人分离外周血单个核细胞（PBMC)，考察EV007156的添加是否抑制用HMGBl 刺激时观察到的TNF-a的释放量。首先，使用Histopaque (SIGMA，#10771)对人外周血进行 离心（1400rpm，30分钟），分离、回收PBMC。接着，将所得到的PBMC使用Opti-MEM(Gibco) 以达到2 X IO5个细胞/孔的方式接种到96孔多孔板（BD，#353072)中。其中预先加入有 在37°C下预孵育了 30分钟的牛胸腺来源HMGBl (Chondrex，终浓度1 μ g/ml)和抗HMGBl 抗体（EV007156、S6、G4)或作为阴性对照抗体的对HMGBl不具有特异性的人单克隆抗体 (从终浓度10 μ g/ml开始梯度稀释）的混合液。将添加培养后24小时的培养上清回收， 使用人 TNF-a ELISA Ready-SET-Go ! (eBioscience，#88-7346)进行 TNF-α 的定量（图 11)。另外，该抑制效果在添加〇. 01 ug/ml的抗体时，EV007156为42. 0%，与此相对，S6为 21.3%，64为25.5%。另外，在添加0.1以8/!111的抗体的情况下4￥007156为75.9%，与此 相对，S6 为 49. 4%，G4 为 68. 5%。另外，50%抑制浓度（IC50)在 EV007156 为 0. 016yg/ ml (0· 106nM)，与此相对，在 S6 为 0· 106 μ g/ml (0· 706nM)，在 G4 为 0· 026 μ g/ml (0· 173nM) 以上。由此表明，EV007156的TNF- α释放抑制效果显著强于S6和G4。
[0257] 由此显示，本发明的人源化抗体EV007156对巨噬细胞和单核细胞细胞中的由 HMGBl引起的TLR-4受体介导的信号传导活化的抑制效果实质上很高。
[0258] 实施例7亲和性测定
[0259] 使用通过表面等离子共振检测生物体分子的结合相互作用的Biacore T200装置， 测定抗体对HMGBl的亲和性。首先，使EV007156、S6或G4以0. 5 μ g/ml的浓度吸附到传感 芯片（CM5)上作为配体。接着，使从IOnM起以2倍稀释系列制备的重组HMGBl流到传感芯 片上作为分析物，测量结合亲和性。由所得到的结果可知，各抗体的K d(M)值如下：EV007156 为 3· 29X 10，Μ，S6 和 G4 分别为 2· 67X 10'、6· 79X KT10M (表 5)。
[0260] [表 5]
[0261]
[0262] 实施例8药物动态试验
[0263] 将EV007156以10mg/kg腹腔内给药于8周龄的C57BL/6N(雌性），在给药后6 小时（0.25天）、3天、7天、14天、24天米血。通过3500rpm、10分钟的离心分离血清， 使所得到的血清在预先将抗人IgG抗体以250ng/孔的浓度固相化过夜的酶标板（Nunc， Maxisorp)中反应1小时。接着，使HRP标记的抗人IgG抗体（MBL，#208)反应1小时。加 入丁1^(3,3'，5,5'-四甲基联苯二胺 ；511代81脱，即1^，#52-00-03)后，通过45011111的吸光进 行抗体浓度的定量。另外，为了确认EV007156对抗原的结合性，使用将重组HMGBl以25ng/ 孔的浓度固相化过夜的酶标板（Nunc，Maxisorp)，按照与抗体定量同样的程序进行检测。 将结果示于图12中。从抗体给药6小时开始，血中抗体浓度已升高，在给药后3天血中抗 体浓度稳定于80 μ g/ml。然后，在给药后24天逐渐减少，最终达到40 μ g/ml。所给药的 EV007156在小鼠体内的半衰期计算为22. 8天。关于每单位抗体的抗原结合性，由于从给药 后3天至24天相对于抗体量的抗原结合性不降低，因此可知，EV007156即使在小鼠体内经 过24天，也具有与抗体量相符的抗原结合性，保持了作为抗体的稳定性。
