肾上腺 素-诱导的血管收缩（图5a)。显著血管收缩的缺乏阻碍对血管舒张进行后续评价。相比之 下，VTFT hBPIFB4的表达部分补救了由INFT hBPIFB4施加的对KCl-和去氧肾上腺素-诱导 之血管收缩的抑制作用：事实上，当与在灌注之前所观察的那些相比时，由激动剂引起的血 管响应有所下降，但并未消除（图6a至6b)。另外，当VTFT hBPIFB4表达时，与在转染之前 所观察到的相比，乙酰胆碱诱导的血管扩张显著增强（图6c)，但硝酸甘油引起的平滑肌舒 张却未变化（数据未示出），这表明这种作用是由内皮功能增强引起的。用VNFT hBPIFB4、 ITFT hBPIFB4、VTLI hBPIFB4和INLI hBPIFB4没有观察到对血管功能的影响。
[0085] 我们检测了 eNOS抑制剂L-NAME对经空载体（图7,图a，EV)或VTFT hBPIFB4编码 质粒（图8,图a，VTFT)转染之血管的影响。如所预期的，在经空质粒灌注的血管中，L-NAME 钝化乙酰胆碱的血管扩张作用，并且这种作用在表达VTFT hBPIFB4的血管中更明显，这表 明在后一种情况下存在更多的N0。
[0086] 实施例4 :VTFT hBPIFB4对血管疾病之体内樽塑的影晌归闵于NO释放#损
[0087] 还在来自杂合mthfr小鼠的肠系膜血管及其对照上进行上述实验，如Lemarie CA 等，Am J Physiol Heart Circ Physiol 2011;第 300 卷：H745-53 中所述。Mthfr+/-小 鼠表现出eNOS的功能障碍，其与长寿因子surtuin 1的下调有关。因此，我们探索了 VTFT hBPIFB4对这些小鼠的肠系膜血管的影响。如所预期的，在暴露于EV之后，与Mthfr+/+同窝 出生小鼠相比，在Mthfr+小鼠中乙酰胆碱诱导的血管舒张显著降低（图7,图b)，但在硝 酸甘油引起的血管响应中未观察到变化（数据未示出）。在暴露于编码的VTFT hBPIFB4质 粒Mthfr+/--VTFT之后，Mthfr+血管的内皮舒张得到显著改善，变得与在Mthfr +/+血管中所 观察到的相当（图8b)。这表明VTFT hBPIFB4在抵抗血管功能障碍方面具有强治疗作用 (图8,图b)。
[0088] 实施例5 :评价Hek293T细朐中通讨BPIFB4的eNOS调节
[0089] 将人胚肾细胞（HEK293T)在37°C下在5% C02气氛中维持在补充有10% (v/v) 胎牛血清和1 %非必需氨基酸的Dulbecco改良的Eagle培养基（Dulbecco' s modified Eagle's medium，DMEM)中。将细胞以0· 25X 1〇7孔接种到6孔板中，并在接种后24小时 用 10μ1 Lipofectamine2000(LifeTechnologie)和 4yg质粒转染。24 小时后，将细胞血 清饥饿24小时。在血清饥饿期间，将经转染的细胞用400 yM H2O2处理24小时。通过用 TRIzol (Ambion)从细胞中提取总RNA来检测BPIFB4的转录、逆转录（iScript BioRad)。用 针对 BPIFB4(正向：CTCTCCCCAAAATCCTCAACA，反向：AGCCTCTCTGGGACTGGTTC)和 GAPDH(正 向：GTGAAGGTCGGAGTCAACG，反向：GGTGGAATCATATTGGAACATG)的特异性引物来扩增 cDNA。
[0090] 当暴露于H2O2时，HEK293T细胞中可诱导BPIFB4转录：这证明BPIFB4在胁迫响应 中的作用（图9,图a)。因此，我们探索了 BPIFB4如何影响eNOS之1177位丝氨酸上的胁 迫介导的磷酸化。
[0091] 将人胚肾细胞（HEK293T)在37°C下在5% C02气氛中维持在补充有10% (v/ v)胎牛血清和1 %非必需氨基酸的Dulbecco改良的Eagle培养基（DMEM)中。将 细胞以〇· 25xl06/孔接种到6孔板中，并在接种后24小时用10 μ I Lipofectamine 2000 (LifeTechnologie)和4 μ g质粒转染。24小时后，将细胞血清饥饿24小时。在血清饥 饿期间，将经转染的细胞用400 μ M H2O2处理24小时。将蛋白质提取物在10% SDS-PAGE上 在IOOV下分离1小时或者在4%至12% SDS-PAGE上在IOOV下分离2小时，并随后转移至 硝化纤维膜或PVDF膜。将所述膜与以下一抗一起孵育过夜：抗-磷酸化-eNOS Serl 177 (细 胞信号传导，兔mAb，l : 1000)和抗-β-肌动蛋白（Cell Signaling，小鼠 mAb，l : 3000)。 将所述膜洗绦三次，并随后与二抗（Amersham Life Science辣根过氧化物酶连接的抗-兔 IgG或抗-小鼠 IgG，1 : 3000) -起孵育1小时或2小时。然后，将所述膜洗涤4次并用 ECL Prime化学发光剂（Amersham Life Science)检测特定的蛋白质条带。将Western印 迹数据用 ImageJ 软件（由 Wayne Rasband，National Institutes of Health，USA 开发） 进行分析以确定这些条带的光密度（〇D)。考虑到上样中的变化，将OD读数相对于β-肌动 蛋白进行归一化。
