μ g/ mL(约0. 2nM)以下具有50%的感染抑制活性（IC50)的人抗体或其抗原结合性片段包含在 本发明中。
[0325] 或者，在使用开303-178仏2型）的评价系统中，在约6以8/1^(约4〇1^)以下、优选 约1 μ g/mL(约6· 7nM)以下、更优选约0· 2 μ g/mL(约I. 33nM)以下、进一步优选约0· 1 μ g/ mL(约0.67nM)以下具有90%的感染抑制活性（IC90)的人抗体或其抗原结合性片段包含 在本发明中。
[0326] 3)细胞间感染阻止活性
[0327] hMPV为了从细胞感染至细胞而需要使FP开裂，但作为体外的hMPV感染的宿主细 胞的LLC-MK2细胞、VERO细胞不具有使FP开裂的活性。因此，将具有FP的开裂活性的膜 型丝氨酸蛋白酶（TMPRSS2)导入到LLC-MK2细胞中，制作稳定表达TMPRSS2的宿主细胞，使 hMPV感染所得到的TMPRSS2稳定表达细胞，利用该系统能够评价抗hMPV抗体的细胞间感 染阻止活性。在利用使作为hMPV的Bl型的JPS02-76株感染上述宿主细胞的系统来评价 抗hMPV抗体的细胞间感染阻止活性时，在约0. 2 μ g/mL(约I. 33nM)以下、优选约0. 1 μ g/ mL(约0. 67nM)以下、更优选约0. 05 μ g/mL(约0. 33nM)以下、进一步更优选约0.02 μ g/ mL(约0. 133nM)以下具有50%的细胞间感染抑制活性（IC50)的人抗体或其抗原结合性片 段包含在本发明中。
[0328] 8.表位组的分类
[0329] 抗hMPV抗体的表位的差异可以通过分别考察抗体间的竞争分析和对表达F蛋白 质的部分缺失肽的细胞的结合活性来进行评价（参考实施例的"12.表位作图"以及图3 和图4)。结果，本发明的抗hMPV抗体可以分类为5个表位组（Groupl、Group2、Group3、 Group4 和 Group5)。即，Groupl (与 FP 和 HRl 缺失突变体结合而不与 F2、F1-1、F1-2、F1_3、 Fl-4、Fl-5和F1-6缺失突变体结合的抗体的组）包括EV046115b、EV046130和EV046147。 Group2(与 FP、HR1、Fl-4、F1-5 和 F1-6 缺失突变体结合而不与 F2、Fl-1、F1-2 和 F1-3 缺 失突变体结合的抗体的组）包括 mAb338、EV046113、EV046116、EV046141 和 EV046142。 Group3(与 FP、Fl-4、F1-5 和 F1-6 缺失突变体结合而不与 F2、HR1、Fl-1、F1-2 和 F1-3 缺 失突变体结合的抗体的组）包括EV046124、EV046143和EV046150。Group4(与FP、HR1和 F1-6缺失突变体结合而不与F2、Fl-1、Fl-2、Fl-3、F1-4和F1-5缺失突变体结合的抗体的 组）包括 EV046120 和 EV046135。并且，Group5 (与 FP、HR1、F1-1、F1-3、F1-4、F1_5 和 F1-6 缺失突变体结合而不与F2和F1-2缺失突变体结合的抗体的组）包括EV046136。因此，本 发明的抗hMPV抗体为与hMPV的F蛋白质结合的抗体或其抗原结合性片段，但优选为属于 由上述Groupl、Group2、Group3、Group4或Group5定义的任意一个表位组的抗体或其抗原 结合性片段，更优选为属于由Group2、Group3、Group4或Group5定义的任意一个表位组的 抗体或其抗原结合性片段，进一步更优选为属于由Group3、Group4或Group5定义的任意一 个表位组的抗体或其抗原结合性片段，进一步最优选为属于由Group3定义的表位组的抗 体或其抗原结合性片段。
[0330] 在表位组的分类中，将在迄今报道的抗hMPV抗体中对hMPV的Al、A2、BI、B2中的 任一类型的细胞株均具有高中和活性且有表位分析报道（F蛋白质的氨基酸238-245)的小 鼠抗体mAb338 (W02006/110214)、以及作为人抗体的与hMPV和RSV这两者的F蛋白质结合 的HMB3210(W02013/140247)共同作为对照进行了测定。