[0264] 实施例9表位作图
[0265] (a)缺失构建体的制作
[0266] 在缺失构建体的制作之前，从HEK293克隆人来源的HMGBl基因。即，使用Cells to cDNA II(ambion，#AM1723)对HEK293进行RT-PCR，在N末端附加组氨酸标签，将扩增的 PCR片段克隆到pcDNA3. 1(+)载体中。利用测序仪（ABI，3130Genetic Analyzer)确认所得 到的基因序列与人HMGBl的基因没有差异。
[0267] 接着，为 了确定 EV007156 的表位，将 HMGBl 分类为 A-BOX、B-BOX、C-tail 这 3 个区域，制作总计6个种类的缺失构建体（全长HMGBI、A-Box+B-Box、A-Box+C-tai 1、 B-Box+C-tail、A-Box、B-Box和C-tail)(图13)。各缺失构建体的表达通过免疫荧光染色 和CBB染色法来确认。作为利用免疫荧光染色的确认，将表达各片段（包括全长在内的总计 7个种类）的质粒使用Lipofectamine LTX(Invitrogen)转染到CH0-K1细胞中。24小时 后将细胞用4%多聚甲醛固定，然后，使抗His抗体（MBL，PM032)以I μg/ml的浓度反应1 小时。接着，使Alexa488抗兔IgG抗体（Invitrogen，A11070)以I μg/ml的浓度反应1小 时，使用落射型荧光显微镜观察荧光信号（图14)。另一方面，作为利用CBB法的确认，在转 染后24小时的细胞中加入裂解缓冲液（PBS，0. 2% TritonX-100, ImM EDTA)，将细胞溶解。 使用Ni-琼脂糖6B (GE Healthcare)对细胞裂解液中含有的缺失构建体进行纯化。在利用 洗脱液（50mMTris-HCl (pH8. 0)、500mM NaCl、500mM咪唑）洗脱出来的样品中加入5XSDS样 品缓冲液，在95°C下煮沸5分钟。将各样品在12%聚丙烯酰胺凝胶中电泳后，使用CBB进 行染色，确认了缺失构建体的表达（图15)。由结果可知，免疫荧光染色、CBB染色法均确认 到C-tail以外的缺失构建体的表达。
[0268] (b)利用免疫荧光染色法的表位区域的检测
[0269] 使用Lipofectamine LTX(Invitrogen)将表达各片段（包括全长在内的总计7 个种类）的质粒转染到CHO-Kl细胞中。24小时后将细胞用4%多聚甲醛固定，然后，使 EV007156(1 μg/ml)反应1小时。接着，使Alexa488抗人IgG抗体以I μg/ml的浓度反应 1小时，使用落射型荧光显微镜观察荧光信号（图16)。可知EV007156除了与全长HMGBl 反应以外，还与A-Box+C-tail和B-Box+C-tail、即包含C末端的构建体反应。由此判断， EV007156的表位存在于HMGBl的C末端区域的可能性高。接着，对S6和G4也进行同样的 实验。由结果可知，S6(图16-b)和G4(图16-c)均与包含B-Box的构建体反应。得到了 与EV007156的染色图案不同的结果。
[0270] (c)利用蛋白免疫印迹法的表位区域的检测
