专利名称：组蛋白在早期诊断和/或预防性治疗病毒感染活细胞中的应用以及用于诊断的生物芯片的制作方法
各种不同的疾病大多数是由病毒引起的。人们能辨别的两类基本病毒是DNA和RNA病毒。例如，这组DNA病毒包括像爱泼斯坦-巴尔(Epstein-Barr)病毒(EBV)和小痘疱病毒(也称为天花病毒)那样的疱疹病毒科。这组RNA病毒包括人逆转录病毒HIV(人免疫缺陷病毒)或麻疹病毒和流感病毒这一家族。这两类病毒代表了人类主要的健康危害。与细菌感染不同的是，细菌感染可以容易地用抗生素治疗，而对于大多数病毒感染却没有特定的或成功的治疗方案。在大多数情况下，早期确诊病毒感染的存在是极其困难的而通常只能通过检测特异性抗病毒免疫反应来辨认。但后者大约要用一周时间才可测定。免疫系统大多数都是失去控制的，其原因是没有任何有效的可能治疗的方案存在，如所举的EBV这种病，它是一种会引起传染性单核细胞增多症(Pfeiffer腺热)的病毒感染。而且，免疫系统的功能必须以采用建立的药物治疗来维持。
本发明的目的是要提供生物活性试剂，它能在病毒感染的细胞中，在最初的感染发生后并在出现可识别的针对所述病毒的免疫反应和发生病毒复制循环之前，选择性地诊断病毒细胞以及立即尽早消除该病毒感染的细胞。治疗剂量在0.5至2μM(例如)时，该生物活性试剂对于生物机体及其免疫系统可在最大程度上没有不良副作用。也就是说，所述生物活性试剂应适用于早期诊断和/或预防性治疗活的、病毒感染细胞，特别是在哺乳动物和人中的活的、病毒感染细胞。
根据权利要求1的技术方案通过生物活性试剂能够实现上述目的，所述生物活性试剂包含至少一种组分，该组分选自组蛋白、共价修饰的组蛋白、组蛋白样的多肽以及组蛋白和组蛋白样的肽的生物活性氨基酸序列。根据本发明，所述生物活性试剂的优点是通过所述生物活性试剂的添加，在不丧失总体治疗活性的情况下能够降低生物制剂药物的剂量，从而辅助或增强已有抗病毒药物的治疗效果。
在人的卫生保健中用于诊断和治疗目的的本发明生物活性试剂优选含有重组的人组蛋白H1、或诸如H1.0，H1.1，H1.2，H1.3，H1.4，H1.5，H1.t，H1.x的至少一种组蛋白H1亚型或它们的生物活性部分。
而且，本发明的试剂还可包含选定数量的不同生物活性的组蛋白和/或它们的生物活性部分。
关于这种生物活性，具体地说是指所述试剂的氨基酸序列针对病毒感染细胞的细胞膜的强度。
从属权利要求的特征体现了本发明实施方案的优选变体。本发明还包括生物芯片，用于选择对于人生物体或哺乳动物中的病毒感染细胞具有最大生物活性的本发明生物试剂。所述的生物芯片包括病毒感染细胞的相关特性并因此而优化诊断和/或治疗。
在诊断病毒感染细胞用的本发明所述生物芯片中，将选定数量的每种都具有生物活性的不同的生物试剂配置在该生物芯片上，用于确定各种疾病性质的特征全貌，其中该生物活性试剂是选自由组蛋白、共价修饰的组蛋白、组蛋白样的多肽及组蛋白和组蛋白样的肽的生物活性氨基酸序列组成的化合物组。所选的生物活性试剂在所述生物芯片的基质上的固定是通过PEG序列、寡肽、具有N末端半胱氨酸的寡肽、金或抗体来完成的。
本发明是基于以下的观察结果病毒感染细胞的膜在感染发生后并且还在该细胞内病毒复制循环开始发生之前就立即以特征性的形式被修饰。所述细胞膜的所述病毒特异的、特征性的修饰是由本发明的生物活性试剂来识别的，特别是由组蛋白H1或其生物活性部分来识别的。这些结果与感染该细胞的病毒类型无关。
因此，根据本发明，在不能鉴定病症且免疫系统尚未出现可识别的抗该病毒的免疫反应的时间点，已经能够诊断和/或治疗生物体内病毒感染细胞。
本发明的生物活性试剂首次能够使潜在的病毒感染人群得到预防性的诊断。在诊断为阳性的情况下，在该疾病发作之前那些可能已感染了病毒的人已经能得到治疗。而且，在没有早期诊断的情况下，即使只是怀疑与病毒感染的人或动物有明显或可能的接触的病毒感染的情况下，就已经能用本发明的生物活性试剂开始进行预防性治疗方案。
