一种大菱鲆弧菌和鱼肠道弧菌的双重lamp检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及大菱解弧菌和鱼肠道弧菌的检测方法，具体设及大菱解弧菌和鱼肠道 弧菌的双重LAMP检测方法。
【背景技术】
[0002] 大菱解弧菌（Vibrioscophthalmi)是一种革兰氏阴性菌，呈短杆状，现已知 该菌是大菱解、牙解等重要经济鱼类的致病菌，病鱼症状为皮肤变黑、肝脏和小肠出 血、并伴有腹水和腹胀；鱼肠道弧菌（Vibrioichthyoenteri)是水产养殖中新发现的 一种革兰氏阴性致病菌，呈杆状，两端纯圆，散在或成双，无芽抱，可感染大菱解 (Scophthalmusmaximus)、牙鱼平（Paralichthysolivaceus)、石鱼棠化areiusbicoloratus) 等多种名贵海水养殖鱼类，造成严重的经济损失。
[0003] 目前，针对大菱解弧菌和鱼肠道弧菌的检测技术主要是PCR法、DNA杂交法和菌落 杂交法。然而，由于运些方法通常需要昂贵的仪器设备，且操作繁琐、费时费力，很难推广应 用。环介导等溫扩增技术（loop-mediatedisothermalamplification,LAMP)是 2000年由 Notomi等人发明的一种新的病原核酸检测技术，该技术根据祀序列设计四条特异性引物， 可W特异性识别祀序列的六个特定区域，在等溫条件下，通过BstDNA聚合酶的链置换和链 延伸作用，可W在1小时内对祀序列实现109倍的扩增，扩增产物加入巧光染料SYBRGreen I后，阳性结果变为绿色，阴性无变化，可W通过肉眼直接观察，实现了大菱解弧菌和鱼肠道 弧菌的快速检测，且操作简便，特异性好，适合基层养殖场对病原的快速检测。
【发明内容】
[0004] 本发明提供了一种大菱解弧菌和鱼肠道弧菌的双重LAMP的检测方法，目的是实 现对大菱解弧菌和鱼肠道弧菌进行特异、灵敏、快速、简便的现场检测。改善原有检测技术 繁琐、费时的弊端。 阳0化]为实现上述目的，本发明采用W下技术方案予W实现： 1、 提供2组LAMP引物序列，大菱解弧菌长度分别为49bp，43bp，18bp，2化P的核巧酸 序列，分别命名为luxR-FIP、luxR-BIP、1UXR-F3、1UXR-B3,鱼肠道弧菌长度分别为46bp， 46bp，18bp，19bp的核巧酸序列，分别命名为ToxR-FIP、ToxR-BIP、ToxR-F3、ToxR-B3 ; 2、 配置LAMP反应体系，通过LAMP反应程序对样品模板进行扩增，确定最佳反应体系和 反应条件； 3、 反应产物的鉴定：2%琼脂糖凝胶电泳；产物加入SYBRGreenI，观察反应管中颜色 变化。
[0006] 具体包括如下步骤： 1、设计LAMP引物：根据GeneBank中已知V.scophthalmi的luxR(GenBank:JN684209. 1)和V.ichthyoenteri的ToxR基因（GenBank:KT265743)作为祀 序列，通过PrimerExploreV4在线设计软件设计四条特异性引物，对于V.scophthalmi, 在FIP的Flc和F2之间添加EcorI酶切位点，在BIP的Blc和B2之间添加-TTTT-连接 子；对于V.ichthyoenteri，在FIP的Flc和F2之间在BIP的Blc和B2之间添加EcorV酶 切位点，在BIP的Blc和B2之间添加-TTTT-连接子。设计W下两组引物： !UXR-F3F3 AGCAAAAAGACCCCGCAC !uxR-B3BjCGGTTTCGTTCTCGGTGTT IuxR-FIP「iCGGCGCGCAAATACATCCAGAGAA-GAATTC- F2GACTCTCGCCCAAAAAACGT(Ecorl) IuxR-BlPBk' GTGGGATTGGTCGTGGTGGT-TTTT- B2 ATACCGTGGCGACCGATAC ToxR-FjF3 TTTGCCGCTCAGCTAACC ToxR-B3 B3 广CCAACCCCAAGTTGAGTT ToxR-FIPFlcAAGCGTAACCATGCCGCCAC-GATATC- F2TACGCGTGGTGTCTATAGCA(EcorV) Tox技-B巧 控IeAGTTCAGCCATGAAGTTGGGCA-TTrT- B2 TGOTTTATGAATTGCCCCCT 2、配制LAMP反应体系 反应体系的终浓度为：总体系25y1，包括BstDNA聚合酶1y1 (8000U/ml)， 10XBstDNABuffer2. 