[0331] 以下，通过实施例更具体地对本发明进行说明，但本发明不受这些实施例的 任何限制。本实施例中使用的程序若非特别提及，则可以参考Molecular Cloning:A Laboratory Manual (第3版）（Sambrook等，冷泉港实验室出版社，2001)。
[0332] 实施例
[0333] 1.抗hMPV的完全人抗体产生细胞克隆的分离
[0334] 将直至抗体产生细胞克隆分离为止的流程图示于图1。
[0335] 从人外周血中分离B淋巴细胞，使其感染EBV。将感染细胞接种到96孔板中，培 养3~4周后，进行培养上清中的抗hMPV抗体的一次筛选。将确认到抗hMPV抗体产生的 各孔的细胞接种到新的96孔板中。培养3~4周后，进行抗hMPV抗体的二次筛选。将所 得到的抗体阳性孔的细胞以每孔1~30个接种到新的96孔板中。培养3~5周后，进行 抗hMPV抗体的三次筛选。通过该有限稀释培养等进行克隆操作的结果，得到了产生目标抗 体的细胞克隆。
[0336] 2.抗hMPV抗体的细胞荧光免疫染色筛选
[0337] 筛选以抗融合蛋白（FP)的抗体作为对象，该融合蛋白为hMPV的主要中和靶标。 从hMPV(JPS02-76)中提取RNA，利用十喊基随机引物（Random Decamers)合成cDNA。通过 PCR扩增FP基因的全长，将其克隆到表达载体中。将克隆的FP基因的碱基序列和氨基酸序 列分别示于序列号131和132。克隆的FP基因与gene bank中登记的原始序列（GenBank 登记号AY530089)相差2个碱基，1个部位的氨基酸存在取代。
[0338] 将FP表达载体导入CHO-Kl细胞中，16小时后重新接种到96孔板或384孔板 中。基因导入使用lipofection LTX(Invitorgen)和plus试剂（Invitorgen)在制造商的 推荐条件下进行。然后，将培养24小时后的CH0-K1细胞用4%多聚甲醛、0.1 M磷酸盐缓 冲液（PH7.4)固定。接着，用 PBS-0099PBS(-)、0. 1% Tween20 清洗，用 1XPBS(_)、0.2% TritonX-IOO进行透过处理。将所制作的板作为抗hMPV抗体筛选板使用。
[0339] 将EBV感染细胞的培养上清添加到抗hMPV抗体筛选板中，在室温下反应1小时 后，用PBS-T清洗3次。接着，将作为二次抗体的抗人IgG-Alexa488 (Invitorgen)用PBS-T、 0. 1% FCS稀释1000倍后添加，在室温下反应1小时后，用PBS-T清洗1次。接着，添加 0.8 μ g/ml DAPI、PBS-T，在室温下反应10分钟后，用PBS-T清洗2次，添加 IXPBS (_)。
[0340] 利用In Cell Analyzer2000 (GE Healthcare)拍摄染色细胞，将检测到阳性细胞 的孔作为抗体阳性孔。
[0341] 3.抗体同种型和亚类的确认
[0342] 使用分离的抗体产生细胞克隆的培养上清，通过细胞荧光免疫染色法确认所产生 的抗体的同种型。即，使用抗hMPV抗体筛选板，作为二次抗体，使用对各同种型和亚类具有 特异性的抗体。将所得到的13种抗hMPV抗体的同种型和亚类示于后述的表2。
[0343] 4.编码抗hMPV抗体的DNA的克隆
[0344] 使用寡聚dT引物从抗体产生细胞的总RNA进行逆转录，以所得到的cDNA作为模 板，通过PCR法进行抗体基因的扩增。PCR中使用的引物基于编码人IgG抗体H链和L链的 cDNA的数据库来设计。为了扩增全长的H链cDNA和L链cDNA，5'末端侧引物具有翻译起 始点，3'末端侧引物具有翻译终止点。
[0345] 5.基于碱基序列的抗体的氨基酸序列的确定
[0346] 将通过PCR法扩增的各抗体的H链和L链的cDNA插入质粒载体中，利用ABI测 序仪确认各自的碱基序列。由所得到的碱基序列分别确定抗体的信号序列、H链和L链 的氨基酸序列、可变区的氨基酸序列和互补决定区（CDR)的氨基酸序列。CDR的分析使用 Kabat (www. bioinf. org. uk:Dr. Andrew C. R. MartiniS Group, Antibodies:General Information)。将所得到的抗体的H链和L链的氨基酸序列、可变区的氨基酸序列和互补 决定区（CDR)的氨基酸序列的序列号分别示于表1。
