以内被迅速释放到细胞 外（被动释放），作为早期的炎症介质诱导各种炎症性细胞因子的产生，作为相关疾病，可 以列举脑梗塞、外伤性脑损伤、由器官移植时的缺血引起的疾病、心肌梗塞等。
[0116] 3)抗体
[0117] 本说明书中使用的"抗体"这一术语是指，由4条多肽链、即2条重⑶链和2条 轻（L)链通过二硫键相互结合而成的分子构成的免疫球蛋白分子。本发明中的单克隆抗体 也由包含重链（H链）和轻链（L链）各2条的免疫球蛋白分子构成。各H链由H链可变区 (有时称为"HCVR"或"VH"）和H链恒定区（H链恒定区由3个结构域构成，有时将其分别 称为"011"、"012"、"013"（统称为01))构成。各1^链由1^链可变区（有时称为"1^0^"或 "VL"）和L链恒定区（L链恒定区由1个结构域构成，有时称为"CL"）构成，将到各恒定区 (也称为不变区）起始之前的部分称为可变区（或者可变区）。
[0118] 重链根据恒定区的差异分为γ链、μ链、α链、δ链、ε链，根据该差异分别形 成IgG、IgM、IgA、IgD、IgE这5个种类的类别（同种型）的免疫球蛋白。此外，在人的情况 下，IgG存在IgGl~IgG4这4个亚类。另一方面，根据轻链恒定区的的差异，分为κ链、 λ链。
[0119] 另一方面，VH和VL在与抗体的结合特异性相关的方面是重要的。抗体主要通过 VH和VL的氨基酸残基与靶抗原相互作用，因此，与位于可变区外的序列相比，可变区内的 氨基酸序列在各抗体间的差异更大。此外，VH和VL也可以进一步细分为在各种抗体间保 持更为恒定的被称为框架区（FR :framework region)的区域和被称为互补决定区（CDR: complementarity determining region)的超可变性区域。VH 和 VL 各自由 3 个 CDR 和 4 个FR构成，它们按照FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4的顺序从氨基末端排列至羧基末 端（参考图3和6)。
[0120] 另外，FR4在H链可变区的情况下也称为D/J区，在L链可变区的情况下也称为J 区。氨基酸在各区域的分配原则上按照Kabat的定义（参考http://www. bioinf. org. uk/ abs/#kabatnum)来进行。
[0121] 另外，虽然也有本说明书中关于这些抗体的生殖细胞系列（种系）来源的序列 的记载，但这些生殖细胞系列来源序列的区分（家族：family)和基因编号的表示主要 以 VBASE2 (http://www. vbase2. org/vbase2. php)中记载的 "VBASE2ID" 的表不为基准。 具体而言，例如，关于轻链中的λ (lambda)链的可变区序列的家族，以IGLV1、IGLV2或 IGLV3等来表示，关于这些基因的"VBASE2ID"编号，以humIGLV104( = IGLV3-1*01)和 humIGLV079( = IGLV3-25*02)来表示。另外，关于λ链的J片段（segment)的家族，以 几1、几2或JL3等来表示。另外，关于重链的可变区的家族，以IGHV1、IGHV2、IGHV3或IGHV4 等来表示，它们的基因编号的表示原则上以VBASE2 (http://www. vbase2. org/vbase2. php) 中记载的"VBASE2ID" 的表示为基准，以 humIGVH048( = IGHV3-73*01)、humIGHV240(= IGHV3-72)和humIGHV025( = IGHVH-15)来表示。另外，关于H链的J片段的家族，以JH1、 JH2、JH3或JH4等来表示。
[0122] 4)抗体的"抗原结合性片段"（或者仅称为"抗体片段"）
