水平检测也迫切需要开发效价高、特异性好的猪Sox6多克隆抗体的制备方法。
【发明内容】
[0005] 本发明要解决的技术问题是提供一种低成本、高产率、易纯化的猪Sox6蛋白体外 表达的制备方法，另外还提供一种效价高、特异性好的猪Sox6蛋白多克隆抗体的制备方 法。
[0006] 本发明公开了一种猪Sox6蛋白的体外表达方法，具体为：
[0007] (1)构建用于表达C端融合6XHis-Tag的重组猪Sox6的重组表达载体；
[0008] (I. 1)引物设计及PCR反应：
[0009]设计的上游引物（pET-30a(+)-pSox6F)为5, -CCCAATTCCATATG. TCTTCCAAGCAAGCCACCTCTC-3'（下划线为NdeI酶切位点，加粗部分为起始密码子），下游引 物（pET-30a(+)-pSox6R)为 5, -AAACTCGAGGTTGGCACTGACAGCCTCTGG-3,(下划线为XhoI 酶切位点）；
[0010] 以本实验保存的含猪Sox6基因完整编码区的pMD19T-pS0X6质粒为模板进行猪 Sox6的PCR扩增（见申请号：201410006972. 1，发明名称：一种克隆猪Sox6基因编码区全序 列的方法hPCR反应体系为：ddH20 20μ1，上下游引物（ΙΟμπι)各1μl，cDNA3μl，2XTaq PCRmastermix25μ1(总反应体系为50μI)。PCR反应条件为：95°C预变性3min，然后进 行 95°C30s，55°C30s，72°C3min，共 35 个循环，最后再 72°C延伸IOmin;
[0011] (1. 2)上述PCR产物经1 %的琼脂糖凝胶电泳分析并切胶回收，回收产物用NdeI 和XhoI限制性内切酶双酶切后连接到经同样双酶切的原核表达载体pET-30a(+)的NdeI和XhoI位点上（参见Novagen公司载体图谱）；
[0012] (1. 3)获得的重组表达载体pET-30a(+)-pSox6,经酶切鉴定正确后，再经DNA测序 验证其序列正确性；
[0013] (2)重组表达菌株的构建
[0014] 将验证正确的重组表达载体pET_30a(+) _pSox6经化学法转化到大肠杆菌株 Rosetta(DE3)中，在LB固体平板（含SOyg/ml卡那霉素）上37°C培养，挑取单菌落到4ml LB(含50μg/ml卡那霉素）液体培养基中，37°C、250rpm震荡培养过夜，按850μ1菌液加 入150μ1灭菌甘油，混匀后-80°C冰箱保存，保存的菌株即为重组表达菌株；
[0015] (3)猪Sox6的诱导表达及纯化
[0016] (3. 1)猪Sox6的诱导表达
[0017] 将步骤⑵中保存的重组表达菌株按照1:500接种到4ml LB (含50 μ g/ml卡那 霉素）液体培养基中，37°C、250rpm震荡培养过夜，按I :100转接到15ml LB (含SOyg/ml 卡那霉素）液体培养基中，37°C、280rpm至菌液OD6c?达到0. 4-0. 6，在30°C下于不同的IPTG 浓度（〇?3mmol/L)和不同的诱导时间（0?8h)进行诱导表达。分别收取不同条件诱导 表达后的Iml菌液，离心后弃上清，再各加入50 μ I 1XSDS-PAGE上样缓冲液，KKTC加热5 分钟使蛋白质变性，置于冰中冷却，各取5μ 1进行SDS-PAGE电泳，经凝胶成像系统分析后 确定猪Sox6最优表达条件；
[0018] (3. 2)猪Sox6蛋白的纯化
[0019] 将步骤⑵中保存的重组表达菌株按照1:500接种到4mlLB(含50μg/ml卡那霉 素）液体培养基中，37°C、250rpm震荡培养过夜，按1:100比例转接到50mlLB(含50μg/ ml卡那霉素）液体培养基中，37°C、280rpm至菌液OD6c?达到0. 4-0. 6,加入lmmol/LIPTG 诱导表达5h，IOOOOrpm离心10分钟后弃上清，收集沉淀，向沉淀中加入3ml的盐酸胍裂解 液（IOOmM磷酸二氢钠，300mM氯化钠，6M盐酸胍，pH8. 0)裂解1小时至溶液澄清，IOOOOrpm 离心15分钟，收集上清，上清经0. 45μm滤膜过滤后，使用镍柱亲和层析法对猪Sox6蛋白 进行纯化，收集纯化蛋白，-80°C保存备用；