[0271] 使用Lipofectamine LTX(Invitrogen)将表达各片段的质粒转染到CHO-Kl细胞 中。24小时后在细胞中加入裂解缓冲液（PBS，0.2%TritonX-100，lmM EDTA)，将细胞溶 解。接着，加入5XSDS样品缓冲液，在95°C下煮沸5分钟。将各样品在12%聚丙烯酰胺 凝胶中电泳后，以l〇〇mA、1小时的条件将蛋白质转印到PVDF膜上。将转印后的PVDF膜用 5%脱脂奶粉-TBST封闭2小时后，使EV007156(1 μ g/ml)在室温下反应1小时。接着，使 作为二次抗体的HRP标记抗人IgG (MBL，#208)在室温下反应1小时。使用ECL prime (GE Healthcare，RPN2232)检测EV007156(图17)。由结果可知，与免疫荧光染色的结果同 样，EV007156除了与全长HMGBl反应以外，还与包含C末端的构建体（A-Box+C-tail和 B-Box+C-tail)反应。因此判断，EV007156的表位存在于C末端区域。接着，对S6和G4也 进行同样的实验。可知S6和G4也与免疫荧光染色的结果同样地与包含B-Box的构建体 (A-Box+B-Box、B-Box+C-tail、仅 B-Box)反应。因此判断，S6 和 G4 的表位存在于 B-Box。 由此表明，EV007156具有与S6和G4不同的表位。
[0272] (d)肽作图（斑点印迹）
[0273] 为了确定EV007156对HMGBl的表位位于构成HMGBl的C末端的哪个氨基 酸，实施了肽作图。即，设计了包括9种间隔3个残基的长度为12个残基的氨基酸和 最靠 C末端的8个残基的1条肽在内的总计10种肽（#1. EEEEDEEDEEDE(序列号51)、 #2. EDEEDEEDEEEE (序列号 52)、#3. EDEEDEEEEEDE (序列号 53)、#4. EEDEEEEEDEED (序列号 54)、#5. DEEEEEDEEDED (序列号 55)、#6. EEEEDEEDEDEE (序列号 56)、#7. EEDEEDEDEEED (序 列号 57)、#8. DEEDEDEEEDDD(序列号 58)、#9. EDEDEEEDDDDE(序列号 59)、#10· EEEDDDDE (序 列号60))，囊括了构成HMGBl的C末端区域的氨基酸。将合成的肽（SIGMA-ALDRICH， PEPScreen)用0.1 M乙酸铵溶液以达到4mg/ml的方式溶解，以4 μ g/斑点滴加到硝酸纤维 素膜上。干燥后，用5%脱脂奶粉-TBST封闭90分钟。接着，使EV007156以lμg/ml的 浓度反应1小时。接着，使HRP标记的抗人IgG抗体（MBL，#208)反应1小时后，使用ECL prime(GE Healthcare，RPN2232)进行检测（图 18)。由结果可知，EV007156 强烈识别 HMGBl 的最靠 C末端的区域即#9. EDEDEEEDDDDE，更详细而言，识别最靠 C末端的8个残基（#10. EEEDDDDE(序列号 60))。
[0274] 实施例10EV007156对败血症模型小鼠的效果
[0275] 通过计算抗体给药后的存活率来考察EV007156能否防御由败血症引起的致死。 小鼠的败血症模型基于CLP法（Cecal ligation and puncture(盲肠结扎穿孔），Lutterloh et.al.)来制作。即，以达到80mg/kg的方式对BALB/c (日本SLC，雌性，8周龄，16只）腹 腔内给药苯巴比妥钠 （Nacalai Tesque，#26427-14)将其麻醉。从正中切开约Icm后，取 出盲肠，将其约90%用缝合线结扎。接着，使用23G的注射器针头（Terumo，#NN-2332S)将 盲肠壁在上下各贯通1次（总计2次）。将盲肠放回至腹腔的预定部位，用缝合线缝合切 开部。在切开部涂抹终浓度为1%的赛罗卡因（AstraZeneca)和125U/g的八7 Y <シ> (baramycin)(小野药品）。进而，以达到25mg/kg的方式肌肉内给药组胺（日医工）。次日， 在术后24小时，作为抗体给药组，以达到10mg/kg的方式腹腔内给药EV007156。另外，在对 照组中，仅腹腔内给药生理盐水。然后，实施状态观察直至抗体给药后6天为止，算出各组 的存活率（图19)。结果，在术后48小时对照组中存活率减少至50%，但在给药EV007156的 抗体给药组中存活率维持100%。该存活率的维持持续至术后5天。另外，术后6天的存活 率在对照组中为37. 5%，与此相对，在抗体给药组中高达87. 5%。由该结果表明，EV007156 的给药在基于CLP法的败血症模型小鼠中显著提高了小鼠的存活率，该抗体的给药对败血 症带来的致死为极其有效的手段。
