浓度以获得期望的电导率。 优选地，如下文实施例中，修改各种缓冲液的盐浓度以获得期望的电导率。多肽的"pi"或 "等电点"指多肽的正电荷平衡其负电荷的pH。pi可以计算自多肽连接的糖的氨基酸残基 或唾液酸残基的净电荷，或者可以利用本领域公知的一种或多种以下方法确定：等电聚焦 电泳凝胶；毛细管等电聚焦电泳；色谱聚焦；等电沉淀；和离子交换色谱。
[0066] II.用于本f所沭方法的示例件含碳物质
[0067] 在本发明的方法中，某些含碳物质如活性炭用于选择性地去除蛋白。活性炭可以 描述为具有非常高表面积的多孔固体。在一些实施方案中，活性炭包含活性木炭。活性炭可 以源自各种来源，包括但不限于煤炭、木材、椰壳、果壳和泥炭。可以通过在受控气氛下物理 活化（包括加热）或者通过利用强酸、碱或氧化剂化学活化来从这些材料制备活性炭。活 化过程产生具有高表面积的多孔结构，这赋予活性炭更大的杂质去除能力。可以修改活化 过程以控制表面的酸性。
[0068] 活性炭可获得自各种商业来源，并且有许多等级和形式。活性炭的一些 商业供应商包括公司如 MeadWestVaco Corp.，Richmond, VA, USA ;Norit Americas Inc. , Marshall, TX, USA ；Calgon Carbon Corp.，Pittsburgh, PA, USA。
[0069] 在本文所述的一些实施方案中，如本文所述，将活性炭掺入包含纤维素的纤维介 质中。
[0070] 可以用于本发明的方法的可商购的活性炭材料包括但不限 于 Nuchar HD 活性炭（MeadWestVaco Corporation,Richmond, VA, USA); Nuchar SA 20 (MeadffestVaco Corporation, Richmond, VA, USA)； Nuchar SN (MeadffestVaco Corporation, Richmond, VA, USA) ；Nuchar WV-B 30 (MeadWestVaco Corporation,Richmond, VA, USA) ;RGC Powder 活性炭 (MeadWestVaco Corporation, Richmond,VA,USA) ;Norit Darco KB-G 活性 炭(Norit Americas Inc. , Marshall,Texas,USA) ；Norit CGP Super 活性 炭(Norit Americas Inc., Marshall, Texas, USA) ；Norit A Supra USP (Norit Americas Inc. , Marshall, Texas, USA) ；Norit E Supra USP (Norit Americas Inc. , Marshall, Texas, USA) ；Norit C GRAN(Norit Americas Inc. , Marshall, Texas, USA)； Norit SX Ultra (Norit Americas Inc. , Marshall, Texas, USA);以及 Chemviron Pulsorb PGC 活性炭（Chemviron Carbon, Feluy, Belgium) 〇
[0071] 活性炭的两种主要形式为粉状和颗粒状。粉状活性炭包含小且通常小于Imm直径 的颗粒，并且最常用于液体的纯化。颗粒状活性炭具有较大的颗粒和因此较小的表面积，因 此其优选用于其中扩散速度较快的气体纯化。
[0072] 活性炭在消费者应用（如水、食品、饮料和药物纯化）中使用的对安全的重要考虑 是减少并控制可提取的化合物。意图用于饮用水和食品接触应用的活性炭通常按照覆盖水 的所有间接添加剂的安全标准ANSI/NSF Standard 61进行制备。而且，ASTM标准测试方 法D6385描述了通过灰化确定活性炭中酸可提取含量，并且可以用来研宄和最小化来自活 性炭的可提取物水平。
[0073] -系列活性炭类型可用于各种应用。例如，MeadWestVaco Corp.提供随它们的能 力、表面酸性、对靶分子的孔可接近性和预期应用变化的12种类型的粉状活性炭。一般期 望最大化活性炭的杂质去除能力。
[0074] 在本文所述的一些实施方案中，将活性炭掺入纤维素介质。
[0075] III.含碳物质在纯化讨稈中的用涂
[0076] 下文描述一种可以用于从包含至少两种蛋白的溶液选择性地去除蛋白的一般方 法。
