溶液。使管旋转20小时。
[0101] 随后将管进行离心并通过0.22微米膜（Millex-GV 0.22微米Filter Unit Durapore PVDF Membrane, EMD Millipore Corporation, Billerica, ΜΑ, 01821，USA)过 滤上清溶液，以便去除可能仍然悬浮于溶液中的任何活性炭颗粒。通过反相HPLC(仪器： Agilent 1290UPLC，柱：Higgins Analytical Targa C18,流动相：溶剂 A-MilliQ 水中的 0.1%三氟乙酸，溶剂8-100%乙腈（册^：级）中的0.1%三氟乙酸，流速：11111/1^11，梯度 ： 0-15min，5% -95% B，具有10分钟后置时间以重新平衡柱，UV检测器的波长：230nm(550nm 参考，温度：25°C)分析样品。基于HPLC峰中测量的面积计算蛋白的回收率。
[0102] 如表1I中的结果证实的，在pH 9.0(其接近细胞色素 C的等电点（pI10. 0-10. 5)) 下从包含细胞色素 C和α-乳清蛋白的溶液选择性且高效地去除用作模型蛋白杂质的细胞 色素 C。相反，在远离细胞色素 C的等电点的ρΗ4. 0下，从溶液去除非常少的细胞色素 C。
[0103] 因此，通过将活性炭添加至具有接近蛋白杂质的等电点的pH的溶液中，可以进行 相似的分离以去除包含所关注的蛋白的溶液中可能存在的任何蛋白杂质。
[0104] 表1L用pH 4.0或pH 9.0下的活性炭处理包含5.0mg/mL的α-乳清蛋白和 0· 5mg/mL的细胞色素 C (100, OOOppm)的溶液之后α -乳清蛋白的回收率，细胞色素 C的浓 度，以及去除的细胞色素 C的LRV。
[0106] 实施例3.从细胞色素 C的溶液选择性地去除α -乳清蛋白
[0107] 这个代表性实施例进一步证实当使起始溶液的pH接近不期望的蛋白或模型蛋白 杂质的等电点时，利用活性炭可以从包含靶蛋白的溶液选择性地去除另一不期望的蛋白或 模型蛋白杂质。与实施例2相反，这里待去除的模型杂质为α-乳清蛋白。在这个实验中， 在静态条件下用pH 4. 0或9. 0下的活性炭处理具有100, OOOppm的α -乳清蛋白的细胞色 素 C溶液，以便证实通过选择接近α -乳清蛋白的等电点的溶液pH，也可以用活性炭选择性 且高效地去除α-乳清蛋白。
[0108] 溶液制备自400mg来自马心的细胞色素 C(通过SDS-PAGE彡95%，产品编号 C2506，批号 84H7135, Sigma-Aldrich Corporation, St. Louis, MO, 63103,USA)、40mg 来 自牛乳的α-乳清蛋白（PAGE彡85%，产品编号L5385,批号110M7003V，Sigma-Aldrich Corporation，St.Louis，M0,63103，USA)和 40mL 水。然后通过 0.22 μπι 膜（Stericup-GP 0.22ym Millipore Express PLUS 膜，250mL，目录编号：SCGPU02RE，EMD Millipore Corpo ration, Billerica, ΜΑ, 01821，USA)过滤蛋白储备溶液。
[0109] 将 IOmg 的 Nuchar HD 活性炭（MeadWestVaco Corporation, Richmond, VA, USA)装 入pH 4· 0和pH 9· 0的3个15mL离心管。pH 4· 0和pH 9· 0的3个不同的15mL离心管用 作没有活性炭的对照。随后，将2. 5mL适当pH的缓冲液（对于pH 4. 0, 50mM乙酸盐，对于 pH 9. 0,50mM Tris)添加至每个管中。然后将2. 5mL具有水中的10. 0mg/mL的细胞色素 C 和1.0 mg/mL的α -乳清蛋白的储备蛋白溶液添加至每个管中，这导致具有5. Omg/mL的细 胞色素 C、0. 5mg/mL的α -乳清蛋白和25mM的缓冲液浓度的溶液。使管旋转20小时。
[0110] 将管进行离心并通过0· 22微米膜（Millex-GV 0· 22微米Filter Unit Durapore PVDF Membrane, EMD Millipore Corporation, Billerica, ΜΑ, 01821，USA)过滤上清溶 液，以便去除可能仍然悬浮于溶液中的任何活性炭颗粒。通过反相HPLC(仪器：Agilent 1290UPLC，柱：Higgins Analytical Targa C18,流动相：溶剂 A-MilliQ 水中的 0.1%三氟 乙酸，溶剂B-100%乙腈（HPLC级）中的0. 1 %三氟乙酸，流速：lml/min，梯度：0-15min， 5% -95% B，具有10分钟后置时间以重新平衡柱，UV检测器的波长：230nm(550nm参考，温 度：25°C )分析样品。基于HPLC峰中测量的面积计算蛋白的回收率。
