Bpifb4蛋白的变体的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及BPIFB4蛋白（杀菌/渗透性增加蛋白家族B，成员4)的变体及其用于 治疗与受损的eNOS和NO介导的血管扩张所引起的内皮功能紊乱相关的病状（pathology) 的用途。
【背景技术】
[0002] 人 BPIFB4 (也称为 C20orf 186 ;RY2G5 ;LPLUNC4)是 BPI/LBP/PLUNC 样家族的分泌 蛋白成员，其已经涉及对抗细菌的宿主防御过程。这种蛋白质存在氨基酸序列为575(Acc. P-59827-2)和613 (Acc.EAW76337.1)个氨基酸的不同长度的两种不同同种型（Bingle CD 等，Biochem Soc Trans. (2011)39(4) :977-83 ;AndraultJ.-B 等，Genomics(2003)82 : 172-184 ;Bingle C. D 等，Hum. Mol. Genet. (2002) 11 :937-943 ;Bingle C. D 等，Protein Sci. (2004) 13 :422-430)〇
[0003] 对于这种蛋白质，已经在参考575氨基酸序列指出的以下位点描述了若干单 核苷酸多态性：rs2070325-Ile229Val、rs 571391-Asn281Thr、rs7583529Phe488Leu 和 rs285097-Thr494Ile，其可导致产生若干不同的蛋白质变体。本发明人已经鉴定和表征 了 BPIFB4的若干变体。在仔细分析了上述4种多态性的单元型（haplotype)阶段（即， 等位基因的组合）后，本发明人发现，最常见的单元型（65%分析的染色体）是编码氨基 酸Ile229/Asn281/Leu488/Ile494 (INLI)的组合AACT ;第二最频繁单元型是编码氨基酸 ￥&1229/11^281/?1^488/11^494(￥了?1')的组合6(：1'(：(30%染色体包含这种单倍型），最后仅 在2%人白种人染色体中存在编码Ile229/Asn281/Phe488/Thr494(INFT)的AATC组合。
[0004] 血管内皮由位于血管内腔和血管平滑肌细胞之间的细胞层形成。这些细胞持续产 生一氧化氮（NO)，一种由酶内皮一氧化氮合酶（eNOS)合成的可溶性气体。该物质在调节血 管稳态和内皮功能（包括调节血管紧张度、调节局部细胞生长和保护血管免受血液中循环 的血小板和细胞的有害结果）中具有重要作用。
[0005] 越来越多的病症列表已经与由eNOS合成受损或过量氧化降解造成的动脉壁 的一氧化氮释放降低相关联（American Journal of Physiology，Endocrinology and metabolism 2012Mar I ;302(5)和 Current Vascular Pharmacology 2012Jan;10(l): 第4-18页）。这些病理学状况大部分与衰老相关。例如，已经在以下疾病中报道了一氧 化氮信号传导受损：冠状痉挛性心绞痛（coronary spastic angina) (Miyamoto Y等.Hum Mol Genet. 2000Nov I ;9 (18):第 2629-37 页）、血检形成（Loscalzo J，Circulation Research. 2001 ;88,第 756-762 页）、肺动脉高压（D' Uscio LD.，Cardiovasc Res 2011， 92 (3)，第 359-360 页）、先兆子痫（The Lancet，第 361 卷，9368,第 1511-1517 页）、血管 炎（vasculites) (Kanwar JR 等，Curr Med Chem. 2009 ;16(19) :2373-2394)、癌症（Kanwar JR 等.Curr Med Chem. 2009 ; 16 (19):第 2373-2394 页）、炎性疾病（Kanwar JR 等·， Curr Med Chem. 2009 ; 16 (19):第 2373-2394 页）、静脉功能不全（Fiirstermann U 等.Circulation. 2006 ;113 :第1708-1714页），具有降低的eNOS活性和NO产生的遗传 疾病，例如 MTHFR 基因变异（Lemarie CA 等·，Am J Physiol Heart Circ Physiol 2011， 第 300 卷：H745-53)、动脉高血压（Sparacino-Watkins CE 等，Circulation.，2012 ;第 125 卷（23)，第 2824-6 页；BSger RH 等，Circulation. 2009,第 119 卷（12)，第 1592-600 页）、动脉粥样硬化、糖尿病、血脂异常、肾衰竭（Jiang B等，Hum Gene Ther. 2012; 23(11)，第 1166-75 页；Ponnuswamy Pet 等.PLoS One. 2012 ;7(1) :e30193;Vita JA.