GGAAACAGATTTGAACTCAATTTAACCCAACAGCCTAAAGGTGTAAGCTT
[0028]在NCBI中比对分析，重组质粒pUC-S中插入的DNA片段的核苷酸序列与鸭疫里默氏菌Yb2株(CP007204.1)和153株(CP007504.1)的相关基因在核苷酸水平的相似性100%。
[0029](2)重组表达载体pET32b_S的构建
[0030]将重组质粒pUC-S和原核表达载体pET32b( + )分别经限制性内切酶BamH I和HindIII双酶切、琼脂糖电泳后切胶回收的产物连接，转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞，筛选获得含有重组表达质粒pET32b-S的阳性克隆菌株。
[0031](3)鸭疫里默氏菌肽酶S8基因的原核重组蛋白的诱导表达与纯化
[0032]将含有重组表达质粒pET32b-S的E.coli BL21 (DE3)用含100yg/ml氨苄青霉素的LB培养至OD值达0.6-0.8时用ImM IPTG诱导4小时，在培养菌液上清液中获得可溶性的重组蛋白。用组氨酸标签蛋白的纯化试剂盒纯化获得分子大小约为50kDa的重组蛋白。
[0033]重组蛋白蛋白作为酶联免疫检疫方法的检测抗原。
[0034]实施例2鸭疫里默氏菌感鸭的酶联免疫检疫方法
[0035]1、鸭血清的收集
[0036]待检疫鸭经颈静脉或翅静脉采血2_3ml，室温下静置I小时凝固，4°C条件下4000rpm离心10分钟，分离血清。
[0037]2、酶联免疫检测抗体的过程
[0038](1)将检测用0.051 ρΗ9.6碳酸盐缓冲液(CBS)稀释至10.0yg/ml，酶标板每孔加入100yl，37°C 振荡包被 2h;
[0039](2)用含0.05%吐温-20的0.0lM pH7.4磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤3次，每次3min；
[0040](3)酶标板每孔加入200μ1 2 %牛血清白蛋白(BSA)，37 °(:振荡封闭30min，去液体后按(2)洗涤；
[0041 ] (4)将待检鸭血清用0.0lM pH7.4PBS按1:200稀释，每孔加入10(^1，37°(:振荡作用45min，去液体后按(2)洗涤；
[0042](5)每孔加入1:5000的辣根过氧化物酶标记的山羊抗鸭IgG溶液100μ1，37Γ振荡作用45min，去液体后按(2)洗涤；
[0043](6)每孔加入TMB显色液100yl，37°C避光振荡作用15min;
[0044](7)每孔加入终止液(2M硫酸)50μ1，混匀后在酶标仪上测OD45Q值。
[0045]3、鸭疫里默氏菌感鸭的检疫标准
[0046]在标准阴性、阳性血清对照及空白对照成立的条件下，鸭血清检测的OD45q值2
0.130,则表明血清来源于鸭疫里默氏菌感染鸭;检测的OD45Q值<0.130，则表明血清来源于没有感染过鸭疫里默氏菌的鸭。
[0047]实施例3人工感染及免疫鸭的检疫
[0048]1、人工感染鸭疫里默氏菌鸭的检疫
[0049]10日龄鸭在实验条件下人工感染鸭疫里默氏菌AF株(血清2型)后，第5、10、15、30、60、90、120、150天的血清利用本发明公开的酶联免疫检疫方法进行检测，均判定为感染阳性;人工感染3(:株(血清1型)后，5、10、15、30、60、90、120、150天的血清的检测也均判定为感染阳性。因此，本检疫方法不受感染菌株血清型的影响，鸭感染鸭疫里默氏菌后5-150天均可检疫为感染阳性。
[0050]2、鸭疫里默氏菌灭活菌苗免疫鸭的检疫
