缓冲 液（对于口!14.0、5.0、6.0,501111乙酸盐，或者对于口!17.0、8.0、9.0,5011111^8)添加至每 个管中。随后将2. 5mL包含10.0 mg/mL的MB I和2. Omg/mL的α -乳清蛋白的储备溶液 添加至每个管中。所得的溶液具有5. Omg/mL的MAB I、lmg/mL的α-乳清蛋白和25mM的 缓冲液浓度。使管旋转20小时。
[0132] 将管进行离心并通过0· 22微米膜（Millex-GV 0· 22微米Filter Unit Durapore PVDF Membrane, EMD Millipore Corporation, Billerica, ΜΑ, 01821，USA)过滤上清溶 液，以便去除可能仍然悬浮于溶液中的任何活性炭颗粒。通过分析大小排阻色谱（仪器： Agilent I26OHPLC;柱：Tosoh BiosciencesTSK-Gel Super SW3OOO;流动相：0· 2M 磷酸 钠 pH 7. 0 ;流速：0. 35ml/min，等度梯度，15min运行时间；UV检测器的波长：230nm ;温度： 25°C )分析样品。基于HPLC峰中测量的A230面积计算每种蛋白的回收率。
[0133] 表V和图3中总结的，这个实施例与实施例4 一起证实，通过简单地调整溶液pH使 得其接近不期望的蛋白的等电点，活性炭可以用来选择性且高效地几乎去除包含所关注的 蛋白（在这种情况下为单克隆抗体）的溶液中存在的任何不期望的蛋白（在这种情况下为 α -乳清蛋白）。在这种情况下，当溶液pH接近α -乳清蛋白的等电点时，从包含单克隆抗 体的溶液选择性且高效地去除α-乳清蛋白。例如，当溶液在接近α-乳清蛋白的等电点 (pi 4.8)的pH 5.0时，去除0.57LRV的-乳清蛋白。相反地，在远离α-乳清蛋白的等电 点的pH 9. 0下，通过活性炭仅去除0. 12LRV的α -乳清蛋白。
[0134] 图3中的图示出从静态条件下用pH 4. 0、5. 0、6. 0、7. 0、8. 0和9. 0下的活性炭处 理的单克隆抗体（MAb I)溶液去除的α -乳清蛋白的对数减少值（LRV)。如图所示，当溶液 PH最接近4.8的α-乳清蛋白的等电点时，在ρΗ5.0下去除最大量的α-乳清蛋白。该图 显示出人意料的发现，当溶液PH接近待去除的蛋白的等电点时，活性炭最有效地从单克隆 抗体溶液去除蛋白。
[0135] 表V.在静态条件下用pH 4.0、5.0、6.0、7.0、8.0或9.0下的活性炭处理包含 5.0mg/mL的MAb I和lmg/mL的α-乳清蛋白（200,000ppm)的溶液之后单克隆抗体MAb I 的回收率，α-乳清蛋白的浓度，以及去除的α-乳清蛋白的LRV。
[0137] 实施例6.从包含单克隆抗体的混合物去除蛋白的最佳溶液pH
[0138] 这个代表性实施例证实当使起始溶液的pH接近不期望的蛋白或蛋白杂质的等电 点时，利用活性炭可以从包含单克隆抗体作为靶蛋白的溶液选择性地去除不期望的蛋白或 模型蛋白杂质。与实施例4和5相反，这里模型杂质为溶菌酶。
[0139] 在静态条件下用pH 4.0、5.0、6.0、7.0、8.0和9.0下的活性炭处理包含MAb I单 克隆抗体和200, OOOppm溶菌酶的溶液以证实，当溶液pH接近溶菌酶的等电点时，利用活性 炭可以从溶液选择性且高效地去除溶菌酶。
[0140] 将MAb I单克隆抗体的10.0 mg/mL溶液透析入水以用透析管（Standard RC Dialysis Trial Kits, Spectra/ P〇r? 1-3,3. 5K MWCO, 54mm FLAT WIDTH,序列 号：132725, Spectrum Laboratories，Inc.，Rancho Dominguez，CA，90220USA)去除 缓冲液盐。然后利用 Amicon Ultra_15Centrifugal Filter Units (3kDa,目录编 号：UFC900324, EMD Millipore Corporation, Billerica, ΜΑ, 01821, USA)浓缩一部分透析 的MB I溶液。将浓缩部分的溶液与剩余透析的MB I溶液重组以给出具有10. 0mg/mL浓 度的储备溶液。然后通过0.22 μm膜（Stericup-GP 0.22 μm Millipore Express PLUS膜， 250mL，目录编号：SCGPU02RE，EMD Millipore Corporation, Billerica, ΜΑ, 01821，USA)过 滤MB I储备溶液。