上述及时治疗的主要优点是受病毒感染人的免疫系统很大程度上保留功能并且能够发挥本发明生物活性试剂的治疗的支持性功能。
在感染后立即发生病毒感染的细胞膜上的特征性修饰或变换可以是由于该病毒与该细胞膜接触而产生的或者是以该病毒侵入后细胞代谢的变化为基础的。这一现象导致细胞膜的修饰，其中所述修饰被本发明的生物活性试剂识别。在所述细胞表面上特异性结合的伴侣(partner)存在并不是本发明生物活性试剂与该细胞膜之间接触所需要的。这进一步表明了这样一事实，本发明的生物活性试剂在其以病毒感染细胞裂解的方式与细胞膜进行结合之后破坏了该细胞膜。这种足以杀死病毒感染细胞的活性也可以被调节，调节的方法首先是相关的生物活性试剂的组分与修饰的细胞膜表面接触，它与其它生物活性试剂之间的正协同作用被引发或占了优势，一起形成了生物活性平稳增加的生物活性复合物。
本发明所述的正协同性，还可进一步得到促进和/或增加。可通过以下途径达到这一效果，即该生物活性试剂不仅要由一种特定组蛋白和/或它的生物活性组分组成，而且由所选数量的各种不同组蛋白和/或它的生物活性部分组成。
用本发明的生物芯片能够确定组蛋白和组蛋白样的多肽和/或它们的生物活性序列对于各种病毒感染的细胞的生物活性，从而得到相应各种患者的个性化的活性特征全貌。
以下所述的实验说明了本发明示例性的生物活性试剂的效果。
下列附图示出了所做的实验并表明组蛋白在实验中确实杀死了病毒感染的细胞。具体地说，这些实验显示
图1爱泼斯坦-巴尔病毒(Epstein-Barr-Virus，EBV)感染的人B淋巴细胞在用重组的人组蛋白H1.3(rhH1.3)培养之后的分级存活率对以微摩尔表示的该组蛋白浓度。
在图1中，使用了EBV(爱泼斯坦-巴尔病毒)感染的人B淋巴细胞。在不同浓度的rhH1.3(重组的人组蛋白H1亚型3)存在下培养病毒感染细胞之后，可以观察到病毒感染细胞的裂解和相关的杀伤。
杀伤所述细胞所需要的组蛋白H1的量较小。在组蛋白H1.3的浓度小到1μM时，超过50％的细胞可以被裂解。浓度大约为2μM时，该病毒感染细胞全部被杀死。因此，组蛋白H1.3的治疗浓度范围是在0.5-2.0μM之间。
该细胞裂解可以由组蛋白在该细胞膜水平上的作用来解释，特别是对于已经由该病毒感染而被修饰的磷脂双层。意外的是，本来只在细胞核内发现的组蛋白也能同样地在许多细胞(其中包括病毒感染细胞)的质膜中存在。这也表明了组蛋白H1对特异性病毒蛋白的结合具有高的亲和性，并表明了组蛋白H1在病毒复制循环中起着重要的作用。
如组蛋白的外源蛋白加到细胞膜中会破坏膜的完整性，使可溶的蛋白、离子和其它细胞组分能够不可控制地脱离该细胞并继而杀伤这些细胞。
组蛋白加到该细胞膜中可以由抗原来介导，因而在该细胞表面上存在的抗原就能充当该组蛋白的结合伴侣。
在靶细胞受到病毒感染后，它此时在该病毒控制下的细胞周期中可产生病毒特异性以及细胞特异性抗原。所述抗原竖在该细胞表面，并作为抗原存在。在被EBV感染的情况下合成EBNA抗原。在体外实验中可能会显示出组蛋白H1具有高的亲和性地结合那些蛋白。
人们还可想到的是组蛋白与细胞膜结合的发生不牵连到典型的受体。所述病毒侵入细胞可能修饰该细胞膜从而使组蛋白与它结合并继而可使细胞裂解。
细胞杀伤与组蛋白浓度的特征依赖关系(对数作图)是正协同效应的指征。这意味着该裂解行为是在结合了细胞的组蛋白达到了某一阈值浓度之后才开始的。出现这种情况后，促进了另外组蛋白的结合和加速了该细胞的裂解。相同效果也可预期从不同类型组蛋白如组蛋白H2、H3和H4的同种组蛋白溶液得到，同样也可从不同种的组蛋白混合物得到。
病毒感染细胞的裂解是高度特特异性的。未感染的细胞是不会被组蛋白裂解的或者只能很少被组蛋白失能。
下面的图2和3是阴性对照，显示了组蛋白对于未感染的淋巴细胞的作用是相当轻微的，这是外周血单个核细胞(PBMC)的情况。
