测：用该试剂盒检测了经实施例1中的引物对M0MP-F/M0MP-R做了PCR 鉴定证明均为阳性的92份感染鹦鹉热衣原体的SPF鸡喉头拭子，判断。灵敏度以真阳性率表 示，即灵敏度（％) =[阳性数/(真阳性数+假阴性数)]x 100%。
[0145] 2、特异性检测：用该试剂盒检测了经实施例1中的引物对M0MP-F/M0MP-R做了PCR 鉴定证明均为阴性的92份SPF鸡血清，判断。特异性以真阴性率表示，即特异性（％ )=[阴性 数/(真阴性数+假阳性数)]x 100%。检测结果如下：
[0146]
[0147] 注"+"代表阳性；代表阴性。
[0148] 3、92份由PCR检测阳性的样品，ELI SA试剂盒检出88份阳性，4份阴性;92份由PCR检 测阴性的样品，ELISA试剂盒检出0份阳性，92份阴性。用SPSS软件对两种方法的做X2检验 (McNemar Test)，P>0.05,表明两种方法没有显著差别，同时初步得出本试剂盒的灵敏度 为95.7.3%，特异性为100%。
[0149] 实施例9重复性检测
[0150] 按照ELISA操作方法，以同一试剂盒对8份禽血清(4份阴性，4份阳性)各重复测定3 次；同时，用同一批不同试剂盒和不同批次的试剂盒分别对8份禽血清进行重复检测各3次， 计算其各自0D450的平均值，按照CV(%) = (SD/AV 0D450)x100 %计算该ELISA试剂盒的板 内、批内和批间变异系数CV值，验证该ELISA试剂盒的重复性。检测结果如下：
[0151]
[0152] ELISA试剂盒板内和批内变异系数均小于10%，批间变异系数均小于15%。
[0153] 实施例10禽衣原体病酶联免疫抗体检测试剂盒标准体系的建立
[0154] 1、临界值的建立:根据优化确立的ELISA试验条件，检测146份人工感染的鹦鹉热 衣原体阳性血清和108份SPF鸡阴性血清进行检测，计算各血清的0D450与阳性对照0D450的 比值PI，以1-特异性为横坐标，敏感度为纵坐标，运用SPSS 20.0软件绘制R0C曲线，统计尤 登指数(Youden's Index，YI)，YI =敏感性+特异性-1，选择尤登指数最大处为最佳临界点， 此点对应的敏感性和特异性最高，确定该处的PI值为试剂盒临界值(CUT-OFF值）。如图3和 图4所示，经SPSS20.0软件绘制得到R0C曲线，曲线下面积=0.975，尤登指数最大值= 0.837，此点对应的灵敏性为0.911，特异性为0.926，对应坐标点为PI = 16.975。该方法变异 系数约为15%，故确定该试剂盒的⑶T-0FF值PI = 20%。
[0155] 2、检测结果判定标准：待测样本（S)，阳性对照（P)和阴性对照（N)的0D450 = 0D450-0D630和PI值=(样品0D450/阳性对照0D450)x100 %，如果P 2 0.6，N < 0.1则试剂盒 有效。在此基础上PI 2 20%则判定为衣原体阳性。PI <20%则判定为衣原体阴性。
[0156] 虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在 本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因 此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
【主权项】
1. 一种酶联免疫检测禽鹦鹉热衣原体的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括:包被有 鹦鹉热衣原体重组蛋白MOMP的固相载体，酶标抗体，禽鹦鹉热衣原体阴性对照血清，禽鹦鹉 热衣原体阳性对照血清； 所述鹦鹉热衣原体重组蛋白MOMP的氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示。2. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述固相载体包被鹦鹉热衣原体重组蛋 白MOMP后，经抗原保护剂处理，所述抗原保护剂含有2 %的β-l，3/1，6葡聚糖，20 %的甘油和 0.01%的明胶，余量为PBS。3. 根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述固相载体为酶标板，包被有鹦鹉热 衣原体重组蛋白MOMP的酶标板的制备方法为： 1) 以鹦鹉热衣原体6BC株总DNA为模板，使用特异性引物M0MP-F和M0MP-R进行扩增； M0MP-F：AAAGAATTCTTGCCTGTAGGGAACCC； M0MP-R：GGGGTCGACTTAGAATCTGAATTGAG； 2) 将扩增所得片段回收纯化后用EcoRlI和Sail双酶切回收纯化目的片段； 3) 将酶切好的目的片段与用相同酶切的PET28a( + )载体连接获得重组表达质粒； 4) 将重组质粒转化到大肠杆菌BL21 (DE3)内，37°C培养，IPTG诱导表达； 5) 将菌液离心收集沉淀，将沉淀重溶于pH7.2的roS溶液中，经过超声裂解处理后离心 取沉淀。 