[0276] 产业上的可利用性
[0277] 本发明的人源化抗HMGBl抗体或其抗原结合性片段与迄今为止的人来源抗HMGBl 抗体相比，对哺乳动物来源的HMGBl具有高的亲和性、中和活性，并且通过人源化减弱了大 鼠抗体的免疫原性，因此，在对人应用的方面有利，作为能够对多种严重的HMGBl相关疾病 提供新的治疗法、预防法的抗体是有用的。
【主权项】
1. 一种人源化抗体或其抗原结合性片段，其与存在于HMGBl蛋白的C末端结构域的氨 基酸序列（EEEDDDDE(序列号60))特异性结合，所述人源化抗体或其抗原结合性片段中， (i) 重链可变区（VH)含有： (a) 包含序列号7的氨基酸序列、或者在其氨基酸序列中具有1个~数个氨基酸残基的 缺失、取代、插入和/或添加的突变的氨基酸序列的重链CDRl的氨基酸序列、 (b) 包含序列号8的氨基酸序列、或者在其氨基酸序列中具有1个~数个氨基酸残基的 缺失、取代、插入和/或添加的突变的氨基酸序列的重链CDR2的氨基酸序列、以及 (c) 包含序列号9的氨基酸序列、或者在其氨基酸序列中具有1个~数个氨基酸残基的 缺失、取代、插入和/或添加的突变的氨基酸序列的重链CDR3的氨基酸序列； (ii) 轻链可变区（VL)含有： (a) 包含序列号10的氨基酸序列、或者在其氨基酸序列中具有1个~数个氨基酸残基 的缺失、取代、插入和/或添加的突变的氨基酸序列的轻链CDRl的氨基酸序列， (b) 包含序列号11的氨基酸序列、或者在其氨基酸序列中具有1个~数个氨基酸残基 的缺失、取代、插入和/或添加的突变的氨基酸序列的轻链CDR2的氨基酸序列、以及 (c) 包含序列号12的氨基酸序列、或者在其氨基酸序列中具有1个~数个氨基酸残基 的缺失、取代、插入和/或添加的突变的氨基酸序列的轻链CDR3的氨基酸序列。2. 如权利要求1所述的人源化抗体或其抗原结合性片段，其中， (i) 重链可变区（VH)含有： (a) 包含序列号7的氨基酸序列的重链CDRl的氨基酸序列、 (b) 包含序列号8的氨基酸序列的重链CDR2的氨基酸序列、以及 (c) 包含序列号9的氨基酸序列的重链CDR3的氨基酸序列； (ii) 轻链可变区（VL)含有： (a) 包含序列号10的氨基酸序列的轻链CDRl的氨基酸序列、 (b) 包含序列号11的氨基酸序列的轻链CDR2的氨基酸序列、以及 (c) 包含序列号12的氨基酸序列的轻链CDR3的氨基酸序列。3. 如权利要求1或2所述的人源化抗体或其抗原结合性片段，其中， ⑴重链可变区（VH)含有序列号43、44、45和46的氨基酸序列分别作为FR1、FR2、FR3 和FR4的氨基酸序列，其中，FR1、FR2、FR3和FR4的氨基酸序列可以分别在序列号43、44、45 和46的氨基酸序列中具有1个~数个氨基酸残基的缺失、取代、插入和/或添加的突变， (ii)轻链可变区（VL)含有序列号47、48、49和50的氨基酸序列分别作为FR1、FR2、 FR3和FR4的氨基酸序列，其中，FR1、FR2、FR3和FR4的氨基酸序列可以分别在序列号47、 48、49和50的氨基酸序列中具有1个~数个氨基酸残基的缺失、取代、插入和/或添加的突 变。4. 