专利名称：肝癌早期诊断的标志物基因ctcfl及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及分子生物学和基因工程领域，具体地，本发明涉及一种人类肝癌相关基因CTCFL(CCCTC-BINDING FACTOR-LIKE)作为早期肝癌诊断标志物方面的用途。
背景技术：
目前我国有慢性肝炎患者约1200万例，每年死于肝病约30万，其中50％为原发性肝癌，约占全世界肝癌死亡人数的45％左右。绝大多数与HBV、HCV感染有关。肝癌发病率在我国居2-3位，主要在青壮年男性发病，在华东地区的发病率明显高于其他地区，近年来，有持续上升趋势。在上海，肝癌的发病率居第三位，仅次于肺癌和胃癌。最新资料显示这个比例还有继续上升的趋势。现在，肝癌，特别是肝炎病毒引起的肝癌已经严重危害了我国人民生命安全。因此，非常有必要对肝癌发生的分子机制作深入的研究。
随着人类基因组测序的完成，基因组学的研究重点已经转移到以解析基因功能为主的功能基因组学研究。功能基因组学的重点是以疾病为中心，全力解决人类疾病相关基因研究中的重大科学问题。肝癌在我国素有“国病”之称，它愈后效果之差使得对于肝癌的早期诊断的研究变得尤为重要。
CTCFL基因定位于人类染色体20q13.31上。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供CTCFL基因作为肝癌早期诊断标志物的作用。
为解决上述技术问题，本发明提供了一种蛋白多肽作为早期肝癌诊断标志物方面的应用，所述蛋白多肽具有与SEQ ID NO2所示氨基酸序列至少70％同源性的序列。
本发明还提供了一种多核苷酸序列作为早期肝癌诊断标志物方面的应用，所述的多核苷酸是具有SEQ ID NO1所示的编码序列，或者至少与SEQ ID NO1中的83-2074位核苷酸至少有70％同源性的序列，或者在中度严紧条件下与SEQ ID NO1所示序列杂交的序列。
本发明还提供了一种用于诊断和检测早期肝癌的试剂盒，所述试剂盒含有下列(I)-(V)的序列或者它们的连续片断，(I)SEQ ID NO1所示的编码序列；(II)与SEQ ID NO1中位核苷酸序列具有至少有70％同源性的序列；(III)在中度严紧条件下与SEQ ID NO1所示序列杂交的序列；(IV)具有与SEQ ID NO2所示氨基酸序列至少70％同源性的序列；(V)含有SEQ ID NO2序列的多肽。
本发明还提供了一种用于诊断和检测早期肝癌的生物芯片，所述生物芯片的载体上含有下列(I)-(V)的序列或者它们的连续片断，(I)SEQ ID NO1所示的编码序列；(II)与SEQ ID NO1中位核苷酸序列具有至少有70％同源性的序列；(III)在中度严紧条件下与SEQ ID NO1所示序列杂交的序列；(IV)具有与SEQ ID NO2所示氨基酸序列至少70％同源性的序列；(V)含有SEQ ID NO2序列的多肽。
本发明由于公开了人类基因CTCFL及其编码蛋白，使得对其进行深入地研究有可能使它作为早期肝癌的诊断标志物定量检测指标，为进一步的临床推广做贡献。
图1为通过RT-PCR验证CTCFL基因在肝癌/癌旁组织中的表达谱，N为癌旁组织，C为癌组织，β-actin作为内对照；图2为通过RT-PCR验证CTCFL基因在正常肝和胎肝中的表达谱，以在睾丸组织中的表达作为对照；具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(New YorkCold SpringHarbor Laboratory Press，1989)中所属的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1组织分离(Tissue isolation)组织来源于HBV阳性并表达甲胎蛋白的原发性肝癌的手术病人(RT-PCR证实AFP在肝癌均为阳性而癌旁为阴性)。手术切除的肝脏一经离体，迅速切取病灶及周围5公分外癌旁组织，放入液氮中(-80℃)保存。癌和癌旁的诊断均以病理诊断为最终依据。
实施例2抽提组织RNA抽提RNA试剂采用TRIzol reagent(GIBCO/BRL)，该试剂是基于酸性酚一步抽提法产生的。用于抽提RNA所用的器皿和水均要进行无RNA酶处理，以保证实验中无RNA酶的环境。
将碾杵和匀浆器等器皿在200℃干烤4h，去除RNA酶，冷却；加入液氮中预冷，将组织从液氮中迅速取出，碾成粉末；用刮匙将组织放入预先加入TRIzol试剂的匀浆器中，匀浆数分钟；将匀浆后的液体转入无RNA酶的离心管中，加入氯仿后，4℃离心分层；将上层水相转入一无RNA酶的离心管中，加异丙醇，4℃离心沉淀RNA；用75％乙醇洗涤沉淀2次；用无RNA酶的去离子水溶解沉淀。抽提得RNA质量鉴定紫外分光光度计测定260/280比值(比值均在1.7~2.0)；并在MOPS甲醛变性胶中观察有无降解。
