对人偏肺病毒具有特异性的人抗体或其抗原结合性片段的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及与人偏肺病毒（human metapneumovirus)的F蛋白质特异性结合且中 和人偏肺病毒的生物活性的单克隆抗体及其抗原结合性片段。
【背景技术】
[0002] 呼吸器官感染症在罹患率和死亡率方面可以说是人类的主要疾病之一。特别是在 不满5岁的儿童中，呼吸器官感染症排名在死亡原因的前列。据报道，在美国，若将肺炎、流 感和流感样疾病包括在内，则每年死亡45000人以上，年医疗费达到146亿美元（非专利文 献1)。
[0003] 作为呼吸器官感染症的致病病毒，已知RS病毒（respiratory syncytial virus : RSV ;呼吸道合胞病毒）、副流感病毒、流感病毒、冠状病毒、鼻病毒、腺病毒等。最近，陆续发 现了人偏肺病毒（human metapneumovirus :hMPV)、SARS冠状病毒和人博卡病毒等引起呼 吸器官感染症的病毒，其中，hMPV是在2001年由荷兰的研宄小组首次分离、鉴定的病毒（非 专利文献2)。该hMPV是一直以来在人之间普遍存在的病毒，但难以进行病毒分离，因此是 迄今未被发现的病毒。
[0004] 人偏肺病毒（hMPV)为单链（负链）RNA病毒，被分类为副粘病毒科、肺病毒亚 科、偏肺病毒属，具有编码N蛋白质、P蛋白质、M蛋白质、F蛋白质、M2蛋白质、SH蛋白质、 G蛋白质和L蛋白质的8个基因（非专利文献2)。hMPV的基因序列与禽肺病毒（Avian pneumovirus :APV)最类似，另外，在人的病毒中，在基因序列和临床症状的方面与RSV类似 (非专利文献3)。hMPV根据血清学特征被分类为A和B这两个组，进一步又各自分为两个 亚组（Al和A2、B1和B2)(非专利文献4)，其中，成为近来世界范围内流行的主流的为A2株 (非专利文献5)。据报道，在病毒表面存在F蛋白质、G蛋白质和SH蛋白质，但血清中存在 的抗hMPV的主要中和抗体为抗F蛋白质的抗体（非专利文献6和7)。
[0005] 根据Williams等的小组的调查，报道了在不满5岁的儿童呼吸器官感染症患者 中，下呼吸道感染症患者的20 %、上呼吸道感染症患者的15 %感染了 hMPV (非专利文献7)， 在血液中的抗体效价低的6个月至1岁的婴幼儿、免疫功能低下的老年人、免疫缺陷状态的 患者中，存在重症化的危险性，需要特别注意。
[0006] 目前，虽然确立了 hMPV的检查方法，但在抗病毒药中没有有效的药物，基本采取 对症疗法。作为hMPV的治疗/预防药，正在研宄对hMPV的F蛋白质具有特异性的抗体药 品（专利文献1、2和非专利文献9)、活用减毒化病毒等的疫苗的开发等（专利文献3和4)。 最近，报道了与hMPV和RSV这两者的F蛋白质均结合的人抗体（专利文献5)，但可以说只 是刚刚开始。
[0007] 现有技术文献
[0008] 专利文献
[0009] 专利文献 I :TO2006/110214
[0010] 专利文献 2:W〇2〇〇8/043〇52
[0011] 专利文献 3 :W02002/057302
[0012] 专利文献 4 :TO2003/072719
[0013] 专利文献 5 :W02013/140247
[0014] 非专利文献
[0015] 非专利文献 I :Clin. Micro. Reviews, 2006 (vol. 19) p546
[0016] 非专利文献 2 :Nature Medicine, 2001 (vol. 7) ρ719
[0017] 非专利文献 3 :Virology, 2002(νο1· 295)pll9
[0018] 非专利文献 4 :Emerg. Infect. Dis. , 2004 (vol. 10) p658
[0019] 非专利文献 5 :PLoS ONE, 2〇l2 (vol. 7) e：34544