[0347] 6.确认所得到的抗体基因编码抗hMPV抗体
[0348] 将所得到的H链和L链的基因分别插入到表达载体中，并同时导入CHO-Kl细胞 中。基因导入使用lipofection LTX(Invitorgen)和plus试剂（Invitorgen)在制造商的 推荐条件下进行。2天后回收培养上清，通过使用包被有抗人IgG抗体的96孔板的ELISA 法确认培养上清中的抗体为人IgG，通过使用抗hMPV抗体筛选板的细胞荧光免疫染色法确 认该抗体与hMPV的FP结合。
[0349] 7.抗体蛋白质的产生
[0350] 将所得到的抗hMPV抗体表达载体导入CH0-K1细胞中，在选择标记物存在下进行 培养，由此得到恒定地产生抗体的CH0-K1细胞克隆。
[0351] 将该抗体稳定产生CH0-K1株在无血清培养基中培养，回收培养上清。将该培养 上清供于使用蛋白质A柱的亲和纯化，得到纯化抗体。柱使用HiTrap rProteinA FF(GE Healthcare)的预充柱，在制造商的推荐条件下进行纯化。纯化后，利用抗hMPV抗体筛选板 确认抗体对hMPV FP的结合性。另外，通过SDS-PAGE进行抗体H链（约50kDa)、抗体L链 (约25kDa)的确认。
[0352] 8.中和活性评价
[0353] 免疫染色法：
[0354] 作为抗hMPV抗体的有效性评价，对中和活性进行了确认。中和活性通过抗体对 LLC-MK2细胞的hMPV感染的阻止率来评价。hMPV的株使用作为Bl株的JPS02-76、作为B2 株的JPS05-21株、作为Al株的JPS03-180和作为A2株的JPS03-178。
[0355] 病毒通过以下的方法制备。
[0356] 在用I XPBS (_)清洗2次后的LLC-MK2细胞中添加病毒液，培养1小时后，添加作 为感染培养基的EMEM、5mM蔗糖、2mM L-谷氨酰胺、0. 5 μ g/ml胰蛋白酶，培养至出现CPE，然 后，将未感染的LLC-ML2细胞与感染细胞以1:9混合，在感染培养基中培养至出现CPE，制 备感染率100 %的种子感染细胞。作为病毒液，将未感染的LLC-MK2细胞与种子感染细胞 以1:9混合，在感染培养基中培养至出现CPE，回收培养上清。然后，根据需要通过离心分离 (20000g、4°C、2. 5小时）对病毒进行浓缩、分注，使用冷冻保存于-80°C的病毒。
[0357] 中和活性评价通过以下的方法进行。
[0358] 对于纯化抗hMPV抗体，从10 μ g/ml起准备6个梯度的4倍稀释系列。将 0. 8-1. 4X 104pfu/ml的病毒液与纯化抗体以1:1混合，在25°C下放置1小时。将LLC-MK2 细胞以100%铺满的方式在前一天接种到96孔板中，在病毒添加前用EMEM清洗2次。在 LLC-MK2中添加病毒液和纯化抗体的混合液，在CO2孵箱中培养1小时。然后，将细胞用EMEM 清洗3次，添加 EMEM、5mM蔗糖、2mM L-谷氨酰胺，在CO2孵箱中培养20小时。为了检测感 染细胞，将细胞用80%丙酮固定，添加 I % BSA、I XPBS (-)，在室温下封闭1小时。接着，将 小鼠抗hMPV抗体（HMPV123、AbD Serotec)以达到1 μ g/ml的方式用PBS-T、0. 1%山羊血 清稀释后添加，在室温下反应1小时。然后，用PBS-T清洗3次，将作为二次抗体的抗小鼠 IgG-Alexa488 (Invitorgen)稀释 3000 倍，将 DAPI 以达到 0· 4 μ g/ml 的方式用 PBS-T、0. 1 % 山羊血清稀释后添加，在室温下反应1小时。然后，用PBS-T清洗3次，添加 IX PBS (_)。使 用In Cell Analyzer2000拍摄染色细胞，计数阳性细胞。
[0359] 中和活性评价中的阴性对照使用对hMPV不具有特异性的人单克隆抗体（hlgG)。 将阴性对照的感染细胞数的平均值设为〇%感染阻止率，由各抗体的各浓度下的感染阻止 率算出IC50(由夹着抑制率50%的2个抗体浓度和抑制率算出）（表2)。
