氨 基酸序列；在序列号122的氨基酸序列中具有一个~数个（具体而言为1~9个、1~8个、 1~7个、1~6个、1~5个、1~4个、1~3个、1~2个或1个）氨基酸残基的缺失、取 代、插入、添加或者其中任意2种以上突变的组合的氨基酸序列；或者与序列号122的氨基 酸序列具有60 %以上（优选70%以上、80%以上、90 %以上、95%以上、96%以上、97 %以 上、98%以上或99%以上）的同一性的氨基酸序列表示的重链可变区（VH)，以及（b-13)由 序列号127的氨基酸序列；在序列号127的氨基酸序列中具有一个~数个（具体的数量与 上述同样）氨基酸残基的缺失、取代、插入、添加或者其中任意2种以上突变的组合的氨基 酸序列；或者与序列号127的氨基酸序列具有60%以上（具体的百分数与上述同样）的同 一性的氨基酸序列表示的轻链可变区（VL)。
[0268] 这些抗体的制作方法可以使用公知的方法（Riechmann L, et al.，Reshaping human antibodies for therapy. Nature, 332:323-327, 1988)。本发明中，当然优选完全人 抗体。
[0269] 3.编码本发明的抗体等的核酸
[0270] 根据本发明的另一实施方式，作为编码与hMPV的F蛋白质特异性结合且能够中和 其生物活性的抗hMPV抗体或其抗原结合性片段的核酸（核苷酸）且编码选自由序列号4~ 15、18~29和32~43组成的组中的氨基酸序列的核酸以及与该核酸具有高同一性的分 离的核酸也包含在本发明中。在此，"具有高同一性"是指能够在高严格条件下与预定的核 酸序列杂交的程度的序列同一性，例如是指具有60%、70%、80%、90%、95%或更高的同一 性。本发明提供选自在高严格条件下杂交的核酸中的分离的核酸。上述核酸优选为DNA或 RNA，更优选为DNA。
[0271] "在高严格条件下"例如为5XSSC、5X邓哈特（Denhardt's)溶液、0. 5% SDS、50% 甲酰胺、50°C 的条件（例如，参考 J. Sambrook 等人的Molecular Cloning, A Laboratory Manual (分子克隆实验指南），第二版，冷泉港实验室出版社（1989)，特别是11. 45节 "Conditions for Hybridization of Oligonucleotide Probes (寡核苷酸探针的杂交条 件）")。在这些条件下，越提高温度，越可以期待高效地得到具有高同一性的多核苷酸（例 如，DNA)。其中，作为影响杂交的严格度的要素，考虑有温度、探针浓度、探针的长度、离子强 度、时间、盐浓度等多个要素，本领域技术人员可以通过对这些要素进行适当选择来实现同 样的严格度。
[0272] 作为上述在高严格条件下杂交的核酸，包含与编码氨基酸序列的核酸具有例如 70%以上、80%以上、90%以上、95%以上、97%以上或99%以上的同一性的核酸。
[0273] 碱基序列的同一"性可以利用上述的同一"性检索算法等来确定（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 872264-2268, 1990 ;Proc Natl Acad Sci USA 90:5873,1993)。
[0274] 需要说明的是，作为编码本发明的抗hMPV抗体的核酸，优选的核酸为编码包含序 列号 3 ~5、8 ~10、13 ~15、18 ~20、23 ~25、28 ~30、33 ~35、38 ~40、43 ~45、48 ~ 50、53 ~55、58 ~60、63 ~65、68 ~70、73 ~75、78 ~80、83 ~85、88 ~90、93 ~95、98 ~ 100、103 ~105、108 ~110、113 ~115、118 ~120、123 ~125 和 128 ~130 这 26 种 CDR 序 列的组合中的任意1个组合的CDR序列的抗体的H链或L链或其抗原结合性片段的DNA， 更优选为编码包含序列号 2、7、12、17、22、27、32、37、42、47、52、57、62、67、72、77、82、87、92、 97、102、107、112、117、122和127中的任意一种VH或VL的抗体的H链或L链或其抗原结合 性片段的DNA，或者在高严格条件下与这些核酸（DNA)中的任意一种杂交的分离的核酸。