[0020] 本发明猪Sox6多克隆抗体由以下方法制备：
[0021] 按照BCA蛋白浓度测定试剂盒说明书对纯化后重组猪Sox6蛋白的蛋白浓度进行 测定。将纯化后的重组猪Sox6蛋白作为抗原免疫大鼠。大鼠免疫前断尾采血3ml，收集血 清作为阴性血清。第一次免疫用300μg纯化的重组猪Sox6蛋白与等体积的弗氏完全佐剂 乳化后免疫大鼠，2周后用200μg纯化的重组猪Sox6蛋白与等体积的弗氏不完全佐剂乳化 后第二次免疫大鼠，每隔10天再各用200μg纯化的重组猪Sox6蛋白2次加强免疫，总共 4次免疫，最后一次加强免疫一周后采血，收集抗血清；阴性血清作为阴性对照，ELISA法测 定抗体效价，Western blot测定抗体特异性。
[0022] 在本发明的技术方案中，通过构建设计引物亚克隆猪Sox6基因，大肠杆菌重组表 达载体pET-30a(+)-pS〇x6的构建；将构建的重组表达载体pET-30a(+)-pS〇x6转化到大肠 杆菌菌株Rosetta (DE3)中，构建表达猪Sox6蛋白的重组菌株；对重组菌株进行诱导表达， 纯化重组猪Sox6蛋白，以纯化的重组猪Sox6蛋白为抗原，采用常规多克隆抗体制备方法制 备猪Sox6多克隆抗体。通过本发明的方法，实现了猪Sox6蛋白的体外表达和制备出了效 价高、特异性好的猪Sox6多克隆抗体，完全可以满足相关实验的需要。
【专利附图】
【附图说明】
[0023] 下面结合附图对本发明作进一步说明：
[0024] 图1是PCR扩增猪Sox6基因的琼脂糖凝胶电泳示图，其中M为DNA标准分子量； 1为PCR扩增产物；2为ddH20为模板的阴性对照；
[0025] 图2是不同的IPTG诱导浓度对Sox6蛋白表达影响的SDS-PAGE示图，其中M为蛋 白质标准分子量；1为不含IPTG诱导菌体总蛋白；2为0. 25mmol/L IPTG诱导后的菌体总 蛋白；3为0. 5mmol/L IPTG诱导后的菌体总蛋白；4为0. 75mmol/L IPTG诱导后的菌体总 蛋白；5为lmmol/L IPTG诱导后的菌体总蛋白；6为2mmol/L IPTG诱导后的菌体总蛋白；7 为3mmol/L IPTG诱导后的菌体总蛋白；其中箭头所标注为目的蛋白位置；
[0026] 图3是不同的诱导时间对猪Sox6蛋白表达影响的SDS-PAGE示图，其中M为蛋白 质标准分子量；1为诱导〇小时的菌体总蛋白；2为诱导1小时的菌体总蛋白；3为诱导3小 时的菌体总蛋白；4为诱导4小时的菌体总蛋白；5为诱导5小时的菌体总蛋白；6为诱导6 小时的菌体总蛋白；7为诱导8小时的菌体总蛋白；其中箭头所标注为目的蛋白位置；
[0027] 图4是纯化后重组猪Sox6蛋白的SDS-PAGE示图，其中M为蛋白质标准分子量，1 为纯化后的重组猪Sox6蛋白，2为IPTG诱导5小时后的菌体总蛋白；3为IPTG诱导前的菌 体总蛋白；
[0028] 图5是anti-His (C-term)单克隆抗体为一抗鉴定纯化后重组猪Sox6的Western blot示图；
[0029] 图6是ELISA法评定抗体效价示图；
[0030] 图7是制备的多克隆抗体与重组猪Sox6蛋白的Western blot示图。
【具体实施方式】
[0031] 下面将结合本发明中的实施例和附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、 完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基 于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其 他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0032] 实施例I :PET30a(+)-pSox6重组质粒的构建与鉴定
