专利名称：一种利用FPLC测定脱氧胞苷激酶(dCK)活性方法
技术领域：
本发明属于一种酶活力测定方法，具体涉及一种脱氧胞苷激酶(dCK)的酶活测定方法。
背景技术：
脱氧胞苷激酶(dCK)是细胞质内的四大激酶之一，它广泛存在于哺乳动物体内及一 些细菌细胞内。细胞体内，dCK可以催化天然核苷的磷酸化，也可催化一些核苷类药物的 磷酸化。研究表明，抗病毒核苷类药物在人体内通过dCK催化进行磷酸化，产生与逆转录 酶结合的底物，而发挥药效。但是，在一些患者体内细胞的dCK含量很低，无法催化核苷 类药物的磷酸化，因而导致了病毒的抗药性。因此，利用从各种来源提取dCK，并将其用 于核苷类似物的体外磷酸化，对核苷类药物的发展来说是一个崭新的领域。故对于从各种 来源纯化的dCK进行酶活表征，是利用dCK进行催化反应的重要步骤。
自1970年以来，有多个专家对于dCK的酶活测定方法进行了研究，主要有放射性 同位素薄层层析色谱法、放射性同位素连续分光光度法以及非放射性反相HPLC色谱法。 其中，放射性同位素薄层层析色谱法的发明年代较早，对现代实验室测量来说是落后且费 时的；放射性同位素连续分光光度法虽然是第一种方法的改进，但是同样也需要用到放射 性同位素，大大增加了时间上和经济上的成本；而非放射性反相HPLC色谱法是2004年 发表的利用高效液相色谱进行dCK酶活测定的一种新方法，简单易懂，简化了以往的复杂 操作，但是其对液相色谱柱要求较高。通过实验发现，应用非放射性反相HPLC色谱法， 在相同条件下进行两次实验，所得的结果存在差异，实验重复性不够。
发明内容
本发明的目的是提供一种脱氧胞苷激酶(dCK)酶活测定方法，该方法克服了以往的 dCK酶活测定方法的繁琐，耗时较长，重复性不高的缺陷。
本发明的利用蛋白质层析系统(FPLC)测定dCK酶活的方法，包括如下步骤
(1) 将反应混合液放入气浴/水浴恒温振荡器中反应后，加入冰甲醇终止反应，冰浴后， 离心，取上清液；
(2) 用Tris-HCI缓冲液稀释上清液，过滤，利用FPLC的反相液相色谱柱进行层析，通过 与空白对比测得CdA减少的量，计算dCK的活性。
所述步骤(1)中的反应液包括2-氯-2-脱氧胞苷(CdA)、三磷酸尿苷(UTP)、氯化 镁MgCl2、氯化钠NaCl、氟化钠NaF、 二硫代苏糖醇DTT、 dCK，浓度分别为0.1 lmmoI/L CdA、 1 1Ommol/LUTP、 l 10mmol/LMgCl2、 10 20mmol/LNaCl、 10 20mmol/LNaF、 1 2mmol/LDTT，优选lmmol/LCdA、 10mmol/LUTP、 10mmol/L MgCl2、 20mmol/LNaCl、 20mmol/L NaF 、 2mmol/L DTT 。
所述步骤(1)中的反应液用0.005 0.02mol/L的Tris-HCl (pH6.0 8.0)溶液定容， 优选0.01 moi/L的Tris-HCl (pH7.4);
所述的脱氧胞苷激酶(dCK)是指从小牛胸腺中提取的dCK;
所述步骤(1)中的反应是指30'C 4(TC， 120 150转条件下，反应2 3小时，反 应后冰浴5 20分钟，优选37°C，摇床转速为150转，反应时间为2小时，反应后冰浴 IO分钟;
所述的歩骤(2)中的层析条件是反相液相色谱柱为RESOURCE" RPClml，洗脱液 A为0.05 0.02mol/L的Tris-HCl缓冲液(pH6.0 8.0)，洗脱液B为乙腈，平衡为5 10 个柱床，冲洗为5 7个柱床，洗脱梯度为洗脱液B在10 20个柱床内由0%线性增加至 100%，流速为l 2ml，优选洗脱液A为O.Olmol/L的Tris-HCl缓冲液(pH7.4)，平衡为 10个柱床，冲洗为7个柱床，洗脱梯度为洗脱液B在20个柱床内由0%线性增加至100 %，流速为1ml;
所述的dCK酶活的计算方法dCK酶活U=CdA反应量(picomol)/蛋白含量(u g) *h， CdA反应量二CdA空白标准量一CdA剩余量；
所述的CdA剩余量的测定为内标法。
本发明提供的方法快速、简便，结果可信，重复性高，为大批量测定氧胞苷激酶(dCK) 酶活，提供依据。
图1为用快速蛋白质层析系统(FPLC)对小牛胸腺dCK催化CdA磷酸化反应混合液空白 进行反相色谱层析所得的色谱图2为用快速蛋白质层析系统(FPLC)对小牛胸腺dCK催化CdA磷酸化反应混合液进行 反相色谱层析所得的色谱图。