[0275] 进一步更优选的核酸为编码序列号 1、6、11、16、21、26、31、36、41、46、51、56、61、 66、71、76、81、86、91、96、101、106、111、116、121或126的氨基酸序列的核酸，或者在高严格 条件下与这些核酸中的任意一种杂交的分离的核酸。
[0276] 4.本发明的载体、宿主细胞和抗体的制作方法
[0277] 本发明还涉及整合有上述核酸的载体、导入有该载体的宿主细胞以及使用该载体 和该宿主细胞的抗体的制作方法。
[0278] 本发明的抗体也可以作为使用公知的方法的重组人抗体来制作（参考 Nature, 312:643, 1984、Nature，321:522, 1986等）。例如，本发明的抗体可以通过如下方法 制作：对导入有本发明的载体的宿主细胞进行培养，从培养上清等中纯化所产生的抗体。更 具体而言，可以通过如下方法制造：将编码VH和VL的cDNA分别插入到含有由同一细胞或 不同的人细胞制作的编码人抗体CH和/或人抗体CL的基因的动物细胞用表达载体中，构 建人抗体表达载体，导入动物细胞中并使其进行表达。
[0279] 作为用于整合编码本发明的抗体的VH或VL的核酸的载体，不一定是限定的，但优 选在蛋白质基因等的表达中通用且特别适合于抗体基因的表达的载体或高表达用载体。作 为优选的例子，可以列举含有EF启动子和/或CMV增强子的载体。另外，通常分别制作整 合有编码VH或VL的核酸的表达载体并将其共转染到宿主细胞中，但也可以整合到单一的 表达载体中。
[0280] 作为用于导入表达载体的宿主细胞，不一定是限定的，但优选在蛋白质基因等的 表达中通用且特别适合于抗体基因的表达的细胞。例如，可以列举细菌（大肠杆菌等）、放 线菌、酵母、昆虫细胞（SF9等）、哺乳类细胞（C0S-1、CH0、骨髓瘤细胞等）。
[0281] 为了在工业上生产重组抗体，一般利用稳定地高产该抗体的重组动物细胞株、例 如CHO细胞株。这种重组细胞株的制作、克隆化、用于高表达的基因扩增和筛选可以使用公 知的方法（例如，参考 Omasa T. :J. Biosci. Bioeng.，94, 600-605, 2002 等）。
[0282] 本发明除了包含由2条重链和2条轻链构成的抗体以外，还包含本发明的抗体的 抗原结合性片段。作为抗原结合性片段，例如有Fab (fragment of antigen binding，抗体 结合片段）、Fab'、F(ab'）2，作为将抗体的活性片段用接头等结合而成的片段，例如有单链 抗体（single chain Fv :scFv)、二硫键稳定化抗体（disulfide stabilized Fv :dsFv)，作 为含有抗体的活性片段的肽，例如可以列举含有CDR的肽。这些片段可以通过将本发明的 抗体用适当的蛋白分解酶进行处理的方法或者基因重组技术等公知的方法来制造。
[0283] 抗体的纯化可以使用盐析法、凝胶过滤法、离子交换层析法或亲和层析法等公知 的纯化手段来进行。
[0284] 此外，也可以通过近年来开发的、利用基因工程技术使重组抗体在噬菌体表面表 达的噬菌体展示抗体技术，人工地替换VH、VL基因，以噬菌体融合蛋白质的形式表达多样 化的scFv(singlechain Fragment of variable region，单链可变区片段）抗体，得到特异 抗体。该技术能够避免免疫，作为进一步替代细胞融合法的人源化抗体制作技术得到很高 评价。使用该技术以本申请说明书中的序列号2~6、8~12、14~18和20~24的氨基 酸序列为参考而制作的特异抗体或其抗原结合性片段属于本发明的技术范围内。
[0285] 此外，将近年来开发的通过抗体的糖链部分的修饰来大幅改善抗体的ADCC 活性的Potellegent技术应用于本发明的抗体而得到的抗体（参考Clin. Cancer Res.，10, 6248-6255(2004))、将改善CDC活性的Complegnent技术应用于本发明的抗体 而得到的抗体（参考Glycobiology，17, 104-118(2007))也属于本发明的技术范围。同 样，利用近年来开发的通过对抗体的恒定区部分的氨基酸序列进行修饰来改变ADCC活性 (W02007/039682 和 TO2007/100083)、CDC 活性（TO2007/011041 和 TO2011/091078)的方法 而得到的抗体也属于本发明的技术范围。