[0020] 非专利文献 6 J. Virol. , 2004 (vol. 78) p6927
[0021] 非专利文献 7 J. Gen. Virol. , 2004 (vol. 85)pl655
[0022] 非专利文献 8 :New Eng. J. Med. , 2004 (vol. 350) p443
[0023] 非专利文献 9 J. Virol. , 2006 (vol. 80) p7799
【发明内容】
[0024] 发明所要解决的问题
[0025] 关于2001年明确为呼吸器官感染症的致病病毒的人偏肺病毒（hMPV)，据称在不 满5岁的儿童的呼吸器官感染症患者中，15~20%为由该病毒引起的疾病，特别是在6个 月至1岁的婴幼儿、免疫功能低下的老年人、免疫缺陷状态的患者中，存在重症化的危险 性。作为与hMPV类似的人病毒，有RSV，作为该疾病的预防药，特异性识别RSV的F蛋白质 的抗体药品（Synagis)已获得许可，正在许多国家销售。但是，针对hMPV的治疗还只是对 症疗法。其中，报道了活用减毒化病毒等的疫苗的研宄（专利文献3和4)以及对hMPV的 F蛋白质具有特异性的抗体药品的研宄等，但作为人来源抗体的例子，仅报道了与Synagis 同样地识别该病毒的F蛋白质的人Fab抗体DS λ 7等（专利文献2)。
[0026] 但是，从抗体DS λ 7等的亲和性、中和活性等来考虑，活性仍然较低，作为候选药 物，均还有改善的余地。特别是作为抗hMPV的抗体药物，期望对Al、Α2、Bl和Β2株具有广 泛且高的中和活性的抗体，如果可能，则期望对最近成为流行的主流的hMPV_A2株具有特 别高的中和活性的抗体。
[0027] 另外，考虑到病毒的耐性化等，还需要表位不同的抗体。此外，嵌合抗体和人源化 抗体均存在免疫原性方面的问题，作为候选药品的抗hMPV抗体，也强烈期望完全的人来源 的抗体。
[0028] 用于解决问题的方法
[0029] 其中，为了制作以更低的用量显示出与现有同等或更高的有效性的人来源的单克 隆抗体，反复进行了深入研宄，成功地制作了与hMPV的F蛋白质特异性结合、对hMPV具有 广泛且高的中和活性并且按照表位分类被分类为若干不同的组的多种抗体，从而完成了本 发明。
[0030] 即，本发明涉及以下[1]~[41]所述的对人偏肺病毒（hMPV)的F蛋白质具有特 异性的人单克隆抗体或其抗原结合性片段、编码该抗体或其抗原结合性片段的核酸（多核 苷酸）、含有该核酸的表达载体、含有该载体的宿主细胞、以及含有本发明的抗体或抗原结 合性片段的药物组合物等。
[0031] [1] -种抗体或其抗原结合性片段，其为与人偏肺病毒的F蛋白质特异性结合且 能够中和其生物活性的抗体或其抗原结合性片段，其中，
[0032] (i)重链的可变区含有：
[0033] (a)选自序列号 3、13、23、33、43、53、63、73、83、93、103、113和123的氨基酸序列以 及在这些氨基酸序列中具有一个~数个氨基酸残基的缺失、取代、插入和/或添加的突变 的氨基酸序列的组中的重链CDRl的氨基酸序列、
[0034] (b)选自序列号 4、14、24、34、44、54、64、74、84、94、104、114和124的氨基酸序列以 及在这些氨基酸序列中具有一个~数个氨基酸残基的缺失、取代、插入和/或添加的突变 的氨基酸序列的组中的重链CDR2的氨基酸序列、以及
[0035] (c)选自序列号 5、15、25、35、45、55、65、75、85、95、105、115和125的氨基酸序列以 及在这些氨基酸序列中具有一个~数个氨基酸残基的缺失、取代、插入和/或添加的突变 的氨基酸序列的组中的重链CDR3的氨基酸序列；
[0036] (ii)轻链的可变区含有：
[0037] (a)选自序列号 8、18、28、38、48、58、68、78、88、98、108、118和128的氨基酸序列以 及在这些氨基酸序列中具有一个~数个氨基酸残基的缺失、取代、插入和/或添加的突变 的氨基酸序列的组中的轻链CDRl的氨基酸序列、