[0033] 以本实验保存的含猪Sox6基因完整编码区的pMD19T-pS〇x6质粒为模板进行PCR 扩增，PCR反应体系（总反应体系50μ1)为：CldH2O20μ1，上下游引物（10μm)各1μ1， cDNA3yl，2XTaqPCRmastermix25μ1。PCR反应条件为：95°C预变性 3min，然后进行 95°C30s，55°C30s，72°C3min，共 35 个循环，最后再 72°C延伸lOmin。PCR产物经 1% 的琼 脂糖凝胶电泳进行鉴定。由图1可见，在2250?3000bp间有一清晰的亮带，与预期大小吻 合。
[0034]PCR产物参考OMEGA公司PlasmidMiniKitI核酸胶回收试剂盒说明书进行回 收。回收后的PCR产物经NdeI和XhoI双酶切后通过T4DNA连接酶插入到经同样双酶 切的pET30a(+)表达载体中，16°C水浴连接6小时，构建pET30a(+)-pSox6重组质粒，将重 组质粒转化到大肠杆菌菌株DH5a，在LB固体平板（含SOyg/ml卡那霉素）上于37°C 培养，挑选单菌落经酶切鉴定正确后，再通过DNA测序验证其序列正确性。测序结果表 明，所获得的猪Sox6基因编码区序列与预计相符。说明重组质粒构建成功并将其命名为 pET30a(+)-pSox6。
[0035] 猪Sox6基因编码区（不含终止密码子）序列与pET30a(+)连接克隆测序结果为 SEQID. 1，其氨基酸序列为SEQID. 2。
[0036] 实施例2:猪Sox6在大肠杆菌中的表达
[0037] 1.获得表达猪Sox6的重组表达菌株
[0038] 将实施例1中经酶切鉴定和测序验证正确的pET30a(+) -pS〇X6重组质粒按照 OMEGA公司的E.Z.N.A质粒小量提取试剂盒从克隆菌DH5α中提取出来，转化到大肠杆菌表 达菌株Rosetta(DE3)感受态中，在LB固体平板（含50μg/ml卡那霉素）上37°C培养筛 选重组子，此时获得重组子为表达猪Sox6的基因工程菌。随机选取1个单菌落进行划线培 养，取少量长出的划线培养菌接种于4mlLB(含50μg/ml卡那霉素）液体培养基中，37°C、 250rpm振荡培养过夜，然后按850μ1菌液加入150μ1灭菌甘油，混匀后贮存于-80°C冰 箱，得到表达猪Sox6重组表达菌株。
[0039] 2.猪Sox6重组蛋白的表达
[0040] 将步骤1得到的猪Sox6重组表达菌株按1:500接种到4ml LB(含50 μ g/ml卡那 霉素）液体培养基中，37°C、250rpm振荡培养过夜，活化重组表达菌株。
[0041] 2.IIPTG(异丙基硫代半乳糖苷）浓度对猪Sox6蛋白质表达的影响
[0042] 将活化的重组表达菌株按1:100分别接种于15mlLB(含50μg/ml卡那霉素） 液体培养基中，37°C、280rpm振荡培养至OD6tltl为0. 4-0. 6时加入IPTG，使其终浓度分别为 0mmol/L>0. 25mmol/L>0. 5mmol/L>0. 75mmol/L>l. 0mmol/L>2. 0mmol/L>3.Ommol/L,30 °C> 280rpm诱导培养5小时后各取Iml菌液离心取沉淀，用50μIIX蛋白上样缓冲液重悬菌 体，100°C煮沸5分钟，置于冰中冷却，各取5μ1进行SDS-PAGE电泳，考马斯亮蓝染色、脱色 后经凝胶成像系统分析，确定目的蛋白占总蛋白的比例。
[0043]实验结果表明（图 2),IPTG在 0· 25mmol/L、0. 5mmol/L、0. 75mmol/L、I. 0mmol/L、 2. 0mmol/L、3. 0mm〇l/L终浓度条件下，目的蛋白占总蛋白的比例差别不大。后续实验所采用 的IPTG终浓度为I. 0mmol/L。
[0044] 2. 2诱导时间对猪Sox6蛋白质表达的影响
[0045] 将活化的重组表达菌株按1:100分别接种于15mlLB(含50μg/ml卡那霉素） 液体培养基中，37°C、280rpm振荡培养至OD6tltl为0. 4-0. 6时加入IPTG，使其终浓度分别为 I.Ommol/L，30°C、280rpm分别在诱导培养0小时、1小时、3小时、4小时、5小时、6小时、8小 时各取Iml菌液离心取沉淀，用50μIIX蛋白上样缓冲液重悬菌体，KKTC沸水水浴5分 钟，置于冰中冷却，各取5μ1进行SDS-PAGE电泳，考马斯亮蓝染色、脱色后经凝胶成像系统 分析，确定目的蛋白占总蛋白的比例。