[0286] 此外，应用为了对该抗体附加抗蛋白酶能力、使抗体能够口服施用而进行的Fc区 域的部分取代技术（参考W02006/071877)而得到的抗体或其抗原结合性片段属于本发明 的技术范围内。
[0287] 需要说明的是，作为抗体制作的方法，通常利用小鼠、兔、山羊等实验动物来获得 多克隆抗体、单克隆抗体，但这样得到的抗体具有所使用的动物种的特征性序列，因此，如 果直接施用于人，有时会被人免疫系统识别为异物而引起人抗动物抗体应答（即，产生抗 体的抗体）。
[0288] 本发明的抗hMPV单克隆抗体或其抗原结合性片段可以由健康人等的血液来源的 抗体产生细胞获得，该抗体为完全人抗体。认为该完全人抗体即使作为抗体药物施用于人 体，也不具有免疫原性，观察不到免疫反应。
[0289] 需要说明的是，特别是对于本发明的抗hMPV的F蛋白质的单克隆抗体而言，具有 比以往的抗hMPV抗体更高的中和能力，因此，能够以更少的施用量期待相同程度的治疗效 果。
[0290] 5.含有本发明的抗体的药物组合物
[0291] 接下来，本发明提供含有上述抗体或其抗原结合部分以及药学上可容许的载体 的、用于治疗或预防由hMPV引起的呼吸器官疾病的药物组合物。
[0292] 特别地，本发明的抗hMPV抗体或其抗原结合性片段与hMPV的F蛋白质特异性结 合且具有比以往的抗hMPV的F蛋白质抗体更高的中和能力，因此，作为hMPV相关疾病的预 防或治疗药有用。
[0293] 本说明书中使用的"药学上可容许的载体"包括生理学上可适合的任意的或全部 的溶剂、分散介质、包衣剂、等渗剂和吸收延缓剂等。
[0294] 药学上可容许的载体的例子包括水、盐类溶液、磷酸缓冲的生理盐水、右旋糖、甘 油、乙醇等中的1种或多种以及它们的组合。在作为注射剂等使用的情况下，优选在组合物 中含有PH调节剂、等渗剂，例如糖、甘露醇、山梨醇等多元醇或氯化钠。药学上可容许的载 体中可以进一步含有润湿剂、乳化剂、防腐剂、缓冲剂、稳定剂等增强抗体或抗体部分的保 存性或有效性的少量的辅助物质。
[0295] 本发明的组合物可以制成各种剂型。这样的组合物包括例如溶液（例如可注射、 可输液的溶液）、分散液、悬浊液、片剂、胶囊、含片、丸剂、粉末、脂质体、栓剂等液体、半固 体、固体的剂型。优选的形式根据所需的施用方式和治疗的适用例而不同。一般而言，优选 的组合物为与用于使用其他抗体对人进行被动免疫的组合物同样的组合物等可注射或可 输液的溶液的形式的组合物。优选的施用方式为非口服方式（例如经由静脉内、皮下、腹腔 内、肌肉内）。在优选的实施方式中，抗体通过静脉输液或静脉注射来施用。在另一优选的 实施方式中，抗体通过肌肉内注射或皮下注射来施用。
[0296] 本发明的抗体和抗体片段可以掺入到适合于非口服施用的药品组合物中。在使用 单一种类的抗体或抗体部分的情况下，优选制备成含有〇. 1~250mg/mL的抗体的可注射的 制剂。另一方面，在混合使用多个种类的抗体的情况下，优选制备成含有〇. 001~lOOmg/mL 的抗体的可注射的制剂。需要说明的是，该多个种类的抗体的混合比例可以适当设定。
[0297] 可注射的制剂可以通过将有效成分溶解于液体而成的制剂或者将有效成分冷冻 干燥而成的制剂装入透明玻璃瓶、棕色玻璃瓶、安瓿瓶或预充式注射器而构成。缓冲剂可以 使用pH5. 0~7. 0 (最佳的情况下为pH6. 0)的L-组氨酸（1~50mM)、最佳的情况下为5~ IOmM的L-组氨酸。其他适当的缓冲剂包括琥珀酸钠、柠檬酸钠、磷酸钠或磷酸钾，但不限于 这些。为了改变浓度为0~300mM的溶液（就液体剂型而言，最佳的情况下为150mM)的渗 透压，可以使用氯化钠。冷冻干燥的剂型中可以含有冷冻保护物质，主要为0~10% (最 佳的情况下为0.5~5.0%)的蔗糖。其他适当的冷冻保护物质包括甘露醇、海藻糖和乳 糖。冷冻干燥的剂型中可以含有增量剂，主要为1~10%的甘露醇（最佳的情况下为2~ 4% )。液体和冷冻干燥的剂型这两者中可以使用稳定剂，主要为1~50mM(最佳的情况下 为5~IOmM)的L-蛋氨酸。其他适当的稳定剂包括甘氨酸、精氨酸和聚山梨醇酯80等，在 聚山梨醇酯80的情况下，可以含有0~0.05% (最佳的情况下为0.005~0.01%)。其他 表面活性剂包括聚山梨醇酯20和BRIJ表面活性剂，但不限于这些。