超低温保存。
实施例3cDNA的合成取总RNA2μg，OligodT16 1μ，70℃保温3min，立即冰上变性5min。加入5×buffer，DTT和50mg/L的dNTP各2μL及1μL的逆转录酶，充分混匀后，42℃2h。模板使用终浓度通常为1μg/100μL。
实施例4RT-PCR扩增以β-actin作为内对照，反应混合物中各成分为β-actin正向引物5’-TCACCCACACTGTGCCCATCTACGA-3’β-actin反向引物5’-CAGCGGAACCGCTCATTGCCAATGG-3’CTCFL正向引物5’-CTGCAAGCAGGAACGTCATA-3’CTCFL反向引物5’-TCCCCTGATCCACACTTCTC-3’以及10×Buffer、MgCl2、dNTP、Taq DNA聚合酶、cDNA模板分别为0.2、0.2、0.4、0.4、1.0、1.0、0.2、0.1和5μLoDNA模板，最后补充ddH2O使反应体系为10μL。PCR地反应条件是94℃变性5min；然后每个循环94℃30s、53℃ 30s、72℃30s，共30个循环；最后72℃延伸7min。
实施例4RT-PCR技术检测CTCFL基因在肝癌及其癌旁组织中的表达利用RT-PCR技术检测CTCFL基因在32对肝癌/癌旁组织中的表达差异，发现HBV阳性的原发性肝癌手术病人体内肝癌组织和癌旁组织中约有75％表达了CTCFL基因。结果见图1。
实施例5RT-PCR技术检测CTCFL基因在正常肝、胎肝和睾丸中的表达图2显示利用β-actin作为对照时用RT-PCR技术检测CTCFL基因在正常肝(normal liver)、胎肝(fetal liver)和睾丸中的表达。结果提示在正常肝和胎肝中，CTCFL基因通常是不表达的。结合实施例4中在HBV阳性的原发性肝癌手术病人中约有75％的病人在肝中异常表达了CTCFL基因，有理由相信，CTCFL基因可以作为诊断早期肝癌的标志物。
实施例6CTCFL基因用于制备生物芯片用获取的CTCFL基因的核苷酸序列设计引物，扩增出全长的CTCFL基因或该基因的部分片断，用作生物芯片点样的样品。
用英国的BioRobotics自动点膜仪将样品点在8×12cm尼龙膜上，每一标本点4个点，每点的DNA量约为10ng。阳性对照是重复4次点样的人β-actin基因，阴性对照是重复4次点样的λ噬菌体DNA。
含有CTCFL基因的芯片可作为肝癌的早期诊断标志物。
序列表<110>上海人类基因组研究中心<120>肝癌早期诊断的标志物基因CTCFL及其应用<130>NP-10010<160>2<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>3493<212>DNA<213>Homo sapiens<220>
<221>CDS<222>(83)..(2074)<400>11 ACGCGGTGCA CGAGGCAGAG CCCACAAGCC AAAGACGGAG TGGGCCGAGC ATTCCGGCCA61 CGCCTTCCGC GGCCAAGTCA TTATGGCAGC CACTGAGATC TCTGTCCTTT CTGAGCAATT121 CACCAAGATC AAAGAACTCG AGTTGATGCC GGAAAAAGGC CTGAAGGAGG AGGAAAAAGA181 CGGAGTGTGC AGAGAGAAAG ACCATCGGAG CCCTAGTGAG TTGGAGGCCG AGCGTACCTC241 TGGGGCCTTC CAGGACAGCG TCCTGGAGGA AGAAGTGGAG CTGGTGCTGG CCCCCTCGGA301 GGAGAGCGAG AAGTACATCC TGACCCTGCA GACGGTGCAC TTCACTTCTG AAGCTGTGGA361 GTTGCAGGAT ATGAGCTTGC TGAGCATACA GCAGCAAGAA GGGGTGCAGG TGGTGGTGCA