[0123] 本说明书中使用的抗体的"抗原结合性片段"（或者仅称为"抗体片段"）这一术 语是指，具有与抗原（HMGBl蛋白）特异性结合的能力的1个或多个抗体的片段（例如VH)。 需要说明的是，该片段也包括具有与抗原特异性结合的最低限度的氨基酸序列的肽。作为 抗体的"抗原结合性片段"这一术语中包含的结合部分的例子，可以列举⑴Fab片段、（ii) F(ab'）2片段、（iii)由VH和CHl结构域构成的Fd片段、（iv)由抗体的单臂的VL和VH结 构域构成的Fv片段、（V)由VH结构域构成的dAb片段（Nature 341:544-546, 1989)、（vi) 具有足以进行特异性结合的框架的分离的互补决定区、（vii)双特异性抗体、以及（viii) 多特异性抗体等。需要说明的是，本说明书中，在未特别区分而称为"抗体"的情况下，不仅 包含全长的抗体，也包含这些"抗原结合性片段"。
[0124] 这些抗体为与哺乳类HMGBl特异性结合的抗体，能够与该HMGBl的表位部位或 HMGBl片段等结合。本说明书中，"抗HMGBl抗体"、"能够中和HMGBl的抗体"、"抗HMGBl蛋 白抗体"、"与HMGBl的片段特异性结合的抗体"或"能够中和HMGBl的生物活性的抗体"都 是指通过与HMGBl结合而抑制HMGBl的生物活性的抗体。
[0125] 5)与HMGBl蛋白结合的抗体或其人源化抗体
[0126] 本发明的抗体为与哺乳类HMGBl特异性结合的抗体，特别地，与存在于该HMGBl蛋 白的C末端结构域的氨基酸序列（EEEDDDDE(序列号60))特异性结合。本说明书中，"抗 HMGBl抗体"、"能够中和HMGBl的抗体"、"抗HMGBl蛋白抗体"、"与HMGBl的片段特异性结合 的抗体"或"能够中和HMGBl的生物活性的抗体"都是指通过与HMGBl的上述表位部位结合 而抑制HMGBl的生物活性的抗体。如前所述，HMGBl的C末端氨基酸序列（序列号60)在 哺乳动物间也非常高度地保守，在获取针对人HMGBl的上述表位的抗体时，不一定要使用 人来源的HMGB1，也可以使用大鼠来源、CHO来源或牛胸腺来源的HMGBl蛋白。
[0127] 需要说明的是，本发明中的抗HMGBl的人源化抗体为以上述啮齿类来源抗HMGBl 抗体为供体、原则上将CDR移植到人来源FR中而得到的抗体，是指在FR序列的一部分中 含有啮齿类来源的氨基酸残基，具有与原来的啮齿类来源抗体或其嵌合抗体同等以上的 HMGBl结合活性或中和活性的全长抗体或其抗原结合性片段。基于本专利申请中公开的表 示可变区的氨基酸序列、互补决定区（CDR)的氨基酸序列，利用本技术领域中公知的技术， 容易得到与HMGBl蛋白特异性结合且具有更高的结合活性的人源化抗体、或者免疫原性更 低的人源化抗体、或其抗原结合性片段，这些人源化抗体包括在本发明的技术范围内。
[0128] 6)嵌合抗体和人源化抗体
[0129] "嵌合抗体"这一术语是指，其L和H链基因典型地由属于不同种属的免疫球蛋白 基因通过基因工程方法构建而成的抗体。典型地为将小鼠单克隆抗体来源的可变区部位与 人来源的IgGl或IgG4的恒定区部位结合而成的抗体。通过基因工程的方法进行改造来 获取嵌合抗体的典型方法的详细内容公开在US483457 (Genentech专利）等中。"人源化抗 体"这一术语是指，含有包含实质上来自人抗体链（称为受体免疫球蛋白或抗体）的可变 区框架残基和实质上来自小鼠抗体（也称为供体免疫球蛋白或抗体）的最少1个互补决 定区的最少1条链的抗体。典型地为将嵌合抗体进一步改造成包含FR序列在内接近人序 列的结构从而使非人来源抗体在人体内的免疫原性降低的方法，代表性的改造方法公开在 EP0239400 ;MRC 专利、W090/07861 ;Protein Design Labs 专利或 EP0626390 ;Celltech 专 利）等中。在进行人源化、即向人可变区的FR中插入小鼠 CDR时，需要提高保持正确的空 间定位（spacial orientation)的可能性。为了实现这一点，所使用的人抗体的可变区的 FR的序列通过如下方法获得：从与供体可变区的FR序列具有高度的序列同一性的人抗体 获得FR序列。此时，作为所使用的人抗体序列，有使用天然存在的人抗体的序列的情况、或 者使用人抗体的共有序列或生殖细胞系列（种系）来源序列等的情况等。