具体实施例方式
下面结合具体实施例，进一歩阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术 人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限 定的范围。
实施例1
1 、 dCK催化CdA的单磷酸化反应
(1) 将反应混合液包括lmmol/LCdA、 10mmol/LUTP、 10mmol/LMgCl2、 20mmol/L NaCl、 20mmol/LNaF、 2mmol/L DTT以及lmldCK用0.01mol/L的Tris-HCl缓冲液(pH7.4) 定容到5ml。
(2) 将反应混合液放入气浴/水浴恒温振荡器中，在37'C、 150rpc下，反应2小时。
(3) 反应完毕后将混合液取出，加入lml冰甲醇，放入冰浴中反应10分钟，另蛋白 质完全沉淀。
(4) 从冰浴中取出混合液，放入离心机中10000rpc离心10分钟，留取上清液等待 FPLC测定。
(5) 样品空白的准备在反应混合液中直接加入lml冰甲醇，再放入气浴/水浴恒温 振荡器中，在37。C、 150rpc下，反应2小时。冰浴10分钟后，离心留取上清液。
2、 FPLC测定dCK酶活
(1) 样品的准备。取上述反应混合物清液0.5ml，用0.01mol/L的Tris-HCl缓冲液 (pH7.4)稀释至lml。将稀释的混合液用0.45y的滤头过滤，等待上样。
(2) 反相液相色谱层析。用FPLC系统中反相液相色谱对上述处理过的样品和样品空 白进行层析，条件是反相层析柱RESOURCE RPC lml;洗脱液A: O.Olmol/L的Tris-HCl
缓冲液(pH7.0);洗脱液B:乙腈；上样量5ml;平衡IO个柱床；冲洗7个柱床；洗
脱梯度洗脱液B在20个柱床内由0%线性转变到100%;流速lml/min。
实施例2
1、 dCK催化CdA的单磷酸化反应
(l)将反应混合液包括lmmol/LCdA、 10mmol/LUTP、 1 Ommol/LMgCl2、 20mmol/L NaCl、 20mmol/LNaF、 2mmol/L DTT以及lmldCK用O.Olmol/L的Tris-HCl缓冲液(pH7.0) 定容到5ml。(2) 将反应混合液放入气浴/水浴恒温振荡器中，在37。C、 150rpc下，反应2小时。
(3) 反应完毕后将混合液取出，加入lml冰甲醇，放入冰浴中反应10分钟，另蛋白 质完全沉淀。
(4) 从冰浴中取出混合液，放入离心机中10000rpc离心10分钟，留取上清液等待 FPLC测定。
(5) 样品空白的准备在反应混合液中直接加入lml冰甲醇，再放入气浴/水浴恒温 振荡器中，在37"C、 150rpc下，反应2小时。冰浴10分钟后，离心留取上清液。
2、 FPLC测定dCK酶活
(1) 样品的准备。取上述反应混合物清液0.5ml，用0.01mol/L的Tris-HCl缓冲液 (pH7.0)稀释至lml。将稀释的混合液用0.45u的滤头过滤，等待上样。
(2) 反相液相色谱层析。用FPLC系统中反相液相色谱对上述处理过的样品和样品 空白进行层析，条件是反相层析柱RESOURCE RPC ltnl;洗脱液A: 0.005mol/L的
Tris-HCl缓冲液(pH7.0);洗脱液B:乙腈；上样量5ml;平衡IO个柱床；冲洗7个
柱床；洗脱梯度洗脱液B在IO个柱床内由0%线性转变到100%;流速2ml/min。
实施例3
1、 dCK催化CdA的单磷酸化反应
(1) 将反应混合液包括0.5mmol/LCdA、 5mmol/LUTP、 10mmol/LMgCl2、 20mmol/L NaCl、20mmol/LNaF、2mmol/L DTT以及0.5mldCK用O.Olmol/L的Tris-HCl缓冲液(pH7.4)
定容到5ml 。 、
(2) 将反应混合液放入气浴/水浴恒温振荡器中，在37。C、 120rpc下，反应3小时。
(3) 反应完毕后将混合液取出，加入lml冰甲醇，放入冰浴中反应10分钟，另蛋白
质完全沉淀。
(4) 从冰浴中取出混合液，放入离心机中10000rpc离心10分钟，留取上清液等待 FPLC测定。
(5) 样品全白的准备在反应混合液中直接加入lml冰甲醇，再放入气浴/水浴恒温 振荡器中，在37。C、 150rpc下，反应2小时。冰浴10分钟后，离心留取上清液。