[0077] 在一些实施方案中，利用本文所述方法选择性地去除的蛋白是不期望的蛋白或蛋 白杂质，可以通过用活性炭静态处理混合物来将其去除。将包含至少两种蛋白的溶液的PH 调整至这样的pH :在待选择性地去除的蛋白或蛋白杂质的等电点的2. OpH单位或1.0 pH单 位之内。可以通过向溶液添加酸或碱来调整pH。还可以通过用具有期望的溶液pH的缓冲 液稀释溶液或者通过将溶液透析或渗滤入具有期望的溶液PH的缓冲液来调整溶液pH。随 后将活性炭以干燥形式或悬浮于水溶液中添加至PH调整的溶液中。然后允许溶液与活性 炭相互作用长达48小时的时间。优选保持将活性炭悬浮于溶液内，以便最大化蛋白杂质吸 附率。通过移动溶液容器或用磁力搅拌棒搅拌溶液或用机械搅拌器搅拌溶液来搅动溶液。
[0078] 然后从溶液分离出活性炭，其中活性炭结合至待选择性地去除的蛋白。可以通过 过滤溶液并回收溶液滤液来分离结合的活性炭。或者，可以通过离心溶液或允许结合的活 性炭沉降并回收上清溶液来分离结合的活性炭。如果离心或沉降之后任何细小颗粒留在上 清中，可以通过过滤将它们去除。剩余溶液包含降低水平的选择性地去除的蛋白。
[0079] 在另一实施方案中，以下方法可以用来从包含至少两种蛋白的溶液选择性地去除 蛋白。
[0080] 将包含至少两种蛋白的溶液的pH调整至这样的pH :在期望选择性地去除的蛋白 的等电点的2. OpH单位或1.0 pH单位之内。可以通过向溶液添加酸或碱来调整pH。还可以 通过用具有期望pH的缓冲液稀释溶液来调整溶液pH。此外，可以通过将溶液透析或渗滤入 具有期望pH的缓冲液来调整溶液pH。
[0081] 在一些实施方案中，用活性炭的水性浆装载色谱装置，例如柱。还可以将活性炭作 为干粉装入装置，例如柱，然后用水性溶液湿润。但是，有时，当将柱干包装时，从活性炭之 间去除小气泡可能具有挑战性。然后用具有与包含蛋白的溶液相同PH的缓冲液平衡柱。然 后使溶液以一定流速通过活性炭柱，所述流速导致15sec-10.0 min的柱停留时间。然后收 集来自柱的洗脱液，其不含或含有降低水平的利用活性炭选择性地去除的蛋白。
[0082] 在各种实施方案中，可以通过过滤或者离心或者离心和过滤的组合从包含靶蛋白 的样品去除结合至待选择性地去除的蛋白的活性炭。
[0083] 当从蛋白的混合物开始时，可以通过使混合物进行等电聚焦电泳凝胶或毛细管等 电聚集容易地确定混合物中所有蛋白的等电点。可以通过二维凝胶电泳（通过蛋白的等电 点然后通过它们的大小分离蛋白）分析实现复杂混合物的进一步拆分。基于这个信息，如 本文所述，在利用活性炭去除靶蛋白以外的蛋白时可以调整溶液条件。
[0084] 通过以下实施例进一步说明本发明，所述实施例不应当理解为限制性的。本申请 中引用的所有参考文献、专利和公开的专利申请的内容以及图均援引加入本文。
[0085] 实施例
[0086] 实施例1.利用溶液pH通过活性炭从1:1重量比的溶液选择性地去除细胞色素 C 或α-乳清蛋白
[0087] 这个代表性实施例证实通过操作起始溶液的pH，利用活性炭可以从最初以等浓度 存在于混合物中的两种蛋白的混合物选择性地去除蛋白。在这个实验中，利用期望选择性 地去除的蛋白的等电点附近的溶液ΡΗ，用活性炭获得细胞色素 C或α_乳清蛋白的选择性 去除。
[0088] 如下文所述，在静态条件下于pH 4. 0、5. 0、6. 0、7. 0、8. 0和9. 0下用活性炭处理细 胞色素 C和α-乳清蛋白的1:1重量比的溶液。
[0089] 通过在IOOmL水中溶解200mg来自牛乳的α-乳清蛋白（PAGE彡85%，产品编 号 L5385，批号 110M7003V，Sigma-Aldrich Corporation, St. Louis, MO, 63103,USA)和 200mg来自马心的细胞色素 C(通过SDS-PAGE彡95%，产品编号C2506,批号041M7008V， Sigma-Aldrich Corporation, St. Louis, MO, 63103, USA)来制备 1:1 重量比的蛋白储备溶 液。然后通过 〇·22μηι 膜（Stericup-GP 0·22μηι Millipore Express PLUS 膜，250mL，目 录编号：SCGPU02RE，EMD Millipore Corporation, Billerica, ΜΑ, 01821，USA)过滤储备溶 液。
[0090] 将 IOmg 的 Nuchar HD 活性炭（MeadWestVaco Corporation, Richmond, VA, USA)装 入口!14.0、5.0、6.0、7.0、8.0和9.0各自的3个1511^离心管。？!14.0、5.0、6.0、7.0、8.0和 9. 0各自的3个不同的15mL离心管用作没有活性炭的对照。然后将2. 5mL适当pH的缓冲 液（对于口!14.0、5.0、6.0,501111乙酸盐，或者对于口!17.0、8.0、9.0,5011111^8)添加至每 个管中。然后将2. 5mL包含2. Omg/mL的α -乳清蛋白和2. Omg/mL的细胞色素 C的1:1蛋 白储备溶液添加至每个管中。所得溶液具有1.0 mg/mL的α -乳清蛋白和1.0 mg/mL的细胞 色素 C。使管旋转20小时。