[0130] 7)等效物
[0131] 在本发明的抗体的氨基酸序列中缺失、取代、插入、添加1个或数个氨基酸残基、 或者发生了上述任意2种以上的组合的突变、且保持了原抗体的活性（例如：对抗原的结合 能力）的物质与本发明为等效物。这种情况下，可以在同一序列中的任意的1个或多个氨 基酸序列中的位置具有1个或数个氨基酸残基的缺失、取代、插入或添加，也可以同时发生 缺失、取代、插入和添加中的2种以上突变。
[0132] 构成自然界的蛋白质的氨基酸可以根据其侧链的特性来分组，例如，作为具有同 样特性的氨基酸组，可以分类为：芳香族氨基酸（酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸）、碱性氨基 酸（赖氨酸、精氨酸、组氨酸）、酸性氨基酸（天冬氨酸、谷氨酸）、中性氨基酸（丝氨酸、苏 氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺）、具有烃链的氨基酸（丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨 酸）、以及其他氨基酸（甘氨酸、蛋氨酸、半胱氨酸）的组等。
[0133] 作为将非天然型氨基酸也包括在内的可相互取代的氨基酸残基的例子，还有如 下所述的分组法，同一组中所含的氨基酸残基可相互取代。A组：亮氨酸、异亮氨酸、正亮 氨酸、缬氨酸、正缬氨酸、丙氨酸、2-氨基丁酸、蛋氨酸、邻甲基丝氨酸、叔丁基甘氨酸、叔丁 基丙氨酸、环己基丙氨酸；B组：天冬氨酸、谷氨酸、异天冬氨酸、异谷氨酸、2-氨基己二酸、 2_氨基辛二酸；C组：天冬酰胺、谷氨酰胺；D组：赖氨酸、精氨酸、鸟氨酸、2, 4-二氨基丁酸、 2, 3-二氨基丙酸；E组：脯氨酸、3-羟基脯氨酸、4-羟基脯氨酸；F组：丝氨酸、苏氨酸、高丝 氨酸；G组：苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸。
[0134] 本说明书中，在对抗体序列的某一部位的氨基酸残基进行取代的情况下，例如使 用"ANB"的文字来表示。此时，"N"为该取代部位的编号（用Kabat编号法来表示），"A" 为将取代前的氨基酸残基用1个字母来表示，"B"为将取代后的氨基酸残基用1个字母来 表不。
[0135] 氨基酸序列、碱基序列的同一性可以使用Karlin和Altschul的算法 BLAST (PNAS, 1990 (vol. 87) p2264 ;PNAS, 1993 (vol. 90) p5873)来确定。已开发了基于 BLAST 算法的称为 BLASTN、BLASTX 的程序（J Mol Biol,1990(vol.215)p403)。在使用 BLASTN 对 碱基序列进行分析的情况下，参数例如设定为分数（score) = 100、字长（wordlength)= 12。另外，在使用BLASTX对氨基酸序列进行分析的情况下，参数例如设定为分数（score)= 50、字长（wordlength) =3。在使用BLAST和Gapped BLAST程序的情况下，使用各程序的 默认参数。或者，在求取蛋白质的氨基酸序列的同一性时，也可以将所比较的2种蛋白质的 氨基酸序列并排，通过目视计数作为相同的氨基酸残基的部分的数量，通过"（相同的氨基 酸残基数/蛋白质全长的氨基酸残基数）X 100 (%) "求出蛋白质的氨基酸序列的同一性。
[0136] 2.本发明中抗体产生杂交瘤的制作方法