如权利要求1~3中任一项所述的人源化抗体或其抗原结合性片段，其中，含有： (i) 在重链可变区（VH)中至少49位和94位这两个位置的氨基酸残基为来源于大鼠抗 体#10-22的H的氨基酸残基（均为丙氨酸）的氨基酸序列、 (ii) 在轻链可变区（VL)中至少44位和46位这两个位置的氨基酸残基为来源于大鼠 抗体#10-22的L链的氨基酸残基（分别为异亮氨酸和精氨酸）的氨基酸序列。5. 如权利要求1~4中任一项所述的人源化抗体或其抗原结合性片段，其中，含有： (i) 包含与序列号41的氨基酸序列具有90%以上的同一性的氨基酸序列的重链可变 区（VH)、以及 (ii) 包含与序列号42的氨基酸序列具有90%以上的同一性的氨基酸序列的轻链可变 区（VL)〇6. 如权利要求1~5中任一项所述的人源化抗体或其抗原结合性片段，其中，含有： ⑴包含序列号41的氨基酸序列的重链可变区（VH)、以及 (ii)包含序列号42的氨基酸序列的轻链可变区（VL)。7. 如权利要求1~6中任一项所述的人源化抗体或其抗原结合性片段，其中，所述人源 化抗体的类别（亚类）为IgGl ( X )或IgG2 (入）。8. 如权利要求1~7中任一项所述的人源化抗体或其抗原结合性片段，其中，在 250ng/ml下比较对人HMGBl蛋白的结合活性（ELISA法）时，所述的人源化抗体或其抗原结 合性片段所具有的高活性是#10-22嵌合抗体的2倍以上。9. 如权利要求1~7中任一项所述的人源化抗体或其抗原结合性片段，其中，将人 腫681蛋白与1^6￡的结合抑制50%的活性（1050)为5 1^/1^(约331^)以下。10. 如权利要求1~7中任一项所述的人源化抗体或其抗原结合性片段，其中，将人 PBMC中由HMGBl蛋白刺激引起的TNF- a释放抑制50%的活性（IC50)为0. 02 y g/mL(约 0. 13nM)以下。11. 一种药物组合物，其含有权利要求1~7中任一项所述的人源化抗体或其抗原结合 性片段以及药学上可容许的载体。12. 如权利要求11所述的药物组合物，其用于由从细胞游离出的HMGBl诱发的各种 HMGBl相关疾病的治疗或预防。13. 如权利要求10所述的药物组合物，其用于疾病的治疗或预防，所述HMGB 1相关疾 病为脑梗塞、脑水肿、脑血管痉挛、外伤性脑损伤、动脉粥样硬化、神经源性疼痛、败血症、关 节炎、急性肺外伤、脑缺血、肾缺血和肝缺血等中的任意一种。14. 编码权利要求1~10中任一项所述的人源化抗体或其抗原结合性片段的氨基酸序 列的分离的核酸、或者在高严格条件下与这些核酸中的任意一种杂交的分离的核酸。15. -种重组表达载体，其整合有权利要求14所述的分离的核酸。16. -种宿主细胞，其导入有权利要求15所述的重组表达载体。
【专利摘要】本发明提供与由HMGB1蛋白的C末端的8个氨基酸残基(EEEDDDDE)构成的序列特异性结合、对与该蛋白质具有相关性的各种炎症性疾病的治疗或预防有效的人源化抗HMGB1抗体及其抗原结合性片段，并且提供含有该抗体或其抗原结合性片段的药物组合物。
【IPC分类】C12N5/10, A61P11/00, C12N1/21, A61P25/04, A61P9/10, C12N1/15, A61K39/395, A61P13/12, C07K16/18, C12N1/19, A61P25/28, A61P29/00, C07K16/46, C12N15/09, A61P1/16
【公开号】CN104955846
【申请号】CN201380071400
【发明人】高田贤藏, 寅岛崇, 西堀正洋
【申请人】株式会社伊贝克, 国立大学法人冈山大学
【公开日】2015年9月30日
【申请日】2013年12月6日
【公告号】CA2897914A1, EP2949675A1, US20150361164, WO2014115430A1