[0141] 将80mg来自鸡蛋清的溶菌酶（SDS-PAGE彡98 %，产品编号L4919,批号 100M1897V1，Sigma-Aldrich Corporation, St. Louis, MO, 63103, USA)溶于 40mL 的 10.0 mg/ mL MAB I 溶液中。通过 0· 22 μ m 膜（Stericup-GP 0· 22 μ m Millipore Express PLUS 膜， 250mL，目录编号：SCGPU02RE，EMD Millipore Corporation, Billerica, ΜΑ, 01821，USA)过 滤储备溶液。
[0142] 将 IOmg 的 Nuchar HD 活性炭（MeadWestVaco Corporation, Richmond, VA, USA)装 入pH 4· 0、5· 0、6· 0、7· 0、8· 0 和 9· 0 的离心管。pH 4· 0、5· 0、6· 0、7· 0、8· 0 和 9· 0 的不同 15mL 离心管用作没有活性炭的对照。将2. 5mL适当pH的缓冲液（对于pH 4. 0、5. 0、6. 0, 50mM 乙酸盐，或者对于pH 7.0、8.0、9.0,50mM Tris)添加至每个管中。将2.5mL包含KXOmg/ mL的MB I和2mg/mL的溶菌酶的储备溶液添加至每个管中。所得的溶液具有5. Omg/mL的 MB I、1.0mg/mL的溶菌酶和25mM的缓冲液浓度。使管旋转20小时。
[0143] 随后将管进行离心并通过0.22微米膜（Millex-GV 0.22微米Filter Unit Durapore PVDF Membrane, EMD Millipore Corporation, Billerica, ΜΑ, 01821，USA)过滤上 清溶液，以便去除可能仍然悬浮于溶液中的任何活性炭颗粒。通过分析大小排阻色谱（仪 器：Agilent 1260HPLC ;柱：Tosoh BiosciencesTSK-Gel Super SW3000 ;流动相：0· 2M磷酸 钠 pH 7. 0 ;流速：0. 35ml/min，等度梯度，15min运行时间；UV检测器的波长：230nm ;温度： 25°C )分析样品。基于HPLC峰中测量的A230面积计算每种蛋白的回收率。
[0144] 如表VI和图4中总结的，这个实施例证实出人意料的发现，当溶液pH接近溶菌酶 的等电点时，从包含单克隆抗体的溶液高效且选择性地去除在这种情况下分类为杂质的溶 菌酶。因此，当溶液在接近溶菌酶的等电点（即，Pl 11.2-11.3)的pH 9.0时，去除0.47LRV 的溶菌酶。相反地，在远离溶菌酶的等电点的pH 4.0下，通过活性炭仅去除0.08LRV的溶 菌酶。
[0145] 图4中的图示出从静态条件下用pH 4. 0、5. 0、6. 0、7. 0、8. 0和9. 0下的活性炭处 理的单克隆抗体（MAb I)溶液去除的溶菌酶的对数减少值（LRV)。如图所示，当溶液pH最 接近11. 2-11. 3的溶菌酶等电点时，在pH 9.0下去除最大量的溶菌酶。该图证实出人意料 的发现，当溶液PH接近待去除的蛋白的等电点时，活性炭最有效地从单克隆抗体溶液去除 蛋白。
[0146] 因此，这个实施例与实施例4和5-起证实新的且出人意料的发现，通过操作溶液 PH使得其接近杂质的等电点，活性炭可以用来从包含所关注的蛋白的溶液去除蛋白杂质。
[0147] 表VI.在静态条件下用pH 4. 0、5. 0、6. 0、7. 0、8. 0或9. 0下的活性炭处理包含 5. Omg/mL的MAb I和1.0 mg/mL的溶菌酶（200, OOOppm)的溶液之后单克隆抗体MAb I的回 收率，溶菌酶的浓度，以及去除的溶菌酶的LRV。
[0149] 实施例7.从包含单克隆抗体的混合物去除蛋白的最佳溶液pH
[0150] 这个代表性实施例证实当使起始溶液的pH接近蛋白杂质的等电点时，利用活性 炭可以从包含单克隆抗体作为靶蛋白的溶液选择性地去除模型蛋白杂质。与实施例4、5和 6相反，这个实施例中使用的模型杂质为BSA。
[0151] 在静态条件下用pH 4. 0、5.0、6.0、7.0、8.0和9.0下的活性炭处理包含MAb I单 克隆抗体和100, OOOppm BSA的溶液以证实，当溶液pH接近BSA的等电点时，利用活性炭可 以从溶液选择性且高效地去除BSA。
[0152] 将MAb I单克隆抗体的10.0 mg/mL溶液透析入水以用透析管（Standard RC Dialysis Trial Kits, Spectra/ Por? 1-3,3. 5K MWCO, 54mm FLAT WIDTH,序列 号：132725, Spectrum Laboratories, Inc. Rancho Dominguez, CA, 90220USA)去除 缓冲液盐。然后利用 Amicon Ultra_15Centrifugal Filter Units (3kDa,目录编 号：UFC900324, EMD Millipore Corporation, Billerica, ΜΑ, 01821, USA)浓缩一部分透析 的MB I溶液。将浓缩部分的溶液与剩余透析的MB I溶液重组，获得具有10.0 mg/mL浓度 的储备溶液。然后通过 〇·22μηι 膜（Stericup-GP 0·22μηι Millipore Express PLUS 膜， 250mL，目录编号：SCGPU02RE，EMD Millipore Corporation, Billerica, ΜΑ, 01821，USA)过 滤MB I储备溶液。