[0137] 为了使用上述HMGBl抗原蛋白质来制作本发明中使用的大鼠来源的单克隆抗体 产生杂交瘤，使用该抗原对大鼠进行免疫，从该动物采集淋巴细胞，按照常规方法使其与骨 髓瘤细胞融合而获取杂交瘤，由此能够得到产生大鼠抗HMGBl单克隆抗体的杂交瘤。
[0138] 即，首先，例如，使用牛胸腺来源HMGBl与完全弗氏佐剂或不完全弗氏佐剂的混合 物作为免疫原对大鼠进行免疫。免疫时的免疫原的给药方法可以为皮下注射、腹腔内注射、 静脉内注射、肌肉内注射中的任意一种，但优选皮下注射或腹腔内注射。免疫可以进行1次 或者以适当的间隔进行多次，优选以1周至5周的间隔进行多次。接着，按照常规方法从免 疫后的动物采集淋巴结，使从其中以无菌方式得到的淋巴结细胞与小鼠骨髓瘤细胞进行细 胞融合，通过ELISA法等确认对HMGBl的结合性，反复进行目标抗体产生杂交瘤的克隆操 作，由此能够得到单克隆的抗体产生细胞。
[0139] 3.获取本发明的大鼠抗体的基因的步骤
[0140] 按照常规方法从产生大鼠抗体的杂交瘤细胞中纯化总RNA，接着合成cDNA。由所 得到的cDNA使用各自的引物进行PCR来扩增全长的H链和L链的抗体基因，由此获取各自 的基因片段。将这些基因片段连接到真核细胞表达用载体中，由此能够克隆该抗体的基因。 对于这些抗体的H链和L链的氨基酸序列，利用ABI测序仪确认编码上述氨基酸序列的质 粒载体的碱基序列，基于此，能够确定该抗体的氨基酸序列。
[0141] 4.人源化抗体的获取方法
[0142] 以下，记述从啮齿类抗体制作人源化抗体的情况的一例。以下记载的方法为人源 化的原则上的方法，当然也可以为该方法的变法。例如，首先，按照"Kabat等的定义"和/ 或"Chothia的定义"确定大鼠抗体的可变区中的互补决定区（CDR)的氨基酸。将该大鼠 抗体的CDR序列移植到作为受体的人抗体FR中，设计具有大鼠抗体的CDR和人抗体的FR 的可变区氨基酸序列。设计编码该可变区氨基酸序列的DNA的碱基序列，利用PCR法和基 因重组技术制作具有所设计的核酸序列的可变基因片段。然后，将该可变区基因与人抗体 的适当类别的恒定区基因、优选IgG类的抗体的恒定区基因连接，制作人源化抗体基因。接 着，将该人源化抗体基因连接到适当的表达载体中，并导入培养细胞中。最后，对该培养细 胞进行培养，从培养上清中能够得到人源化抗体。
[0143] 上述人源化抗体的制作方法中，大鼠抗体的可变区基因中的互补决定区基因可以 从基于上述的"Kabat的定义"的互补决定区的范围内确定。但是，本说明书中，仅对于H 链的⑶R1，将同时符合"Kabat的定义"和"Chothia的定义"这两种定义的区域作为⑶Rl 来处理。另外，可变区的氨基酸残基的位置表示按照Kabat的编号法（参考http://WWW. bioinf. org. uk/abs/#kabatnum 和 http://vbase. mrc-cpe. cam. ac. uk/)来表不。
[0144] 另一方面，作为成为模板的人抗体的框架区基因，例如从人抗体或人抗体的种系、 人抗体种系的共有序列等中选择与上述大鼠抗体的框架区的氨基酸序列的同源性高的序 列，通过常规方法制作编码该氨基酸序列的碱基序列，并使用该碱基序列即可。
[0145] 将上述的大鼠抗体的互补决定区基因与作为模板的人抗体的框架区基因连接，进 而，将该基因片段与人抗体的恒定区基因连接，制作人源化抗体基因（以下仅称为"人源化 抗体基因"）。
[0146] 需要说明的是，一般而言，在仅取代了互补决定区的氨基酸而得到的人源化抗体 的情况下，抗原结合活性大多比原来的大鼠抗体大幅降低。因此，多采用将供体的大鼠的抗 体和互补决定区周围的若干个氨基酸合并移植等方法。上述的人源化抗体具有与原大鼠抗 体同等或更高的抗原结合活性，并且与大鼠抗体相比消除了引起抗原性、半衰期缩短等问 题。但是，关于用于获取具有与原来的大鼠抗体同等以上的结合活性或中和活性等的人源 化抗体的氨基酸取代，没有定律，要求进行多次的反复尝试。