[0091] 随后将管进行离心并通过0.22微米膜（Millex-GV 0.22微米Filter Unit Durapore PVDF Membrane, EMD Millipore Corporation, Billerica, ΜΑ, 01821，USA)过 滤上清溶液，以便去除可能仍然悬浮于溶液中的任何活性炭颗粒。通过反相HPLC(仪器： Agilent 1290UPLC，柱：Higgins Analytical Targa C18,流动相：溶剂 A-MilliQ 水中的 0. 1%三氟乙酸，溶剂8-100%乙腈（册^：级）中的0.1%三氟乙酸，流速：11111/1^11，梯度： 0-15min，5% -95% B，具有10分钟后置时间以重新平衡柱，UV检测器的波长：230nm(550nm 参考，温度：25°C)分析样品。基于HPLC峰中测量的面积计算蛋白的回收率。
[0092] 如下文表1中总结和图1中示出的，这个实验证实通过调整溶液pH使得其接近待 去除的蛋白的等电点，可以从包含具有不同等电点的两种蛋白的溶液选择性地去除单一蛋 白。例如，用pH 4.0(其正好接近α-乳清蛋白的等电点）下的活性炭处理1:1重量比的 蛋白溶液之后，溶液中细胞色素 C的组成从50%富集至77%，而溶液中α -乳清蛋白的组 成从50 %减少至23%。
[0093] 相反地，用pH 9. 0 (其正好接近细胞色素 C的等电点）下的活性炭处理1:1重量 比的蛋白溶液，将α -乳清蛋白的溶液组成从50%富集至100%，而细胞色素 C的溶液组成 从50%减少至0%。
[0094] 图1示出在静态条件下用pH 4. 0、5. 0、6. 0、7. 0、8. 0和9. 0下的活性炭处理之后， 包含1.0 mg/mL的细胞色素 C和1.0 mg/mL的α -乳清蛋白（50% :50%比例）的溶液中细 胞色素 C和α-乳清蛋白的百分比组成。如图所示，当溶液pH接近10.0-10.5的细胞色素 C的等电点时，活性炭选择性地去除细胞色素 C，而当溶液pH接近4. 8的α -乳清蛋白的等 电点时，，活性炭选择性地去除α-乳清蛋白。该图显示出人意料的结果，当溶液pH接近待 去除的蛋白的等电点时，活性炭可以用来选择性地去除蛋白。
[0095] 表1.在静态条件下用pH 4. 0、5. 0、6. 0、7. 0、8. 0或9. 0下的活性炭处理包含 1. Omg/mL的细胞色素 C和1.0 mg/mL的α -乳清蛋白（50% :50%比例）的溶液之后，细胞 色素 C的回收率，α-乳清蛋白的回收率，以及细胞色素 C比α-乳清蛋白的比例。
[0097] 实施例2.从包含细胞色素 C和α -乳清蛋白的溶液选择性地去除细胞色素 C
[0098] 这个代表性实施例证实当操作起始溶液的pH使得其接近不期望的蛋白或模型 蛋白杂质的等电点时，利用活性炭可以从包含靶蛋白的溶液选择性地去除不期望的蛋白 或模型蛋白杂质。在这个实验中，在静态条件下用pH 4.0或9.0下的活性炭处理包含 100, OOOppm细胞色素 C(这可能与许多蛋白杂质的水平类似）的α-乳清蛋白溶液，以便证 实通过选择接近细胞色素 C的等电点的溶液pH，可以用活性炭选择性且高效地去除细胞色 素 C。
[0099] 溶液制备自400mg来自牛乳的α -乳清蛋白（PAGE彡85 %，产品编号L5385， 批号 110M7003V，Sigma-Aldrich Corporation, St. Louis, MO, 63103,USA)、40mg 来自马 心的细胞色素 C(通过SDS-PAGE彡95%，产品编号C2506,批号84H7135, Sigma-Aldrich Corporation，St.Louis，M0,63103，USA)和 40mL 水。然后通过 0.22 μπι 膜（Stericup-GP 0.22ym Millipore Express PLUS 膜，250mL，目录编号：SCGPU02RE，EMD Millipore Corpo ration, Billerica, ΜΑ, 01821，USA)过滤蛋白储备溶液。
[0100] 将 IOmg 的 Nuchar HD 活性炭（MeadWestVaco Corporation, Richmond, VA, USA)装 入pH 4· 0和pH 9· 0的3个15mL离心管。pH 4· 0和pH 9· 0下的3个不同的15mL离心管 用作没有活性炭的对照。然后将2. 5mL适当pH的缓冲液（对于pH 4. 0, 50mM乙酸盐，对于 pH 9. 0,50mM Tris)添加至每个管中。随后，将2. 5mL具有水中的10. 0mg/mL的α-乳清 蛋白和1.0 mg/mL的细胞色素 C的储备蛋白溶液添加至每个管中。这导致具有5. Omg/mL的 α -乳清蛋白、0. 5mg/mL的细胞色素 C和25mM的缓冲液浓度的