[0111] 如表1II中证实的，在pH 4.0(这接近α-乳清蛋白的等电点（pi 4.8))下，从 包含细胞色素 C和α-乳清蛋白的溶液选择性且高效地去除α-乳清蛋白。相反，在远离 α-乳清蛋白的等电点的pH 9.0下，去除非常少的α-乳清蛋白。
[0112] 因此，实施例2和3进一步证实如果溶液的pH接近待利用活性炭去除的蛋白的等 电点，则可以利用活性炭从溶液选择性且高效地去除该蛋白。这个发现是新的和出人意料 的，并且可以用于许多不同实例，其中从溶液去除特定蛋白或从蛋白的混合物去除蛋白是 可取的。
[0113] 表1II用pH 4. 0或pH 9. 0下的活性炭处理包含5. Omg/mL的细胞色素 C和0· 5mg/ mL的α -乳清蛋白（1〇〇, OOOppm)的溶液之后细胞色素 C的回收率，α -乳清蛋白的浓度， 以及去除的α-乳清蛋白的LRV。
[0115] 实施例4.从包含单克隆抗体的混合物去除蛋白的最佳溶液pH
[0116] 这个代表性实施例证实当使起始溶液的pH接近杂质的等电点时，利用活性炭可 以从包含单克隆抗体作为靶蛋白的溶液选择性地去除模型蛋白杂质。在静态条件下用PH 4. 0、5. 0、6. 0、7. 0、8. 0和9. 0下的活性炭处理包含MAb I单克隆抗体和200, OOOppm细胞色 素 C的溶液以证实，当溶液pH接近细胞色素 C的等电点时，利用活性炭可以从溶液选择性 且高效地去除细胞色素 C。
[0117] 将MAb I单克隆抗体的10.0 mg/mL溶液透析入水以用透析管（Standard RC Dialysis Trial Kits, Spectra/ P〇r? 1-3,3. 5K MWCO, 54mm FLAT WIDTH,序列 号：132725, Spectrum Laboratories, Inc. Rancho Dominguez, CA, 90220USA)去除 缓冲液盐。然后利用 Amicon Ultra_15Centrifugal Filter Units (3kDa,目录编 号：UFC900324, EMD Millipore Corporation, Billerica, ΜΑ, 01821, USA)浓缩一部分透析 的MB I溶液。将浓缩部分的溶液与剩余透析的MB I溶液重组以给出具有10.0 mg/mL浓 度的储备溶液。然后通过0.22 μm膜（Stericup-GP 0.22 μm Millipore Express PLUS膜， 250mL，目录编号：SCGPU02RE，EMD Millipore Corporation, Billerica, ΜΑ, 01821，USA)过 滤MB I储备溶液。
[0118] 将200mg来自马心脏的细胞色素 C (SDS-PAGE彡95 %，产品编号C2506，批号 041M7008V，Sigma-Aldrich Corporation, St. Louis, MO, 63103, USA)溶于 10OmT,的 10.0 mg/ mL MAB I 溶液中。通过 0· 22 μ m 膜（Stericup-GP 0· 22 μ m Millipore Express PLUS 膜， 250mL，目录编号：SCGPU02RE，EMD Millipore Corporation, Billerica, ΜΑ, 01821，USA)过 滤储备溶液。
[0119] 将 IOmg 的 Nuchar HD 活性炭（MeadWestVaco Corporation, Richmond, VA, USA)装 入pH 4· 0、5· 0、6· 0、7· 0、8· 0 和 9· 0 的 3 个 15mL 离心管。ρΗ4· 0、5· 0、6· 0、7· 0、8· 0 和 9· 0 的 3个不同的15mL离心管用作没有活性炭的对照。将2. 5mL适当pH的缓冲液（对于pH 4.0、 5.0、6.0,50禮乙酸盐，或者对于口!17.0、8.0、9.0,5011111'1^8)添加至每个管中。将2.511^ 包含10.0 mg/mL的MAB I和2mg/mL的细胞色素 C的储备溶液添加至每个管中。所得的溶 液具有5. Omg/mL的MAB I、1.0 mg/mL的细胞色素 C和25mM的缓冲液浓度。使管旋转20小 时。
[0120] 随后将管进行离心并通过0.22微米膜（Millex-GV 0.22微米Filter Unit Durapore PVDF Membrane, EMD Millipore Corporation, Billerica, ΜΑ, 01821，USA)过滤上 清溶液，以便去除可能仍然悬浮于溶液中的任何活性炭颗粒。通过分析大小排阻色谱（仪 器：Agilent 1260HPLC ;柱：Tosoh BiosciencesTSK-Gel Super SW3000 ;流动相：0· 2M磷酸 钠 pH 7. 0 ;流速：0. 35ml/min，等度梯度，15min运行时间；UV检测器的波长：230nm ;温度： 25°C )分析样品。基于HPLC峰中测量的A230面积计算每种蛋白的回收率。