[0147] 5.本发明的人源化抗体或其抗原结合性片段
[0148] 本发明在一个实施方式中提供与HMGBl特异性结合且能够中和HMGBl的生物活性 的人源化抗体或其抗原结合性片段（以下称为本发明的抗体）。如本发明中所示，示出了 大鼠抗HMGBl抗体（#10-22)、其嵌合抗体及其人源化抗体的氨基酸序列的序列号、以及作 为人FR序列的参考的人抗体序列或者人生殖细胞系列（种系）来源氨基酸序列的序列号 (表 1、2 和 3)。
[0149] 作为本发明的人源化抗体或其抗原结合性片段，包括包含表3中序列号所示的 EV007156的全长、可变区或框架区的氨基酸序列的人源化抗体及其抗原结合性片段、以及 包含与这些氨基酸序列等效的氨基酸序列的人源化抗体及其抗原结合性片段。
[0150] [表 1]
[0151] (表1)大鼠#10-22抗体相关的氨基酸序列的序列编号
[0159] 考察GenGank等中登记的IGLV3-家族的L链可变区时，可以发现多数情况 下报道了其N末端以"S"起始，但在IGLV3-家族的序列中，在选择3j的氨基酸序列 (MAWTALLLSLLAHFTGSVA)或3r的氨基酸序列（MAWIPLFLGVLAYCTGSVA)作为信号序列的情 况下，有时也在2位的"Y"的前面被切断，因此，本发明中，作为人源化的模板的人FR序列 (序列号25~28 ;图3中表示为Human_VL)，选择了 1位的"Y"被切断后的序列。
[0160] 本发明的优选的抗体或抗原结合性片段例如为如下的人源化抗体或其抗原结合 性片段的情况：轻链的可变区含有（a)包含序列号7的氨基酸序列的重链CDRl的氨基酸 序列、(b)包含序列号8的氨基酸序列的重链CDR2的氨基酸序列和（c)包含序列号9的氨 基酸序列的重链CDR3的氨基酸序列、以及轻链的可变区含有（a)包含序列号10的氨基酸 序列的轻链CDRl的氨基酸序列、(b)包含序列号11的氨基酸序列的轻链CDR2的氨基酸序 列和（c)包含序列号12的氨基酸序列的轻链CDR3的氨基酸序列。但是，只要是与存在于 HMGBl的C末端结构域的序列号60所示的氨基酸序列（EEEDDDDE)特异性结合且能够中和 其生物活性的单克隆抗体，则不需要仅限定于上述CDR序列的组合，可以是在序列号7~12 这6个⑶R序列中具有1个~数个（具体而言为1~9个、1~8个、1~7个、1~6个、 1~5个、1~4个、1~3个、1~2个或1个）氨基酸残基的缺失、取代、插入、添加或者其 中任意2种以上突变的组合的氨基酸序列。如果考虑到本发明为人源化抗体，则作为本发 明的更优选的方式，当然优选6个CDR序列以及至少H链的49位和94位及L链的44位和 46位这4个位置的氨基酸残基为大鼠来源，但除此以外的部分的FR的氨基酸序列为人来源 序列。
[0161] 将本申请发明中L链可变区的人FR序列（human_VL ;序列号25~28(依次 为FR1、FR2、FR3和FR4的序列））部分与人λ (Iamda)链生殖细胞系列的LV3家族来源 的序列进行比较时，相当于FR1、2和3的部分与人λ (Iamda)链IGHLV3家族生殖细胞 系列的 humIGLV104( = IGLV3-l*01)、humIGLV034( = IGLV3-25*03)、humIGLV079(= IGLV3-25*02)、humIGLV135、humIGLV094( = IGLV3-10*01)和 humIGLV077(= IGLV3-27*01)(基因编号由"VBASE2ID"表示）的同一性高，仅有几个残基（少于10个）的 差异。另外，IGLV3的共有序列（例如，参考W02011/080350)中，与上述Human_VL也仅有 几个氨基酸残基的差异。另一方面，相当于人FR序列的FR4的部分（序列号28)的氨基酸 序列与人λ (