[0092] 如图9的图b和c中所示，当暴露于H2O2时，与过量表达INFT hBPIFB4的细胞相 比，在表达VTFT hBPIFB4的HEK293T细胞中eNOS变得更加活化。该结果证实离体灌注血 管所得到eNOS活化。
【主权项】
1. BPIFB4蛋白变体，其具有与SEQ ID NO :1的氨基酸序列有至少85%同源性的氨基酸 序列并且特征在于，所述序列包含在对应于SEQ ID NO :1的229位的位置处的缬氨酸、在对 应于SEQ ID NO :1的281位的位置处的苏氨酸、在对应于SEQ ID NO :1的488位的位置处 的苯丙氨酸以及在对应于SEQ ID NO :1的494位的位置处的苏氨酸。2. 根据权利要求1所述的BPIFB4蛋白变体，其具有SEQ ID NO :1的氨基酸序列。3. 蛋白质，其具有由与可用于识别本发明BPIFB4蛋白变体或使本发明BPIFB4蛋白变 体靶向至特定器官或组织的序列连接的权利要求1或2所述BPIFB4蛋白变体的氨基酸序 列组成的序列。4. 根据权利要求3所述的蛋白质，其为嵌合蛋白。5. 根据权利要求1或2所述的BPIFB4蛋白变体的片段，其具有包含以下氨基酸的序 列：在对应于SEQ ID NO :1的229位的位置处的所述缬氨酸、在对应于SEQ ID NO :1的281 位的位置处的所述苏氨酸、在对应于SEQ ID NO :1的488位的位置处的所述苯丙氨酸以及 在对应于SEQ ID NO :1的494位的位置处的所述苏氨酸。6. 多核苷酸，其编码根据权利要求1或2所述的BPIFB4蛋白变体、根据权利要求3或 4所述的蛋白质或者根据权利要求5所述的片段的氨基酸序列。7. 根据权利要求6所述的多核苷酸，其包含SEQ ID NO :2的核苷酸序列或其片段，所 述核苷酸序列或其片段包含编码SEQ ID NO :1之缬氨酸229、苏氨酸281、苯丙氨酸488和 苏氨酸494的核苷酸。8. 多核苷酸，其具有SEQ ID NO :2的核苷酸序列。9. 载体，其包含与表达控制序列有效连接的根据权利要求6至8所述的多核苷酸。10. 根据权利要求9所述的载体，其为病毒载体。11. 根据权利要求1或2所述的BPIFB4蛋白变体、根据权利要求3或4所述的蛋白质、 根据权利要求5所述的片段、根据权利要求6至8所述的多核苷酸或者根据权利要求9或 10所述的载体，其用于治疗。12. 根据权利要求11所述的BPIFB4蛋白变体、蛋白质、片段、多核苷酸或载体，其用于 治疗由内皮细胞释放的NO低于生理水平或由eNOS活性降低导致的内皮功能障碍，或者用 于受益于获得eNOS活化提高的临床情况。13. 根据权利要求11或12所述的BPIFB4蛋白变体、蛋白质、片段、多核苷酸或载体，其 用于预防、改善、治疗选自以下的病状或降低其风险：动脉高血压、动脉粥样硬化、糖尿病、 血脂异常、肾衰竭、代谢综合征、卒中、心肌梗死、勃起功能障碍、神经变性疾病、多发性硬 化、认知障碍、视网膜变性、葡萄膜视网膜炎、血管性视网膜病、白内障、青光眼、冠状痉挛性 心绞痛、血栓形成、肺动脉高压、先兆子痫、血管炎、癌症、炎性疾病、静脉功能不全、eNOS活 性和NO产生降低的遗传疾病、MTHFR基因变异。14. 根据权利要求11或12所述的BPIFB4蛋白变体、蛋白质、片段、多核苷酸或载体，其 用于改善肌营养不良的运动后疲劳或用作用于血管阻塞的一种或更多种支架的植入中的 共辅助剂。15. 宿主细胞，其转染有根据权利要求9或10所述的载体。16. 重组产生根据权利要求1或2所述的BPIFB4蛋白变体、根据权利要求3或4所述 的蛋白质或者根据权利要求5所述的片段的方法，其包括在允许表达突变BPIFB4蛋白、蛋 白质或片段的条件下培养权利要求15所述的宿主细胞，以及回收所述BPIFB4蛋白变体、蛋 白质或片段。17.药物组合物，其包含与可药用载剂和/或赋形剂混合的根据权利要求1或2所述 BPIFB4蛋白变体、根据权利要求3或4所述蛋白质、根据权利要求5所述片段或者根据权利 要求9或10所述载体。
【专利摘要】本发明涉及BPIFB4(杀菌/渗透性增加蛋白家族B，成员4)蛋白的变体及其用于治疗涉及一氧化氮信号传导受损的病状的用途。
【IPC分类】C07K14/47
【公开号】CN104955836
【申请号】CN201380068475
【发明人】安尼巴莱·亚历山德罗·普卡, 察尔米内·韦基奥内
【申请人】安尼巴莱·亚历山德罗·普卡, 察尔米内·韦基奥内
【公开日】2015年9月30日
【申请日】2013年12月27日
【公告号】CA2896166A1, EP2749569A1, EP2938629A1, US20150344536, WO2014102343A1