[0298] 本药物组合物通常在制造和储存的条件下必须无菌或稳定。该组合物可以配制成 溶液、微乳液、分散液、脂质体或适合于高药物浓度的其他有序结构。无菌的可注射的溶液 可以通过将所需量的活性化合物（即，抗体或抗体部分）根据需要与上述成分中的1种或 组合一同混合到适当的溶剂中、然后进行过滤灭菌来制备。通常，将活性化合物混合到含有 基本的分散介质和选自上述列举的成分中的必要的其他成分的无菌载体（vehicle)中，由 此制备分散液。在用于制备无菌的可注射的溶液的无菌粉末制剂的情况下，优选的制备方 法为如前所述的该灭菌过滤溶液的冷冻真空干燥和喷雾干燥，由此，得到除了活性成分的 粉末以外还含有任意的其他期望成分的组合物。溶液的适当的流动性例如可以通过如下方 法来维持：使用卵磷脂等的包衣；另外，在分散液的情况下，维持所需的粒度；另外，使用表 面活性剂。可注射的组合物的长时间的吸收可以通过在该组合物中含有延缓吸收的药剂例 如单硬脂酸盐、明胶来进行。
[0299] 6.获得本发明的抗hMPV抗体及其抗原结合性片段的步骤
[0300] 接下来，对得到本发明的抗hMPV单克隆抗体及其抗原结合性片段的步骤进行说 明，但得到本发明的抗体等的方法不受这些记载的任何限定，如上所述，当然可以进行该技 术领域中的常规变更。
[0301] 本发明的抗hMPV抗体及其抗原结合性片段可以通过如下方法得到：从人的血液 中经过各种步骤分离产生该抗体的细胞克隆，对从抗体产生细胞克隆的培养上清中得到的 抗体进行亲和纯化。
[0302] 1)抗hMPV的F蛋白质的完全人抗体产生细胞克隆的分离
[0303] 从人的血液中分离B淋巴细胞，诱导该B淋巴细胞的增殖。增殖诱导的方法 本身是公知的，例如可以通过使用成为癌症的诱发因子的"爱泼斯坦-巴尔病毒（EB病 毒）"（Epstein-Barr virus)(以下称为EBV)的转化法（D. Kozbor等）来进行。
[0304] 即，使上述B淋巴细胞感染EBV来进行增殖诱导，将增殖后的细胞制成抗体产生细 胞文库。
[0305] 2)从抗体产生细胞文库中回收单克隆抗体
[0306] 从增殖诱导的细胞中回收单克隆抗体的方法可以通过单克隆抗体的制作中常用 的公知的方法来进行。
[0307] 从上述抗体产生细胞文库中选出产生与hMPV的F蛋白质结合的抗体的淋巴细胞 克隆，从其培养上清中提取抗体。即，通过有限稀释法从上述抗体产生细胞文库中筛选产生 与hMPV的F蛋白质结合的抗体的细胞群体（克隆）。
[0308] 与hMPV的F蛋白质结合的克隆的检测可以采用以该F蛋白质作为抗原的ELISA 和使用标记小鼠抗人IgG抗体的ELISA来进行。或者，也可以使用如下方法（细胞荧光免 疫染色筛选法）：将F蛋白质表达载体导入细胞中，使用固定有表达该F蛋白质的细胞的筛 选板，对hMPV抗体进行检测。
[0309] 对选出的抗体阳性细胞群体进行培养并反复筛选，由此能够得到仅产生目标抗体 的细胞群体（克隆）。将表示直至以上的抗体产生细胞克隆的分离为止的步骤的流程图示 于图1。
[0310] 3)使用蛋白质A或G的亲和纯化
[0311] 为了纯化抗hMPV抗体，可以使挑选出的细胞在培养皿、转瓶、2升的旋转烧瓶或其 他培养体系中增殖。
[0312] 将所得到的培养上清过滤、浓缩后，供于利用蛋白A或蛋白G-琼脂糖（GE Healthcare公司）等的亲和层析，能够对该蛋白质进行纯化。将缓冲液更换为PBS，通过 0D280或优选通过浊度仪分析，能够判定浓度。同种型可以通过对同种型抗原具有特异性的 方法来考察。这样得到的抗hMPV抗体是由在人体内致敏的B淋巴细胞制作的完全人抗体， 因此针对抗体的免疫反应的可能性低。
[0313] 另外，关于抗体产生细胞克隆制作，利用具有感染B淋巴细胞而增殖诱导的活性 的EB病毒这一点也是特征性的。