[0360] 关于作为人来源抗hMPV抗体的DS λ 7 (Fab)，已表明其对B2株和Al株的中和 活性（IC60)分别为>59 μ g/mL (1180nM)和9. 8 μ g/mL (196nM)，几乎观察不到中和活性 (W02008/043052和J. Virol.，2007 (vol. 81)p8315)。另外，关于同时报道的其他人抗体 (DS1、DS6、ACN044等（均为Fab))，在A2株以外的3种类型（A1、B1和B2型）中，完全 观察不到中和活性（IC60值：>8 μ g/mL(160nM))，考虑到上述报道，至少可以说对AU Bl 和B2型中的任意一种的IC50值为约1 μ g/mL (约6. 7nM)以下的本发明的抗体显著优于 W02008/043052中公开的人抗体。
[0361] [表 2]
[0362] 抗hMPV抗体的同种型和对各hMPV株的IC50
[0364] 此外，将使用表2所示的数据、使用数据分析软件GraphPad Prism6算出 的IC50、IC60和IC90分别示于表3、表4和表5。在这些表3、表4和表5中，追加 了对JPS03-178 (A2型）的中和活性，并且，作为中和活性的阳性对照，将日本专利 JP2008-538353(W02006/110214)记载的抗 hMPV 的小鼠抗体 mAb338 和 W02013/140247 记载 的人抗体HMB3210基于各专利中公开的信息进行制作来使用。
[0365] 在求得如上所述重新计算而得到的IC50值（参考表3)和IC60值（参考表4)的 情况下，本发明的任意一种抗体对AU Bl和B2型均显示出约I yg/mL以下（约6. 7nM以 下）的中和活性，可以说本发明的抗体均显著优于W02008/043052中公开的人抗体。另外， 包括A2型在内的IC60值整体为约1~3 μ g/mL以下。
[0366] 另外，根据表3的结果，本发明的任意一种抗体在约2. 3 μ g/mL(约15nM)以下对 hMPV的任一类型的细胞株均显示出50%抑制效果，可以说具有高中和活性。此外，根据表 3 的结果，EV046115b、EV046130、EV046147 和 EV046141 以外的抗 hMPV 抗体对 A1、A2、B1 和 B2中的任意一株在约1 μ g/mL(约6. 7nM)以下均显示出50%抑制效果（IC50)。此外，对 于 hMPV 的 A2 型，EV046120、EV046124、EV046135、EV046142、EV046143 和 EV046150 均在约 0.1μg/mL(约0.67nM)以下显示出50%抑制效果，特别是EV046135、EV046143和EV046150 在约0. 03 μ g/mL(约0. 2nM)以下显示出50%抑制效果，显著优于HMB3210 (139. 3ng/mL)。
[0367] 关于表5的IC90值，除EV046115b以外的所有抗体对A1、A2、B1和B2中的任一类 型均在约3.5μg/mL(约23nM)以下显示出90%抑制效果（IC90)。其中，特别是EV046124 和EV046150对A1、A2、B1和B2中的任一类型均在约lyg/mL(约6. 7nM)以下显示出90% 抑制效果（IC90)，可以说具有显著高于HMB3210(约3. 6 μ g/mL以下）的中和活性。此外， EV046124、EV046143 和 EV046150 对 hMPV 的 A2 型的 IC90 值分别为 188. lng/mL、96. 71ng/ 1^和101.11^/1^，均为约0.2以8/1^(约1.331^)以下，显示出非常高的中和活性。特别 是 EV046143 和 EV046150 的 IC90 值均为约 0. 1 μ g/mL (约 0. 67nM)，显著优于 HMB3210 (约 0. 58 μ g/mL)〇
[0368] [表 3]
[0369] 抗hMVP抗体对各种hMVP株的IC50
[0371] [表 4]
[0372] 抗hMVP抗体对各种hMVP株的IC60
[0374] [表 5]