[0038] (b)选自序列号 9、19、29、39、49、59、69、79、89、99、109、119和129的氨基酸序列以 及在这些氨基酸序列中具有一个~数个氨基酸残基的缺失、取代、插入和/或添加的突变 的氨基酸序列的组中的轻链CDR2的氨基酸序列、以及
[0039] (c)选自序列号 10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120和130的氨基酸序列 以及在这些氨基酸序列中具有一个~数个氨基酸残基的缺失、取代、插入和/或添加的突 变的氨基酸序列的组中的轻链CDR3的氨基酸序列。
[0040] [2]如[1]所述的抗体或其抗原结合性片段，其中，
[0041] (i)重链的可变区含有：
[0042] (a)包含序列号3的氨基酸序列的重链⑶Rl的氨基酸序列、
[0043] (b)包含序列号4的氨基酸序列的重链⑶R2的氨基酸序列、以及
[0044] (c)包含序列号5的氨基酸序列的重链CDR3的氨基酸序列；
[0045] (ii)轻链的可变区含有：
[0046] (a)包含序列号8的氨基酸序列的轻链CDRl的氨基酸序列、
[0047] (b)包含序列号9的氨基酸序列的轻链⑶R2的氨基酸序列、以及
[0048] (c)包含序列号10的氨基酸序列的轻链⑶R3的氨基酸序列。
[0049] [3]如[1]所述的抗体或其抗原结合性片段，其中，
[0050] (i)重链的可变区含有：
[0051] (a)包含序列号13的氨基酸序列的重链⑶Rl的氨基酸序列、
[0052] (b)包含序列号14的氨基酸序列的重链⑶R2的氨基酸序列、以及
[0053] (c)包含序列号15的氨基酸序列的重链⑶R3的氨基酸序列；
[0054] (ii)轻链的可变区含有：
[0055] (a)包含序列号18的氨基酸序列的轻链⑶Rl的氨基酸序列、
[0056] (b)包含序列号19的氨基酸序列的轻链⑶R2的氨基酸序列、以及
[0057] (c)包含序列号20的氨基酸序列的轻链⑶R3的氨基酸序列。
[0058] [4]如[1]所述的抗体或其抗原结合性片段，其中，
[0059] (i)重链的可变区含有：
[0060] (a)包含序列号23的氨基酸序列的重链⑶Rl的氨基酸序列、
[0061] (b)包含序列号24的氨基酸序列的重链⑶R2的氨基酸序列、以及
[0062] (c)包含序列号25的氨基酸序列的重链⑶R3的氨基酸序列；
[0063] (ii)轻链的可变区含有：
[0064] (a)包含序列号28的氨基酸序列的轻链⑶Rl的氨基酸序列、
[0065] (b)包含序列号29的氨基酸序列的轻链⑶R2的氨基酸序列、以及
[0066] (c)包含序列号30的氨基酸序列的轻链⑶R3的氨基酸序列。
[0067] [5]如[1]所述的抗体或其抗原结合性片段，其中，
[0068] (i)重链的可变区含有：
[0069] (a)包含序列号33的氨基酸序列的重链⑶Rl的氨基酸序列、
[0070] (b)包含序列号34的氨基酸序列的重链⑶R2的氨基酸序列、以及
[0071] (c)包含序列号35的氨基酸序列的重链⑶R3的氨基酸序列；
[0072] (ii)轻链的可变区含有：
[0073] (a)包含序列号38的氨基酸序列的轻链⑶Rl的氨基酸序列、
[0074] (b)包含序列号39的氨基酸序列的轻链⑶R2的氨基酸序列、以及
[0075] (c)包含序列号40的氨基酸序列的轻链⑶R3的氨基酸序列。
[0076] [6]如[1]所述的抗体或其抗原结合性片段，其中，
[0077] (i)重链的可变区含有：
[0078] (a)包含序列号43的氨基酸序列的重链⑶Rl的氨基酸序列、
[0079] (b)包含序列号44的氨基酸序列的重链⑶R2的氨基酸序列、以及
[0080] (C)包含序列号45的氨基酸序列的重链⑶R3的氨基酸序列；
[0081] (ii)轻链的可变区含有：