等， Circulation. 2011，第 124 卷（25)，第 906-12 页；Li ZL 等·，PLoS One. 2012,第 7 卷（6): e38787)、代谢综合征（Quyyumi AA 等·，Circulation. 1995,第 92 卷：第 320-326 页）、卒中 〇\&1(1(1611从.，恥111'〇1(^7.2012年9月25日；79(135即？11) :558-62)、心肌梗死（恥1?^& S等，Circulation. 2008年4月29日；第117卷（17):第2211-23页）、勃起功能障碍 (Bianca Rd等，PLoS One. 2012,第7卷（2) :e31019)、神经变性疾病和多发性硬化（Faraci FM. ,Circulation Research. 2006,第 99 卷，第 1029-1030 页；Wu M，等，Glia. 2009,第 57 卷 (11) ，第 1204-15 页）、认知障碍（Rayatnia 等，Eur J Pharmacol. 2011，第 666 卷（1-3)， 第122-30页；Paydar等，Brain Res. 2011 ;第1386卷，第89-99页）、视网膜变性、葡萄膜 视网膜炎（uveoretinitis)、血管性视网膜病（vascular retinopathy)、白内障和青光眼 (Chiou g 等· Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics. 2001 年 4 月，17 (2)： 第 189-198 页；Li Q 等，Invest Ophthalmol Vis Sci. 2010 年 10 月，51(10):第 5240-6 页； Kwak HJ 等，Mol Cells. 2001 年 10 月 31 日；12(2):第 178-84 页）。
[0006] NO产生的降低和随之内皮功能的失调已经被认定是导致上述病理状态的关键因 素之一。因此，本领域中已经努力鉴定通过增强内皮的一氧化氮释放来逆转内皮功能障碍 的潜在候选治疗。
[0007] 此外，已经证明eNOS活性/NO产生的提高对于肌营养不良患者中的运动后疲劳 (Nature. 2008第27卷；456,第511-515页）和用于血管阻塞的支架植入（SharifF，等.Mol Ther. 2008 年 10 月；16(10):第 1674-80 页）有益。
[0008] 现在，本发明人惊奇地发现BPFIB4蛋白的特定变体与异常长寿相关。本发明人进 一步发现，鉴定的变体出人意料地能够提高内皮细胞中eNOS的活化和NO的产生。这些生 物学特性依赖于蛋白质中229位、281位、488位、494位的四个特定氨基酸的存在，因为用不 同氨基酸在任意这些位置进行替换都导致蛋白质活性的丧失。
【发明内容】
[0009] 因此，本发明提供了一种BPIFB4蛋白的变体蛋白，其具有与SEQ ID NO :1的氨基 酸序列有至少85%同源性的氨基酸序列，其中所述序列包含在对应于SEQ ID NO :1的229 位的位置处的缬氨酸，在对应于SEQ ID NO :1的281位的位置处的苏氨酸，在对应于SEQ ID NO : 1的488位的位置处的苯丙氨酸，以及在对应于SEQ ID NO : 1的494位的位置处的苏氨 酸。
[0010] 氨基酸序列中的所述同源性优选是至少90%，更优选至少95%，甚至更优选至少 99%〇
[0011] 根据一个特别优选的实施方案，本发明的蛋白质具有SEQ ID NO :1的氨基酸序列。
[0012] 根据一个可替代的优选实施方案，本发明的蛋白质具有对应于SEQ ID NO 1之序 列的氨基酸序列，其中在不同于SEQ ID NO 1之229位、281位、488位和494位的位置处的 一个或更多个氨基酸被保守氨基酸替换。"保守氨基酸"意指其物理化学性质在功能上等同 于原始氨基酸的氨基酸。
[0013] 本发明还提供了具有编码上述蛋白质之核苷酸序列的多核苷酸，以及包含与表达 控制序列有效连接的所述多核苷酸的载体。根据一个优选实施方案，所述多核苷酸具有SEQ ID NO :2的序列。
[0014] 还提供了转染有上述载体并且能够表达本发明蛋白质的宿主细胞。
[0015] 本发明还提供了上述蛋白质、多核苷酸或载体用于治疗。
[0016] 特别地，本发明的目的是上述蛋白质、多核苷酸或载体用于预防、改善、治疗由 eNOS活性和/或NO产生的降低造成的内皮功能障碍或者受益于提高eNOS活性和/或NO 产生的病状或病症，和/或降低其风险。根据一个优选实施方案，上述蛋白质、多核苷酸或 载体用于预防、改善或治疗选自以下的病状或病症或降低其风险：动脉高血压、动脉粥样硬 化、糖尿病、血脂异常、肾衰竭、代谢综合征、卒中、心肌梗死、勃起功能障碍、神经变性疾病、 多发性硬化和认知障碍、视网膜变性、葡萄膜视网膜炎、血管性视网膜病、白内障和青光眼、 冠状痉挛性心绞痛、血栓形成、肺动脉高压、