图2与人伯氏淋巴瘤(Daudi)的爱泼斯坦-巴尔病毒核抗原(EBNA)阳性细胞比较的未感染外周血单核细胞(PBMC)的杀伤率对以微摩尔表示的、范围在0-10μM的组蛋白rhH1.3的浓度。
从该曲线[y＝0.03x2+x]的斜率小可以推断，与产生EBV感染的Daudi细胞系的伯氏淋巴瘤细胞的杀伤速率曲线[y＝0.4x2+3x]具有相当徒斜率特征的细胞比较，未感染的外周血单个核细胞(PBMC)受到的影响明显小。
图2的曲线显示，组蛋白H1.3浓度依赖性的病毒感染细胞的致死率呈抛物线形增加。与在EBV感染的B细胞(图1)中所用的条件相比较，未感染的外周血单核细胞(PBMC)在大约10μM的高组蛋白H1.3浓度下的杀伤只有大约10％。在同样条件下，大约有70％的Daudi细胞已被裂解。
图3与人急性髓细胞白血病(AML)细胞系(U-937)的细胞比较的未感染外周血单个核细胞(PBMC)的分级存活率对以微摩尔表示的、范围在0-7μM的该组蛋白的浓度。
图1中在组蛋白rhH1.3的浓度为7μM时PBMC的分级存活率还是75％，而急性髓细胞白血病(AML)细胞系的细胞100％被灭活。致癌性病毒如HTLV-1可引起白血病。在此例子中，与EBNA-阳性伯氏淋巴瘤细胞(图2)相类似，组蛋白的裂解作用显然与该细胞的生长阶段无关。这些细胞即使经前述的病毒感染已经变成淋巴瘤细胞或白血病细胞也能被识别和裂解。
相反，植物凝集素(PHA)激活的正常T-细胞的存活率大致在与外周血淋巴细胞存活率相同的范围内。
凝集素属于该病毒脂质膜的糖蛋白家族，负责将病毒粘附到细胞表面并因此被认为是病毒中最具毒性的致毒因子。在细胞生物学中，PHA常被用来刺激外周血淋巴细胞。
在这里所示的实验中，证据表明，组蛋白的生物活性不是以选择性地抗PHA激活的细胞为目标的。
可以得出这样的结论，即所得的结果已强有力地表明，具体而言，由该病毒对细胞的感染所诱导的细胞膜进行特异性修饰时，组蛋白结合的选择性是暂时的。尽管如此，该组蛋白的结合看来与病毒类型和受感染细胞的类型无关并且该作用发生在DNA病毒(如EBV)以及RNA病毒(如HIV)的成员中是令人惊讶的。
对于免疫系统的细胞，例如T和B淋巴细胞，也已经进行了试验。后者较敏感，并在EBV感染后也易于用组蛋白H1将它杀死(图1)。受EBV长期感染可导致恶性伯氏淋巴瘤的产生。在这样恶性阶段的细胞中加入组蛋白也能诱导细胞裂解(图2)。
这些实验证实，病毒感染的细胞被组蛋白H1识别和灭活与感染的消退时间无关。对于EBV感染，用组蛋白H1处置会得到快速诊断(例如诊断血液成分)并能在伯氏淋巴瘤(Daudi)或传染性单核细胞增多症(Pfeifferglandular fever，发否(氏)侏热)发展之前迅速得到治疗。对于EBV感染，直到现在仍然缺乏早期诊断的手段或有效治疗的方案。
而且，组蛋白的应用对于病毒诱导的白血病的诊断和治疗提供了新的可能性。
各种蛋白都具有各自的活性中心或活性区域，这都是它们特异性的目的所要求的。因此，对于病毒感染的细胞的诊断和治疗，不仅能使用天然的或重组产生的组蛋白，而且也能使用改性的组蛋白、组蛋白样的多肽或其活化的部分。对于后者来说重要的是生物活性中心要保持完整无缺。组蛋白的共价修饰包括磷酰化、乙酰化、核糖基化或泛蛋白化。
生物芯片的应用表明了病毒感染细胞的诊断有了一种可能性。生物芯片是已排列在固体基质上的小型测试位点的聚集(又称微阵列)。生物芯片可以同时进行许多分析测试并因而有利于高通量测试。生物芯片能在几秒钟内处理数千个生物反应。使用特殊设计的光学探测系统可以定位阳性反应，即结合位点。
在本发明中，各种不同的组蛋白类型和亚型、共价修饰的组蛋白、组蛋白样的多肽或其生物活性部分可以与生物芯片连接，用来作为病毒感染细胞的结合锚(anchor)。从而能够评价众多患者的不同细胞与试剂的不同组分之间的亲和性，其目的是由此来确定病毒感染是否存在。所述生物活性试剂与所述生物芯片的结合类型可以通过PEG序列、寡肽、具有末端半胱氨酸的寡肽、金粒来介导，或者通过特异性抗体来介导。