[0314] EB病毒法的优点在于，能够制作在人体内制作的天然抗体以及能够得到亲和性高 的抗体。例如已经阐明了 ：抗某种病毒（例如，人CMV)的人抗体的亲和性比对小鼠进行人 工免疫而制作的抗体的亲和性高约10倍~约100倍。因 EB病毒感染而增殖的B淋巴细胞 群体成为抗体产生细胞的文库。从该文库中分离特定的抗体产生细胞克隆，从而能够得到 人抗体。
[0315] 7.评价在体外的活性的步骤
[0316] 抗体或抗体组合物的生物学特性可以通过试验该抗体在体外抑制hMPV的F蛋白 质的生物活性的能力来评价。抗体的体外评价法包括ELISA等结合分析法和中和分析法 等。
[0317] 1)结合活性
[0318] 在此，"特异性结合"或"特异性的结合"是指识别预定的抗原并与其结合。测定抗 体与hMPV的F蛋白质的结合亲和性可以使用公知的方法。例如，可以使用固定化于芯片上 的F蛋白质，通过Biacore T200(注册商标）这样的蛋白质相互作用分析装置来测定。结合 亲和性（Kd值）用该测定法中得到的Kd(解离常数）与Ka(结合常数）之比（K d= Kd/Ka) 来表示。本发明的人抗hMPV抗体或其抗原结合性片段优选对JPS02-76(hMPV_Bl型）的F 蛋白质的结合亲和性（KD值）为IXKT8M以下，优选为IXKT9M以下，更优选为SXKT kiM 以下。
[0319] 2)体外中和活性
[0320] 本说明书中使用的"中和"、"抑制效果"、"抑制"、"阻抑"、"能够抑制"等术语是指， 使由抗原（hMPV)引起的生物活性降低约5~100%，优选降低10~100%，更优选降低 20~100%，更优选降低30~100%，更优选降低40~100%，更优选降低50~100%，更 优选降低60~100%，更优选降低70~100%，进一步优选降低80~100%。
[0321] 关于抗hMPV抗体的体外中和能力评价，可以使用hMPV的4个亚组（Al、A2、Bl和 B2型）的代表性细胞株来实施（J. Vorol. 2008p8942-8946)。例如，作为使用的hMPV株，使 用作为Al型的JPS03-180株、作为A2型的JPS03-178株、作为Bl型的JPS02-76株和作为 B2型的JPS05-21株，在抗hMPV抗体存在下考察对LLC-MK2细胞的感染能力，由此能够评价 该抗体的中和能力。
[0322] 作为参考，使用虽为小鼠抗体但在迄今报道的抗hMPV抗体中据报道对hMPV的A1、 A2、Bl、B2中的任一类型的细胞株均具有高中和活性的抗体mAb338 (W02006/110214)、以及 作为人抗体的对RSV和hMPV均显示出高中和活性的HMB3210 (W02013/140247)共同作为阳 性对照。
[0323] 本发明的抗hMPV抗体或其抗原结合性片段在使用LLC-MK2细胞的hMPV感染能力 的评价系统中对 JPS03-180 (Al 型）、JPS03-178 (A2 型）、JPS02-76 (BI 型）和 JPS05-21 (B2 型）中的任意一株在优选约2. 3 μ g/mL(约15nM)以下、更优选约1 μ g/mL(约6· 7nM)以下、 进一步更优选约〇. 6yg/mL(约4nM)以下、最优选约0. 3yg/mL(约2nM)以下具有50%的感 染抑制活性（IC50)。或者，对 JPS03-180 (Al 型）、JPS03-178 (A2 型）、JPS02-76 (BI 型）和 JPS05-21 (B2型）中的任意一株在优选约3. 5 μ g/mL(约23nM)以下、更优选约2 μ g/mL(约 13. 3nM)以下、进一步更优选约1 μ g/mL(约6· 7nM)以下、最优选约0· 7 μ g/mL(约4· 7nM) 以下具有90%的感染抑制活性（IC90)。
[0324] 或者，在使用开303-178仏2型）的评价系统中，在约2 48/1^(约13.31^)以下、优 选约1 μ g/mL (约6. 7nM)以下、更优选约0. 5 μ g/mL (约3. 3nM)以下、进一步优选约0. 2 μ g/ mL(约I. 33nM)以下、进一步更优选约0· 1 μ g/mL(约0· 67nM)以下、最优选约0· 03