[0121] 如表1V和图2中总结的，本实施例证实出人意料的发现，当溶液pH接近细胞色素 C的等电点时，从包含单克隆抗体的溶液高效且选择性地去除在这种情况下是杂质的细胞 色素 C。因此，当溶液在接近细胞色素 C的等电点（即，Pl 10. 0-10. 5)的pH 9. 0时，去除 0.9LRV的细胞色素 C。相反地，在远离细胞色素 C的等电点的pH 4.0下，通过活性炭仅去 除0.0 lLRV的细胞色素 C。
[0122] 图2中的图示出从静态条件下用pH 4. 0、5. 0、6. 0、7. 0、8. 0和9. 0下的活性炭处 理的单克隆抗体（MAb I)溶液去除的细胞色素 C的对数减少值（LRV)。当溶液pH最接近 10.0-10. 5的细胞色素 C的等电点时，在pH 9.0下去除最大量的细胞色素 C。该图示例出 人意料的发现，当溶液PH接近待去除的蛋白的等电点时，活性炭最有效地从单克隆抗体溶 液去除蛋白。
[0123] 因此，这个实施例证实新的且出人意料的发现，通过操作溶液pH使得其接近杂质 的等电点，活性炭可以用来从包含所关注的蛋白的溶液去除蛋白杂质。
[0124] 表1V.在静态条件下用pH 4·0、5·0、6·0、7·0、8·0或9.0下的活性炭处理包含 5. Omg/mL的MAb I和1.0 mg/mL的细胞色素 C (200, OOOppm)的溶液之后单克隆抗体MAb I 的回收率，细胞色素 C的浓度，以及去除的细胞色素 C的LRV。
[0126] 实施例5.从包含单克隆抗体的溶液去除蛋白的最佳溶液pH
[0127] 这个代表性实施例证实当使起始溶液的pH接近不期望的蛋白或蛋白杂质的等电 点时，利用活性炭可以从包含单克隆抗体作为靶蛋白的溶液选择性地去除不期望的蛋白或 模型蛋白杂质。与实施例4相反，这里的模型杂质为α_乳清蛋白。
[0128] 在静态条件下用pH 4. 0、5. 0、6. 0、7. 0、8. 0和9. 0下的活性炭处理包含单克隆抗 体和200, OOOppm α -乳清蛋白的溶液以进一步证实，通过操作溶液的pH使得其接近α -乳 清蛋白的等电点，活性炭可以用于从包含所关注的蛋白（即，在这种情况下为单克隆抗体） 的溶液选择性且高效地去除另一种蛋白（即，α-乳清蛋白）。
[0129] 将MAb I单克隆抗体的10.0 mg/mL溶液透析入水以用透析管（Standard RC Dialysis Trial Kits, Spectra/ P〇r? 1-3,3. 5K MWCO, 54mm FLAT WIDTH,序列 号：132725, Spectrum Laboratories, Inc. Rancho Dominguez, CA, 90220USA)去除 缓冲液盐。然后利用 Amicon Ultra_15Centrifugal Filter Units (3kDa,目录编 号：UFC900324, EMD Millipore Corporation, Billerica, ΜΑ, 01821, USA)浓缩一部分透析 的MB I溶液。将浓缩部分的溶液与剩余透析的MB I溶液重组以给出具有10.0 mg/mL浓 度的储备溶液。然后通过0.22 μm膜（Stericup-GP 0.22 μm Millipore Express PLUS膜， 250mL，目录编号：SCGPU02RE，EMD Millipore Corporation, Billerica, ΜΑ, 01821，USA)过 滤MB I储备溶液。
[0130] 将200mg来自牛乳的α -乳清蛋白（SDS-PAGE彡85 %，产品编号L5385，批号 110M7003V，Sigma-Aldrich Corporation, St. Louis, MO, 63103, USA)溶于 10OmT,的 10.0 mg/ mL MAB I 溶液中。通过 0· 22 μ m 膜（Stericup-GP 0· 22 μ m Millipore Express PLUS 膜， 250mL，目录编号：SCGPU02RE，EMD Millipore Corporation, Billerica, ΜΑ, 01821，USA)过 滤储备溶液。
[0131] 将 IOmg 的 Nuchar HD 活性炭（MeadWestVaco Corporation, Richmond, VA, USA)装 入 pH 4·0、5·0、6·0、7·0、8·0 和 9.0 的 3个 15mL 离心管。pH 值4.0、5.0、6.0、7.0、8.0和 9. 0各自的3个不同的15mL离心管用作没有活性炭的对照。随后，将2. 5mL适当pH的