[0153] 将40mg来自牛血清的白蛋白（SDS-PAGE彡98 %，产品编号A7906,批号 SLBC0647V，Sigma-Aldrich Corporation, St. Louis, MO, 63103, USA)溶于 40mL 的 10.0 mg/ mL MAB I 溶液中。通过 0· 22 μ m 膜（Stericup-GP 0· 22 μ m Millipore Express PLUS 膜， 250mL，目录编号：SCGPU02RE，EMD Millipore Corporation, Billerica, ΜΑ, 01821，USA)过 滤储备溶液。
[0154] 将 IOmg 的 Nuchar HD 活性炭（MeadWestVaco Corporation, Richmond, VA, USA)装 入pH 4· 0、5· 0、6· 0、7· 0、8· 0 和 9· 0 的离心管。pH 4· 0、5· 0、6· 0、7· 0、8· 0 和 9· 0 的不同 15mL 离心管用作没有活性炭的对照。将2. 5mL适当pH的缓冲液（对于pH 4. 0、5. 0、6. 0, 50mM 乙酸盐，或者对于pH 7. 0、8. 0、9. 0,50mM Tris)添加至每个管中。将2. 5mL包含10.0 mg/mL 的MAB I和lmg/mL的BSA的储备溶液添加至每个管中。所得的溶液具有5. Omg/mL的MAB I、0. 5mg/mL的BSA和25mM的缓冲液浓度。使管旋转20小时。
[0155] 随后将管进行离心并通过0.22微米膜（Millex-GV 0.22微米Filter Unit Durapore PVDF Membrane, EMD Millipore Corporation, Billerica, ΜΑ, 01821，USA)过滤上 清溶液，以便去除可能仍然悬浮于溶液中的任何活性炭颗粒。通过分析大小排阻色谱（仪 器：Agilent 1260HPLC ;柱：Tosoh BiosciencesTSK-Gel Super SW3000 ;流动相：0· 2M磷酸 钠 pH 7. 0 ;流速：0. 35ml/min，等度梯度，15min运行时间；UV检测器的波长：230nm ;温度： 25°C )分析样品。基于HPLC峰中测量的A230面积计算每种蛋白的回收率。
[0156] 如表VII和图5中总结的，这个实施例证实当溶液pH接近BSA的等电点时，从包 含单克隆抗体的溶液高效且选择性地去除在这种情况下用作蛋白杂质的BSA。因此，当溶 液在接近BSA的等电点（即，ppl 4.9)的pH 5.0时，去除0.40LRV的BSA。相反地，在远离 BSA的等电点的pH 9. 0下，通过活性炭仅去除0. 06LRV的BSA。
[0157] 图5中的图示出从静态条件下用pH 4. 0、5. 0、6. 0、7. 0、8. 0和9. 0下的活性炭处 理的单克隆抗体（Mb I)溶液去除的BSA的对数减少值（LRV)。如图所示，当溶液pH最接 近4. 9的BSA等电点时，在pH 5.0下去除最大量的BSA。该图进一步支持出人意料的结果， 当溶液PH接近待去除的蛋白的等电点时，活性炭最有效地从单克隆抗体溶液去除蛋白。
[0158] 因此，这个实施例与实施例4、5和6 -起证实新的出人意料发现，通过操作溶液pH 使得其接近杂质的等电点，活性炭可以用来从包含所关注的蛋白的溶液去除蛋白杂质。
[0159] 表VII.在静态条件下用pH 4. 0、5. 0、6. 0、7. 0、8. 0或9. 0下的活性炭处理包含 5. Omg/mL的MAb I和0· 5mg/mL的BSA(100, OOOppm)的溶液之后单克隆抗体MAb I的回收 率，BSA的浓度，以及去除的BSA的LRV。
[0160]
[0161] 实施例8.利用几种不同类型的活性炭的从α -乳清蛋白的溶液选择性地去除细 胞色素 C蛋白
[0162] 这个代表性实施例证实本文所述的方法可以利用几种不同类型的活性炭成功进 行。
[0163] 将具有100,000ppm用作模型蛋白杂质的细胞色素 C的α-乳清蛋白溶液用pH 4. 0和pH 9. 0下的几种不同类型的活性炭处理。这个实施例证实通过选择接近蛋白杂质的 等电点的溶液PH，几种不同类型的活性炭可以用来从包含靶蛋白的样品选择性且高效地去 除蛋白杂质。
[0164] 利用800mg来自牛乳的α