[0082] (a)包含序列号48的氨基酸序列的轻链⑶Rl的氨基酸序列、
[0083] (b)包含序列号49的氨基酸序列的轻链⑶R2的氨基酸序列、以及
[0084] (c)包含序列号50的氨基酸序列的轻链⑶R3的氨基酸序列。
[0085] [7]如[1]所述的抗体或其抗原结合性片段，其中，
[0086] ⑴重链的可变区含有：
[0087] (a)包含序列号53的氨基酸序列的重链⑶Rl的氨基酸序列、
[0088] (b)包含序列号54的氨基酸序列的重链⑶R2的氨基酸序列、以及
[0089] (c)包含序列号55的氨基酸序列的重链⑶R3的氨基酸序列；
[0090] (ii)轻链的可变区含有：
[0091] (a)包含序列号58的氨基酸序列的轻链⑶Rl的氨基酸序列、
[0092] (b)包含序列号59的氨基酸序列的轻链⑶R2的氨基酸序列、以及
[0093] (c)包含序列号60的氨基酸序列的轻链⑶R3的氨基酸序列。
[0094] [8]如[1]所述的抗体或其抗原结合性片段，其中，
[0095] (i)重链的可变区含有：
[0096] (a)包含序列号63的氨基酸序列的重链⑶Rl的氨基酸序列、
[0097] (b)包含序列号64的氨基酸序列的重链⑶R2的氨基酸序列、以及
[0098] (c)包含序列号65的氨基酸序列的重链⑶R3的氨基酸序列；
[0099] (ii)轻链的可变区含有：
[0100] (a)包含序列号68的氨基酸序列的轻链⑶Rl的氨基酸序列、
[0101] (b)包含序列号69的氨基酸序列的轻链⑶R2的氨基酸序列、以及
[0102] (c)包含序列号70的氨基酸序列的轻链⑶R3的氨基酸序列。
[0103] [9]如[1]所述的抗体或其抗原结合性片段，其中，
[0104] ⑴重链的可变区含有：
[0105] (a)包含序列号73的氨基酸序列的重链⑶Rl的氨基酸序列、
[0106] (b)包含序列号74的氨基酸序列的重链⑶R2的氨基酸序列、以及
[0107] (c)包含序列号75的氨基酸序列的重链⑶R3的氨基酸序列；
[0108] (ii)轻链的可变区含有：
[0109] (a)包含序列号78的氨基酸序列的轻链⑶Rl的氨基酸序列、
[0110] (b)包含序列号79的氨基酸序列的轻链⑶R2的氨基酸序列、以及
[0111] (c)包含序列号80的氨基酸序列的轻链⑶R3的氨基酸序列。
[0112] [10]如[1]所述的抗体或其抗原结合性片段，其中，
[0113] ⑴重链的可变区含有：
[0114] (a)包含序列号83的氨基酸序列的重链⑶Rl的氨基酸序列、
[0115] (b)包含序列号84的氨基酸序列的重链⑶R2的氨基酸序列、以及
[0116] (c)包含序列号85的氨基酸序列的重链⑶R3的氨基酸序列；
[0117] (ii)轻链的可变区含有：
[0118] (a)包含序列号88的氨基酸序列的轻链⑶Rl的氨基酸序列、
[0119] (b)包含序列号89的氨基酸序列的轻链⑶R2的氨基酸序列、以及
[0120] (c)包含序列号90的氨基酸序列的轻链⑶R3的氨基酸序列。
[0121] [11]如[1]所述的抗体或其抗原结合性片段，其中，
[0122] (i)重链的可变区含有：
[0123] (a)包含序列号93的氨基酸序列的重链⑶Rl的氨基酸序列、
[0124] (b)包含序列号94的氨基酸序列的重链⑶R2的氨基酸序列、以及
[0125] (c)包含序列号95的氨基酸序列的重链⑶R3的氨基酸序列；
[0126] (ii)轻链的可变区含有：
[0127] (a)包含序列号98的氨基酸序列的轻链⑶Rl的氨基酸序列、
[0128] (b)包含序列号99的氨基酸序列的轻链⑶R2的氨基酸序列、以及
[0129] (c)包含序列号100的氨基酸序列的轻链⑶R3的氨基酸序列。
[0130] [12]如[1]所述的抗体或其抗原结合性片段，其中，
[0131] (i)重链的可变区含有：
[0132] (a)包含序列号103的氨基酸序列的重链⑶Rl的氨基酸序列、