421ACAGCCTGGC CCTGGGTTGC TGTGGCTTGA GGAAGGGCCC CGGCAGAGCC TGCAGCAGTG481TGTGGCCATT AGTATCCAGC AAGAGCTGTA CTCCCCGCAA GAGATGGAGG TGTTGCAGTT541CCACGCTCTA GAGGAGAATG TGATGGTGGC CAGTGAAGAC AGTAAGTTAG CGGTGAGCCT601GGCTGAAACT ACTGGACTGA TCAAGCTCGA GGAAGAGCAG GAGAAGAACC AGTTATTGGC661TGAAAGAACA AAGGAGCAGC TCTTTTTTGT GGAAACAATG TCAGGAGATG AAAGAAGTGA721CGAAATTGTT CTCACAGTTT CAAATTCAAA TGTGGAAGAA CAAGAGGATC AACCTACAGC781TGGTCAAGCA GATGCTGAAA AGGCCAAATC TACAAAAAAT CAAAGAAAGA CAAAGGGAGC841AAAAGGAACC TTCCACTGTG ATGTCTGCAT GTTCACCTCT TCTAGAATGT CAAGTTTTAA901TCGTCATATG AAAACTCACA CCAGTGAGAA GCCTCACCTG TGTCACCTCT GCCTGAAAAC961CTTCCGTACG GTCACTCTGC TGCGGAACCA TGTTAACACC CACACAGGAA CCAGGCCCTA1021 CAAGTGTAAC GACTGCAACA TGGCATTTGT CACCAGTGGA GAACTCGTCC GACACAGGCG1081 CTATAAACAT ACTCATGAGA AACCCTTTAA ATGTTCCATG TGCAAGTATG CCAGTGTGGA1141 GGCAAGTAAA TTGAAGCGCC ATGTCCGATC CCACACTGGG GAGCGCCCCT TTCAGTGTTG1201 CCAGTGCAGC TATGCCAGCA GAGATACCTA CAAGCTGAAA CGCCACATGA GAACGCACTC1261 AGGTGAGAAG CCTTACGAAT GCCACATCTG CCACACCCGC TTCACCCAGA GCGGGACCAT1321 GAAAATACAT ATTCTGCAGA AACACGGCGA AAATGTCCCC AAATACCAGT GTCCCCATTG1381 TGCCACCATC ATTGCACGGA AAAGCGACCT ACGTGTGCAT ATGCGCAACT TGCATGCTTA1441 CAGCGCTGCA GAGCTGAAAT GCCGCTACTG TTCTGCTGTC TTCCATGAAC GCTATGCCCT1501 CATTCAGCAC CAGAAAACTC ATAAGAATGA GAAGAGGTTC AAGTGCAAAC ACTGCAGTTA1561 TGCCTGCAAG CAGGAACGTC ATATGACCGC TCACATTCGT ACCCACACTG GAGAGAAACC1621 ATTCACCTGC CTTTCTTGCA ATAAATGTTT CCGACAGAAG CAACTTCTAA ACGCTCACTT1681 CAGGAAATAC CACGATGCAA ATTTCATCCC GACTGTTTAC AAATGCTCCA AGTGTGGCAA
1741 AGGCTTTTCC CGCTGGATTA ACCTGCACAG ACATTCGGAG AAGTGTGGAT CAGGGGAAGC1801 AAAGTCGGCT GCTTCAGGAA AGGGAAGAAG AACAAGAAAG AGGAAGCAGA CCATCCTGAA1861 GGAAGCCACA AAGGGTCAGA AGGAAGCTGC GAAGGGATGG AAGGAAGCCG CGAACGGAGA1921 CGAAGCTGCT GCTGAGGAGG CTTCCACCAC GAAGGGAGAA CAGTTCCCAG GAGAGATGTT1981 TCCTGTCGCC TGCAGAGAAA CCACAGCCAG AGTCAAAGAG GAAGTGGATG AAGGCGTGAC2041 CTGTGAAATG CTCCTCAACA CGATGGATAA GTGAGAGGGA TTCGGGTTGC GTGTTCACTG2101 CCCCCAATTC CTAAAGCAAG TTAGAAGTTT TTAGCATTTA AGGTGTGAAA TGCTCCTCAA2161 CACGATGGAT AAGTGAGAGA GAGTCAGGTT GCATGTTCAC TGCCCCTAAT TCCTAAAGCA2221 AGTTAGAAAT TTTTAGCATT TTCTTTGAAA CAATTAAGTT CATGACAATG GATGACACAA2281 GTTTGAGGTA GTGTCTAGAA TTGTTCTCCT GTTTGTAGCT GGATATTTCA AAGAAACATT2341 GCAGGTATTT