[0046]实验结果表明（图3)，诱导时间为1小时、3小时、4小时、5小时、6小时、8小时 的条件下，目的蛋白占总蛋白的比例分别为22. 41%、26. 1%、33. 77%、34. 57%、32. 91%、 30. 69%。说明诱导时间为5小时，目的蛋白占总蛋白比例最1?。因此，后续实验选择30°C、 lmmol/LIPTG诱导5小时表达猪Sox6。
[0047] 实施例3:重组猪Sox6的分离纯化及鉴定
[0048] 将活化的重组表达菌株按1:100接种于50mlLB(含50μg/ml卡那霉素）液体培 养基中，37°C，280rpm振荡培养至0D_为0. 4-0. 6时加入IPTG，使其终浓度为分I.Ommol/ L，30°C、280rpm诱导5小时后IOOOOrpm离心10分钟弃掉上清，向沉淀中加入3ml的盐酸胍 裂解液（IOOmM磷酸二氢钠，300mM氯化钠，6M盐酸胍，pH8.0)在冰上裂解1小时至溶液澄 清；4°C，IOOOOrpm离心15分钟，收集上清，上清经0. 45μm滤膜过滤去除杂质。猪Sox6蛋 白的纯化方法参照上海生物工程技术有限公司的Ni-IDA琼脂糖亲和层析柱中的变性条件 下（Ni-Denature-GuHCl法）的方法纯化。具体操作为：10倍柱体积的Ni-Denature-urea 缓冲液（IOOmM磷酸二氢钠，300mM氯化钠，8M尿素，pH8.0)平衡柱子，控制流速为lml/ min;经滤膜过滤后的Iml蛋白上清样经过纯化柱，控制流速为lml/min; 10倍柱体积的 Ni-Denature-urea缓冲液冲洗柱子，控制流速为lml/min;5倍柱体积的Ni-Denature-250 缓冲液（IOOmM磷酸二氢钠，300mM氯化钠，250mM咪唑，PH8. 0)洗脱纯化柱，控制流速为 lml/min，收集洗脱液得纯化蛋白，-80°C保存。取少量蛋白进行SDS-PAGE电泳纯度分析和 WesternBlot鉴定。
[0049] 实验结果表明，纯化后的重组猪Sox6蛋白为单一的一条带，其纯度大于90% (图4);经anti-His(C-term)单克隆抗体（美国Invitrogen公司产品）对纯化蛋白进行 Westernblot鉴定后确定其为猪Sox6蛋白（图5)。
[0050] 实施例4 :猪Sox6蛋白的多克隆抗体的制备及抗体效价和特异性评定
[0051] 经实施例3WesternBlot步骤鉴定后，证实了纯化的蛋白质为重组猪Sox6蛋白。 将纯化后的重组猪Sox6蛋白作为抗原免疫大鼠，纯化后重组猪Sox6蛋白的蛋白浓度按照 BCA蛋白浓度测定试剂盒说明进行测定。大鼠免疫前断尾采血3ml，收集血清作为阴性血 清。第一次免疫用300μg纯化的重组猪Sox6蛋白与等体积的弗氏完全佐剂乳化后免疫大 鼠，2周后用200yg纯化的重组猪Sox6蛋白与等体积的弗氏不完全佐剂乳化后第二次免疫 大鼠，每隔10天再各用200μg纯化的重组猪Sox6蛋白2次加强免疫，总共4次免疫，最后 一次加强免疫注射Sox6蛋白一周后采血，收集抗血清；用ELISA法（阴性血清作为阴性对 照）测定抗体效价，用Westernblot方法测定抗体特异性。
[0052] 稀释后的抗血清在490nm吸光度大于免疫前（阴性对照）血清2. 1倍时的最高稀 释倍数定义为抗体的效价。实验结果表明，经ELISA法测定制备的Sox6多克隆抗体抗血清 效价约为1:40960(图6);制备的Sox6多克隆抗体的抗体特异性经Westernblot分析得 出其特异性良好（图7)。
[0053] 上述实施方式旨在举例说明本发明可为本领域专业技术人员实现或使用，对上述 实施方式进行修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，故本发明包括但不限于 上述实施方式，任何符合本权利要求书或说明书描述，符合与本文所公开的原理和新颖性、 创造性特点的方法、工艺、产品，均落入本发明的保护范围之内。
【权利要求】