[0051]20只10日龄健康鸭分为2组，每组10只；第一组每只鸭颈部皮下免疫注射AF株(血清2型)灭活菌苗0.5ml，第二组免疫SC株(血清I型)灭活菌苗;所有免疫鸭在免疫后第5-150天的血清检测均为阴性。
[0052]以上结果表明，公开的酶联免疫检疫方法能检疫出鸭疫里默氏菌感染5天-150天的鸭，检疫不受感染鸭疫里默氏菌血清型和免疫灭活菌苗的影响。
[0053]实施例4检疫应用实例
[0054]实例I某杂交肉鸭群在18日龄感染鸭疫里默氏菌发病，发病率和死亡率分别为50 %和24 %左右，病死鸭表现为纤维素性心包炎、气囊炎和肝周炎。存活鸭在45日龄及70日龄各随机采集50只的静脉血并分离血清，用本发明的酶联免疫检疫方法进行检疫，鸭疫里默氏菌感染的阳性率分别为28% (14/50)和24% (12/50)。
[0055]实例2某杂交肉鸭群在7日龄免疫注射鸭疫里默氏菌二价灭活菌苗(血清I型和2型)，在饲养过程中未发生异常;在45日龄及70日龄各随机采集50只的静脉血并分离血清，用本发明的酶联免疫检疫方法进行检疫，鸭疫里默氏菌感染的阳性率分别为2% (1/50)和O(0/50) ο
[0056]实例3对农贸市场的肉鸭(大约为65-90日龄)85只，分别采集静脉血并分离血清，用本发明的酶联免疫检疫方法进行检疫，其中9只为阳性，鸭疫里默氏菌感染的阳性率为10.59%。
[0057]综上应用实例，本发明的酶联免疫检疫方法的检测结果与实际情况一致，表明该方法可以有效的用于鸭疫里默氏菌感染鸭的检疫，检疫效果好，灵敏性和专属性好。
【主权项】
1.一种鸭疫里默氏菌感染鸭的酶联免疫检疫方法，包括以下步骤: (1)将鸭疫里默氏菌肽酶S8蛋白10.0yg/ml作为检测抗原在37°C振荡包被聚苯乙烯酶标板2小时； (2)洗涤后用2%牛血清白蛋白在37 °C封闭30分钟； (3)洗涤，将待检血清用0.0lMpH 7.4磷酸盐缓冲液按I: 200稀释后加入酶标板孔反应45分钟; (4)洗涤，加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗鸭IgG溶液反应45分钟； (5)洗涤，加入TMB显色液避光反应15分钟； (6)加入终止液后混匀，酶标仪在波长450nm测定吸光值(0D45Q值)。2.如权利要求1所述的检疫方法，所述检测抗原为:(I)鸭疫里默氏菌肽酶S8基因的全基因或部分序列的原核和真核表达的重组蛋白或(2)从鸭疫里默氏菌培养物中分离纯化的肽酶S8蛋白及其片段。3.如权利要求1所述的检疫方法，当鸭血清检测的OD45q值20.130，则表明鸭感染鸭疫里默氏菌;检测的0D450值<0.130，则表明鸭未感染鸭疫里默氏菌。4.如权利要求1所述的检疫方法，步骤(2)至(5)中所述的洗涤，其洗涤液为含0.05%吐温-20的0.0lM pH7.4磷酸盐缓冲液。5.如权利要求1所述的检疫方法，步骤(2)中所述2%牛血清白蛋白，其稀释液为0.0lMPH7.4磷酸盐缓冲液。6.如权利要求1所述的检疫方法，步骤(6)中所述终止液为2.0M硫酸。
【专利摘要】本发明公开了一种鸭疫里默氏菌感染鸭的酶联免疫检疫方法，该方法包括用鸭疫里默氏菌肽酶S8(peptidase？S8)蛋白包板、洗板、封板、加样、加入酶标二抗及底物液后加入终止液，测定吸光度等程序步骤，对鸭血清中抗鸭疫里默氏菌肽酶S8蛋白的抗体水平(利用吸光度表示)进行测定，利用抗体水平的测定值与参考值进行比较，测定值大于参考值就表示被检测的血清来源于鸭疫里默氏菌感染鸭。
【IPC分类】G01N33/569
【公开号】CN105675862
【申请号】CN201610036604
【发明人】李继祥, 范梦男, 周琴, 李昕, 江胜, 李欢
【申请人】西南大学
【公开日】2016年6月15日
【申请日】2016年1月20日