6) 重复第5)步，获得的沉淀即为重组蛋白包涵体； 7) 将步骤6)的沉淀经尿素溶解、透析复性后，与Ni-NTA琼脂糖凝胶混匀，低温结合； 8) 将结合完毕后的蛋白与Ni-NTA琼脂糖混合物，倒入空Ni-NTA柱，以20mmol/L咪唑溶 液洗涤，除去杂蛋白； 9) 以250mmol/L的咪唑溶液洗脱Ni-NTA柱，收集经SDS-PAGE分析达到95%以上纯化程 度的重组蛋白MOMP洗脱液； 10) 将收集的蛋白洗脱液体装入透析袋中，在20倍体积的PBS溶液中透析去除咪唑，冷 冻抽干获得干粉重组蛋白MOMP; 11) 将重组蛋白干粉以pH9.6、50mM碳酸盐缓冲液稀释为终浓度0.5yg/mL，加入酶标板 各孔，4°C孵育16小时，用洗涤缓冲液PBST冲洗酶标板，再用封闭液(含5%脱脂奶粉的PBST 溶液)封闭，倒掉封闭液，洗涤，甩干； 12) 封闭好的微孔板每孔加入200微升的抗原保护剂，pH7.2溶液37°C孵育4小时后，倒 掉抗原保护剂，洗涤，甩干，晾干，即获得包被有鹦鹉热衣原体重组蛋白MOMP的酶标板。4. 根据权利要求1-3任意一项所述的试剂盒，其特征在于，所述酶标抗体为辣根过氧化 物酶标记的兔抗禽IgG。5. 根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述禽鹦鹉热衣原体阳性对照血清的制 备方法为： 取鹦鹉热衣原体6BC株灭活抗原，将抗原以2SP溶液稀释至蛋白浓度为2mg/mL; 选择8周龄，衣原体抗体为阴性SPF鸡，进行免疫； 首免:将氟氏完全佐剂与衣原体抗原等量混合，充分乳化，取lmL颈部皮下多点注射； 二免:首免后第14天，取氟氏不完全佐剂与衣原体抗原等量混合，充分乳化，取lmL颈部 皮下多点注射； 三免:二免后第7天，同二免方法加强免疫一次； 四免:三免后第7天，肌肉和颈部皮下各注射衣原体抗原lmL; 1周后采血，经衣原体IHA试剂盒测定血清抗体效价，选取效价2 1: 256的SPF鸡，进行心 脏采血，无菌分离血清，水浴灭活，即获得禽鹦鹉热衣原体阳性对照血清。6. 根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述禽鹦鹉热衣原体阴性对照血清的制 备方法为： 选取2~4只SPF鸡，优选2只，分别采血、分离血清，水浴灭活，经过衣原体间接血凝 (IHA)试剂盒检测，收集结果为阴性的禽血清，混合，即为禽鹦鹉热衣原体阴性对照血清。7. 根据权利要求5或6所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括洗涤缓冲液、酶标 抗体稀释溶液、样本稀释缓冲液、显色液和终止液。8. 根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述洗涤缓冲液为含0.5%。吐温-20、 pH7.2的磷酸盐缓冲液(PBST); 所述酶标抗体稀释溶液为含有1. 〇 %牛血清白蛋白、〇. 1%。硫柳汞钠、5 %甘油、5 %海藻 糖的pH7.2的磷酸盐缓冲液； 所述样本稀释缓冲液为含有1 %小牛血清、〇 . 3 % Tri ton-100、0.1%。硫柳汞钠的pH7.2 的磷酸盐缓冲液； 所述终止液为强酸。9. 根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述终止液为蒸馏水配制的出504。10. 根据权利要求8或9所述的试剂盒，其特征在于，所述显色液包括显色剂A和显色剂 B:显色剂A为含1.46 %磷酸氢二钠，0.93 %梓檬酸，0.045 %过氧化氢的水溶液；显色剂B为 含0.03%四甲基联苯胺，0.096%柠檬酸，0.019%乙二胺四乙二酸钠盐，2%DMSO,4%甘油 的水溶液。
【专利摘要】本发明涉及检测试剂盒，具体公开了酶联免疫检测禽鹦鹉热衣原体的试剂盒。本发明通过基因工程表达重组蛋白MOMP，并以此为抗原包被固相载体进行酶联免疫吸附检测。本发明试剂盒使用基因工程表达的高纯度的重组抗原作为包被抗原，特异性高，灵敏性好。且在抗原包被固相载体后用抗原保护剂对包被好的抗原进行保护，延长了抗原的保存时间。此外，本发明使用的酶联抗体为辣根过氧化物酶标记的兔抗禽IgG，可广泛针对禽类，如鸡、鸭、鹅等进行通用性的检测。
【IPC分类】G01N33/569, G01N33/68, G01N33/543
【公开号】CN105606826
【申请号】CN201610082031
【发明人】何诚, 吴宗学, 张强
【申请人】中国农业大学
【公开日】2016年5月25日
【申请日】2016年2月5日