[0375] 抗hMVP抗体对各种hMVP株的IC90
[0376]
[0377] 9.细胞间感染阻止活性的评价
[0378] 进而，作为抗hMPV抗体的有效性评价，对细胞间感染阻止活性进行评价。
[0379] hMPV为了感染而需要进行FP的开裂，但作为体外的hMPV感染的宿主细胞的 LLC-MK2细胞、VERO细胞不具有使FP开裂的活性，因此，通常在培养基中添加胰蛋白酶。但 是，在为了评价细胞间感染阻止活性而持续添加抗体的系统中，胰蛋白酶可能使抗体失活。 因此，将据报道具有FP的开裂活性的膜型丝氨酸蛋白酶（TMPRSS2)导入LLC-MK2细胞中， 制作稳定表达 TMPRSS2 的宿主细胞（Shirogane et al.2008J. Virol. 82:8942-8946) 〇
[0380] 使hMPV感染所得到的TMPRSS2稳定表达细胞，在不添加胰蛋白酶的条件下尝试 hMPV的感染扩大，结果，感染细胞数增加，可以确认到Foci。
[0381] 实际的细胞间感染阻止活性的评价如下进行。使hMPV感染TMPRSS2稳定表达细 胞，经过4小时后，以6个梯度添加从40 μ g/ml起的4倍稀释系列的抗体。在72小时后通 过与中和活性评价同样的方法将细胞固定，对感染细胞进行检测。
[0382] 细胞间感染阻止活性评价中的阴性对照使用对hMPV不具有特异性的人单克隆抗 体（hlgG)，阳性对照通过合成日本专利JP2008-538353记载的抗hMPV的抗体mAb338来使 用。将阴性对照在各浓度下的感染细胞数的平均值设为〇 %细胞间感染阻止率，将阳性对照 在40 μ g/ml下的感染细胞数设为100%细胞间感染阻止率，算出各抗体在各浓度下的感染 阻止率。将使用数据分析软件GraphPad Prism6对它们的IC50和IC90(ng/ml)进行计算 而得到的结果示于表6。
[0383] [表 6]
[0384] 抗hMPV抗体的细胞间感染阻止活性
[0385]
[0386] 10.亲和性分析
[0387] 作为抗hMPV抗体的结合活性评价，进行了亲和性分析。
[0388] 分析中使用的抗原如下制备。将从hMPV(JPS02-76)的FP基因中除去跨膜区（相 当于FP的491位至539位的氨基酸残基部分）并附加有His标签的序列（FP-TM(-)-His)克 隆到表达载体中。将FP-TM(-)-His表达载体导入CHO-Kl细胞中，在选择标记物存在下进行 培养，由此得到稳定表达FP-TM(-) -His的CHO-Kl细胞克隆。回收FP-TM(-) -His稳定表达 细胞的培养上清，使用Ni-Sepharose 6 Fast Flow载体（GE Healthcare)对FP_TM(-)-His 进行纯化。纯化后的FP-TM(-)-His通过凝胶过滤而除去咪唑，定量后用于亲和性分析。
[0389] 亲和性分析使用Biacore T-200进行。利用人IgG捕获试剂盒（GE Healthcare) 将抗人IgG固定化于传感芯片上，使其捕获抗hMPV抗体而作为配体。分析物使用上述的纯 化FP-TM(-)-His。将抗hMPV抗体对hMPV(JPS02-76)的FP的亲和性示于表4。任意一种 抗hMPV抗体对FP的K d值均为IOnM以下，显示出非常高的结合活性（表7)。需要说明的 是，EV046115b和EV046147在传感芯片上的凝集反应强，无法测定（ND)。
[0390] [表 7]
[0391] 抗hMPV抗体的亲和性分析结果
[0392]
[0393] (N. D.:由于传感芯片上的抗体的凝集反应而无法分析）
[0394] 11.竞争分析
[0395] 进行抗hMPV抗体的竞争分析。
[0396] 分析中使用的抗原使用上述亲和性分析中所示的FP-TM(-)_His稳定表达细胞 的培养上清。分析使用Biacore T-200进行。在传感芯片NTA(GE healthcare)上捕获 FP-TM (-) -His后，使作为样品1的抗hMPV抗体在传感芯片上结合至饱和水平，接着，使作为 样品2的另一抗hMPV抗体结合。通过样品2与抗hMPV抗体的结合是否被抑制来判定是否 发生竞争。将竞争分析的结果示