[0133] (b)包含序列号104的氨基酸序列的重链⑶R2的氨基酸序列、以及
[0134] (c)包含序列号105的氨基酸序列的重链⑶R3的氨基酸序列；
[0135] (ii)轻链的可变区含有：
[0136] (a)包含序列号108的氨基酸序列的轻链⑶Rl的氨基酸序列、
[0137] (b)包含序列号109的氨基酸序列的轻链⑶R2的氨基酸序列、以及
[0138] (c)包含序列号110的氨基酸序列的轻链⑶R3的氨基酸序列。
[0139] [13]如[1]所述的抗体或其抗原结合性片段，其中，
[0140] (i)重链的可变区含有：
[0141] (a)包含序列号113的氨基酸序列的重链⑶Rl的氨基酸序列、
[0142] (b)包含序列号114的氨基酸序列的重链⑶R2的氨基酸序列、以及
[0143] (c)包含序列号115的氨基酸序列的重链⑶R3的氨基酸序列；
[0144] (ii)轻链的可变区含有：
[0145] (a)包含序列号118的氨基酸序列的轻链⑶Rl的氨基酸序列、
[0146] (b)包含序列号119的氨基酸序列的轻链⑶R2的氨基酸序列、以及
[0147] (c)包含序列号120的氨基酸序列的轻链⑶R3的氨基酸序列。
[0148] [14]如[1]所述的抗体或其抗原结合性片段，其中，
[0149] ⑴重链的可变区含有：
[0150] (a)包含序列号123的氨基酸序列的重链⑶Rl的氨基酸序列、
[0151] (b)包含序列号124的氨基酸序列的重链⑶R2的氨基酸序列、以及
[0152] (c)包含序列号125的氨基酸序列的重链⑶R3的氨基酸序列；
[0153] (ii)轻链的可变区含有：
[0154] (a)包含序列号128的氨基酸序列的轻链⑶Rl的氨基酸序列、
[0155] (b)包含序列号129的氨基酸序列的轻链⑶R2的氨基酸序列、以及
[0156] (c)包含序列号130的氨基酸序列的轻链⑶R3的氨基酸序列。
[0157] [15]如[1]~[14]中任一项所述的抗体或其抗原结合性片段，其中，含有：
[0158] (a)选自序列号 2、12、22、32、42、52、62、72、82、92、102、112和122的氨基酸序列以 及与这些氨基酸序列具有95%以上的同一性的氨基酸序列的组中的重链可变区（VH)、以 及
[0159] (b)选自序列号 7、17、27、37、47、57、67、77、87、97、107、117和127的氨基酸序列以 及与这些氨基酸序列具有95%以上的同一性的氨基酸序列的组中的轻链可变区（VL)。
[0160] [16]如[15]所述的抗体或其抗原结合性片段，其中，含有：
[0161] (a)包含序列号2的氨基酸序列或者与序列号2的氨基酸序列具有95%以上的同 一性的氨基酸序列的重链可变区（VH)、以及
[0162] (b)包含序列号7的氨基酸序列或者与序列号7的氨基酸序列具有95 %以上的同 一性的氨基酸序列的轻链可变区（VL)。
[0163] [17]如[15]所述的抗体或其抗原结合性片段，其中，含有：
[0164] (a)包含序列号12的氨基酸序列或者与序列号12的氨基酸序列具有95%以上的 同一性的氨基酸序列的重链可变区（VH)、以及
[0165] (b)包含序列号17的氨基酸序列或者与序列号17的氨基酸序列具有95%以上的 同一性的氨基酸序列的轻链可变区（VL)。
[0166] [18]如[15]所述的抗体或其抗原结合性片段，其中，含有：
[0167] (a)包含序列号22的氨基酸序列或者与序列号22的氨基酸序列具有95%以上的 同一性的氨基酸序列的重链可变区（VH)、以及
[0168] (b)包含序列号27的氨基酸序列或者与序列号27的氨基酸序列具有95%以上的 同一性的氨基酸序列的轻链可变区（VL)。
[0169] [19]如[15]所述的抗体或其抗原结合性片段，其中，含有：
[0170] (a)包含序列号32的氨基酸序列或者与序列号