2、 FPLC测定dCK酶活
(1)样品的准备。取上述反应混合物清液0.5ml，用0.01mol/L的Tris-HCl缓冲液 (pH7.0)稀释至lml。将稀释的混合液用0.45u的滤头过滤，等待上样。
(2)反相液相色谱层析。用FPLC系统中反相液相色谱对上述处理过的样品和样品空白进 行层析，条件是反相层析柱RESOURCE RPC lml;洗脱液A: 0.01 mol/L的Tris-HCl
缓冲液(pH7.0);洗脱液B:乙腈；上样量5ml;平衡IO个柱床；冲洗7个柱床；洗
脱梯度洗脱液B在20个柱床内由0%线性转变到100%;流速lml/min。
权利要求
1.利用蛋白质层析系统(FPLC)测定脱氧胞苷激酶(dCK)酶活的方法，包括如下步骤(1)30℃～40℃，将反应混合液放入气浴/水浴恒温振荡器中，120～150转/min，反应2～3小时，加入冰甲醇终止反应，冰浴5～20分钟后，离心，取上清液；(2)用Tris-HCl缓冲液稀释上清液，过滤，利用FPLC的反相液相色谱柱进行层析，通过与空白对比测得CdA减少的量，计算dCK的活性。
2. 根据权利要求l所述的利用FPLC测定dCK的方法，其特征在于所述步骤(1)中的 反应液包括2-氯-2-脱氧胞苷(CdA)、三磷酸尿苷(UTP)、氯化镁MgCl2、氯化钠NaCl、 氟化钠NaF、二硫代苏糖醇DTT、c!CK，浓度分别为0.1 lmmol/LCdA、 1 1Ommol/LUTP、 l 10mmol/LMgCl2、 10 20mmol/L NaCl、 10 20mmol/LNaF、 l 2mmol/L DTT。
3. 根据权利要求2所述的利用FPLC测定dCK的方法，其特征在于反应液浓度为lmmol/L CdA、 1Ommol/LUTP、 10mmoI/L MgCl2、 20mmol/LNaCl、 20mmol/LNaF、 2mmol/LDTT。
4. 根据权利要求l所述的利用FPLC测定dCK的方法，其特征在于所述步骤(1)中的 反应液用0.005 0.02mol/L的Tris-HCl (pH6.0 8.0)溶液定容。
5. 根据权利要求4所述的利用FPLC测定dCK的方法，其特征在于定容液为0.01 mol/L 的Tris-HCl (pH7.4)。
6. 根据权利要求l所述的利用FPLC测定dCK的方法，其特征在于所述的脱氧胞苷激 酶(dCK)是指从小牛胸腺中提取的dCK。
7. 根据权利要求l所述的利用FPLC测定dCK的方法，其特征在于所述步骤(1)中的 反应是指37'C， 150转/min，反应2小时，冰浴10分钟。
8. 根据权利要求1所述的利用FPLC测定dCK的方法，其特征在于所述的步骤(2)中 的层析条件是反相液相色谱柱为RESOURCE RPC lml，洗脱液A为0.05 0.02mol/L的 Tris-HCl缓冲液(pH6.0 8.0)，洗脱液B为乙腈，平衡为5 10个柱床，冲洗为5 7个 柱床，洗脱梯度为洗脱液B在10 20个柱床内由0%线性增加至100%,流速为1 2ml。
9. 根据权利要求8所述的利用FPLC测定dCK的方法，其特征在于洗脱液A为O.Olmol/L 的Tris-HCl缓冲液(pH7.4)，平衡为10个柱床，冲洗为7个柱床，洗脱梯度为洗脱液B 在20个柱床内由0%线性增加至100%，流速为lml。
10. 根据权利要求l所述的利用FPLC测定dCK的方法，其特征在于所述的dCK酶活 的计算方法dCK酶活U=CdA反应量(picomol) /蛋白含量(μg) h， CdA反应量= CdA空白标准量一CdA剩余量，CdA剩余量的测定为内标法。
全文摘要
本发明涉及一种利用蛋白质层析系统(FPLC)测定脱氧胞苷激酶(dCK)酶活的方法，包括步骤(1)30℃～40℃，将反应混合液放入气浴/水浴恒温振荡器中，120～150转/min，反应2～3小时，加入冰甲醇终止反应，冰浴5～20分钟后，离心，取上清液；(2)用Tris-HCl缓冲液稀释上清液，过滤，利用FPLC的反相液相色谱柱进行层析，通过与空白对比测得CdA减少的量，计算dCK的活性。该方法快速、简便，结果可信，重复性高，为大批量测定氧胞苷激酶(dCK)酶活，提供依据。
文档编号G01N30/89GK101201338SQ20071004473
公开日2008年6月18日 申请日期2007年8月9日 优先权日2007年8月9日
发明者朱利民, 柴艳倩 申请人:东华大学