权利要求
1.与早期诊断和/或预防性治疗病毒感染的活细胞特别有关的生物活性试剂，其中它的生物活性是选择性地针对所述病毒感染细胞的细胞膜，所述病毒感染细胞的细胞膜在病毒感染后已以特征性的方式被修饰，其中所述生物试剂含有至少一种组分或由一种组分制成，所述组分选自由组蛋白、共价修饰的组蛋白、组蛋白样的多肽和组蛋白样的肽所组成的一组物质。
2.根据权利要求1的生物活性试剂，其中所述生物活性试剂是组蛋白H1或其生物活性部分。
3.根据权利要求2的生物活性试剂，其中所述生物活性试剂是重组的组蛋白H1或至少一种重组的人组蛋白H1-亚型H1.0，H1.1，H1.2，H1.3，H1.4，H1.5，H1.t，H1.x或它们的生物活性部分。
4.根据权利要求1的生物活性试剂，其中通过所述试剂的相似或不同生物活性组分之间的协同作用能够达到在被修饰的细胞膜位点杀死病毒感染细胞的生物活性的足够程度，与所述生物活性试剂的非聚集形式比较，所述试剂的相似或不同生物活性组分一同形成的生物活性复合物具有较高的生物活性。
5.根据权利要求1的生物活性试剂，其中所述细胞膜的修饰特征在于所述细胞内的病毒，而所述试剂的生物活性与所述细胞膜特征性的修饰或退变无关，其中所述的修饰是所述病毒类型特征性的。
6.根据权利要求1的生物活性试剂，其中所述病毒感染细胞代表免疫系统的细胞。
7.根据权利要求6的生物活性试剂，其中所述病毒感染细胞是T-淋巴细胞和/或B-淋巴细胞。
8.根据权利要求1的生物活性试剂，其中所述病毒为RNA病毒。
9.根据权利要求1的生物活性试剂，其中所述病毒为DNA病毒。
10.根据权利要求8的生物活性试剂，其中所述病毒为猿猴免疫缺陷(SI)病毒或人免疫缺陷(HI)病毒或反转录病毒并且其中所述感染的细胞为所述免疫系统的细胞。
11.根据权利要求10的生物活性试剂，其中所述免疫系统的细胞为T细胞。
12.根据权利要求9的生物活性试剂，其中所述病毒为EB-病毒，且所述EB-病毒感染细胞为B淋巴细胞。
13.根据前述权利要求任一项的生物活性试剂用于诊断和/或治疗传感性单核细胞增多症。
14.用于诊断病毒感染细胞的生物芯片，在所述的生物芯片表面上沉积选定数量的每一种具有一种特定生物活性的不同生物活性试剂，所述生物芯片作为一种手段用于确定具体疾病的个性化特征全貌，其中所述试剂选自组蛋白、共价修饰的组蛋白、组蛋白样的多肽以及组蛋白和组蛋白样肽的生物活性组分。
15.根据权利要求14的生物芯片，其中所选的生物活性试剂在所述生物芯片上的固定能够通过PEG序列、寡肽、具有N末端半胱氨酸的寡肽、金或抗体来实现。
全文摘要
本发明涉及生物活性试剂，具体说，是涉及对于病毒感染的活细胞进行早期诊断和/或预防性治疗的生物活性试剂，其疗效对于该病毒感染细胞的细胞膜是选择性的，该活细胞在病毒感染之后以特征性的方式被修饰，其中所述的生物活性试剂包括选自组蛋白、共价修饰的组蛋白、组蛋白样多肽和组蛋白样肽。所述生物活性试剂包括重组的人组蛋白H1或至少一种H1亚型(H1.0，H1.1，H1.2，H1.3，H1.4，H1.5，H1.t，H1.x)或其活性部分。通过所述试剂相似或不同的生物活性组分的协同作用可以获得在病毒感染细胞被修饰的细胞膜位点足以杀死病毒感染细胞的生物活性剂量，同时与所述生物活性试剂的非聚集形式比较，所述试剂的相似或不同生物活性组分一同形成的生物活性复合物具有较高的生物活性。在所述的生物芯片表面上沉积选定数量的每一种具有一种特定生物活性的不同生物活性试剂所述生物芯片作为一种手段用于确定具体疾病的个性化特征全貌，其中所述试剂选自组蛋白、共价修饰的组蛋白、组蛋白样多肽以及组蛋白的组蛋白样多肽的生物活性组分。
文档编号A61P31/12GK101065140SQ200580022753
公开日2007年10月31日 申请日期2005年3月29日 优先权日2004年5月7日
发明者雷恩尔·克拉斯 申请人:西姆拜奥泰克股份有限公司, 费城健康与教育公司