1. 一种猪Sox6蛋白体外表达的方法，其特征在于，包括以下步骤： a. 以含猪Sox6基因完整编码区的pMD19T-pS〇x6质粒为模板PCR扩增猪Sox6基因； b. 构建用于表达猪Sox6蛋白的大肠杆菌重组表达载体； c. 利用步骤b所得的重组表达载体经化学法转化到大肠杆菌株Rosetta (DE3)中，构建 重组表达菌株； d. 培养步骤c所得重组表达菌株至0D_达到0. 4-0. 6,加入诱导剂IPTG，诱导表达猪 Sox6蛋白； e. 纯化诱导表达的猪Sox6蛋白。
2. 如权利要求1所述的猪Sox6蛋白体外表达的方法，其特征在于步骤a中，用于PCR 扩增的上游引物为 5' -CCCAATTCCATATGTCTTCCAAGCAAGCCACCTCTC-3'，下游引物为 5' -AAAC TCGAGGTTGGCACTGACAGCCTCTGG-3,。
3. 如权利要求1或2所述的猪Sox6蛋白体外表达的方法，其特征在于步骤a中PCR 反应体系为：ddH20 20 ii 1，上下游引物各 lii l，cDNA l，2XTaqPCR master mix 25ii 1 ; PCR反应条件为：95°C预变性3min，然后进行95°C 30s，55°C 30s，72°C 3min，共35个循环， 最后72°C延伸lOmin。
4. 如权利要求1所述的猪Sox6蛋白体外表达的方法，其特征在于步骤b中所使用的大 肠杆菌表达载体为pET-30a(+)，克隆猪Sox6基因的插入位点为Nde I和Xho I酶切位点。
5. 如权利要求4所述的猪Sox6蛋白体外表达的方法，其特征在于PCR产物经1 %的琼 脂糖凝胶电泳分析并切胶回收，回收产物用Nde I和Xho I限制性内切酶双酶切后连接到 经同样双酶切的大肠杆菌表达载体pET_30a(+)的Nde I和Xho I位点上。
6. 如权利要求1所述的猪Sox6蛋白体外表达的方法，其特征在于所述步骤d中，诱导 表达条件为IPTG终浓度1. Ommol/L，诱导表达5小时。
7. 如权利要求1或6所述的猪Sox6蛋白体外表达的方法，其特征在于步骤d、e中诱 导纯化方法为：将步骤c中的Sox6重组表达菌株按照1:500接种到4ml LB液体培养基中， 37°C、250rpm震荡培养过夜，按1:100比例转接到50ml LB液体培养基中，37°C、280rpm至 菌液〇D_达到0. 4-0. 6,采用诱导表达条件为IPTG终浓度1. 0mm〇l/L，诱导表达5小时，表 达完成后，l〇〇〇〇rpm离心10分钟后弃上清，收集沉淀，向沉淀中加入3ml的盐酸胍裂解液裂 解1小时至溶液澄清，lOOOOrpm离心15分钟，收集上清，上清经0. 45 y m滤膜过滤后，使用 镍柱亲和层析法对猪Sox6蛋白进行纯化，收集纯化蛋白，-80°C保存备用； 其中，所述LB液体培养基中含有50 y g/ml卡那霉素；所述盐酸胍裂解液含100mM磷酸 二氢钠、300mM氯化钠、6M盐酸胍，pH为8. 0。
8. 如权利要求1所述的猪Sox6蛋白体外表达的方法，其特征在于，所述猪Sox6蛋白C 端带有6个组氨酸标签。
9. 一种猪Sox6多克隆抗体的制备方法，其特征在于：将权利要求1-8制得的重组猪 Sox6蛋白作为抗原免疫Sprague-Dawley大鼠，第一次免疫采用300 ii g重组猪Sox6蛋白与 等体积的弗氏完全佐剂乳化后注射大鼠，2周后用200 y g重组猪Sox6蛋白与等体积的弗氏 不完全佐剂乳化后第二次免疫大鼠，在以后20天内再次进行2次加强免疫，每10天1次， 总共4次免疫，最后一次免疫7天后采血，收集抗血清。
10. 如权利要求9所述的猪Sox6多克隆抗体的制备方法，其特征在于在免疫前对大鼠 端尾采血3ml，收集血清作为阴性血清，以阴性血清作为阴性对照，用ELISA法对猪Sox6多 克隆抗体进行抗体效价评定、用Western blot法评定抗体特异性。
11. 一种根据权利要求9所述的猪Sox6多克隆抗体的制备方法制备的猪Sox6多克隆 抗体。
【文档编号】C07K16/18GK104357474SQ201410553886
【公开日】2015年2月18日 申请日期:2014年10月17日 优先权日:2014年10月17日
【发明者】黄志清, 陈小玲, 徐孟, 温万雪, 王晓燕, 常帅, 陈代文, 余冰 申请人:四川农业大学