TATAAAAGTT TTAAACCTTG AATGAGAGGG TAACACCTCA AACCTATGGA2401 TTCATTCACT TGATATTGGC AAGGTGGCCC ACAATGAGTG AGTAGTGATT TTTGGATATT2461 TCAAAATAGT CTAGACCAGC TAGTGCTTCC ACAGTCAAAG CTGGACATTT TTATGTTGCA2521 TTATATACAC CCATGATATT TCTAATAATA TATGGTTTTA AACATTAAAG ACAAATGTTT2581 TTATACAAAT GAATTTTCTA CAAAATTTAA AGCTACCATA ATGCTTTTAA TTAGTTCTAA2641 ATTCAACCAA AAAATGTTTT ACTCTTATAA AAAGGAAAAC TGAGTAGGAA ATGAAATACT2701 AGATTAGACT AGAAAATAAG GAATAAATCG ATTTTACTTT GGTATAGGAG CAAGGTTCAC2761 CTTTAGATTT TTGTATTCTC TTTTAATTAT GCTCCTTGGC AGGTATGAAA TTGCCCTGGT2821 TACATTCCAT TATTGCTTAT TAGTATTTCA CTCCATAACC CTTTTTTCTG CTAAAACTAC2881 TCTTTTTATA TTTGTAAAAT AATTGGCAGA GTGAGAAGAA ACATAAAATC AGATAAGGCA2941 AATGTGTACC TGTAAGGAAT TTGTACTTTT TCATAATGCC CAGTGATTAG TGAGTATTTC3001 CCTTTTGCCA GTTGACAAGA TTTTTCCACC CTCGAGCAGC GTGAGAGATG CCTCTTTAAC
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权利要求
1.一种蛋白多肽作为早期肝癌诊断标志物方面的应用，其特征在于，所述蛋白多肽具有与SEQ ID NO2所示氨基酸序列至少70％同源性的序列。
2.如权利要求1所述的一种蛋白多肽作为早期肝癌诊断标志物方面的应用，其特征在于，所述的蛋白多肽是含有SEQ ID NO2序列的多肽。
3.一种多核苷酸序列作为早期肝癌诊断标志物方面的应用，其特征在于，所述的多核苷酸是具有SEQ ID NO1所示的编码序列，或者至少与SEQ ID NO1中的83-2074位核苷酸至少有70％同源性的序列，或者在中度严紧条件下与SEQ IDNO1所示序列杂交的序列。
4.如权利要求3所述的一种多核苷酸序列作为早期肝癌诊断标志物方面的应用，其特征在于，所述的多核苷酸编码具有SEQ ID NO2所示氨基酸序列的多肽。
5.一种用于诊断和检测早期肝癌的试剂盒，其特征在于所述试剂盒含有下列(I)-(V)的序列或者它们的连续片断，(I)SEQ ID NO1所示的编码序列；(II)与SEQ ID NO1中位核苷酸序列具有至少有70％同源性的序列；(III)在中度严紧条件下与SEQ ID NO1所示序列杂交的序列；(IV)具有与SEQ ID NO2所示氨基酸序列至少70％同源性的序列；(V)含有SEQ ID NO2序列的多肽。
6.一种用于诊断和检测早期肝癌的生物芯片，其特征在于所述生物芯片的载体上含有下列(I)-(V)的序列或者它们的连续片断，(I)SEQ ID NO1所示的编码序列；(II)与SEQ ID NO1中位核苷酸序列具有至少有70％同源性的序列；(III)在中度严紧条件下与SEQ ID NO1所示序列杂交的序列；(IV)具有与SEQ ID NO2所示氨基酸序列至少70％同源性的序列；(V)含有SEQ ID NO2序列的多肽。
全文摘要
本发明公开了人类基因CTCFL(CCCTC－BINDING FACTOR－LIKE)基因作为肝癌早期诊断的标志物方面的用途。人类CTCFL基因定位于人类染色体20ql3.31上，该基因由3493个核苷酸组成，编码664个氨基酸。CTCFL基因原本是一种仅在睾丸组织中表达的人类基因，本发明发现在肝癌患者的肝组织及癌旁组织中约有75％的个体发生了明显的表达差异，提示我们CTCFL(CCCTC－BINDING FACTOR－LIKE)基因作为肝癌早期诊断的标志物方面的用途，对其进行深入地研究有可能定量化诊断指标并进行临床推广应用。
文档编号C12Q1/68GK1951963SQ20051003068
公开日2007年4月25日 申请日期2005年10月20日 优先权日2005年10月20日
发明者黄健, 韩泽广 申请人:上海人类基因组研究中心