5y1，PCR级甜菜碱 4yU5M)，dNTPs(2. 5mMeach) 2. 5y1，DNA模版 1y1，FIP/BIP各1y1 (0. 8yM)，F3/B3各1y1 (0. 2yM)，加灭菌双蒸水使反应体系总体积 达到25Ji1。
[0007] 3、LAMP反应体系扩增：将上述反应体系进行扩增反应，反应溫度58到65°C，反应 时间为15到90min.。
[0008] 4、扩增产物检测：2%琼脂糖凝胶电泳；产物加入SYBRGreenI，观察反应管中颜 色变化。
[0009] 本发明提供的大菱解弧菌和鱼肠道弧菌双重LAMP检测方法，有W下优势： 一、灵敏度高对大菱解弧菌和鱼肠道弧菌的检测可低至12C即/ml,比普通PCR高100 倍。
[0010] 二、特异性强所需的特异性引物分别根据大菱解弧菌的IuxR基因和鱼肠道弧菌 的ToxR基因六个不同区域进行设计，特异性比常规PCR强。
[0011]S、检测时间段比左右即可获得检测结果，比普通PCR省时。
[0012] 四、仪器设备要求低不需要PCR仪等昂贵仪器，产物可W进行电泳，也可W直接 加入SYBRGreenI染料，观察颜色变化，从而确定反应与否。
[0013] 五、操作简单、结果易观察：整个检测过程不设及复杂仪器设备，产物加入 SYBRGreenI染料，可W直接用肉眼观察判断。
[0014] 综上所述，本发明具有比现有的PCR技术检测大菱解弧菌和鱼肠道弧菌的方法， 有更高的特异性、灵敏度和便捷性，并且可W在实际生产中用于现场检测，有利于及时发现 鱼类养殖中的大菱解弧菌和鱼肠道弧菌的感染。
【附图说明】
[0015] 图1双重LAMP反应体系溫度的优化（A:V.SCO地thalmi巧：V.ichthyoenteri) 反应溫度溫度梯度从左往右依次58°C到65°C8个梯度1，3, 5, 7,9,11，13,15分别为 58°C，59 °C，60 °C，ere，62 °C，63 °C，64°C，65°C的阴性对照；2,4,6,8,10,12,14,16 分别为 58°(：，59°(：，60°(：，61°(：，62°(：，63°(：，64°(：，65°(：加模版。]?:111曰'1?5'。。
[0016] 图2双重LAMP反应体系时间的优化（A:V.SCO地thalmi巧：V.ichthyoenteri) 反应时间 1-6 分别代表 15min, 30min, 45min, 60min, 75min, 90min;M为marker。
[0017] 图3双重LAMP反应的琼脂糖凝胶电泳图谱及酶切分析 A:V.scophthalmi，1 :酶切图谱，2:LAMP扩增产物，M=Marker; B:V.ichthyoenteri，l:酶切图谱，2:LAMP扩增产物M:Marker。
[0018] 图4大菱解弧菌和鱼肠道弧菌双重LAMP检测方法与普通PCR检测方法的灵敏度 比较M=Marker;l-81.2X107CFU/ml-1.2X100CFU/mlCFU/ml;N:negativecontrol。
[0019] 图5特异性结果统计只有大菱解弧菌和鱼肠道弧菌有扩增，其他菌均没有扩增。
[0020] 图6双重LAMP检测方法的应用-SYBRGreenI法显色反应对人工感染的大菱解 鱼的肝、肾、脾、血进行双重LAMP扩增，产物加入SYBRGreenI，感染组显示绿色，对照组无 变化。1，3,5,7:(感染组4:感染大菱解弧菌巧：感染鱼肠道弧菌）脾、肾、肝、血。2,4,6， 8 :(健康组）脾、肾、肝、血。
[0021] 图7双重LAMP检测方法的应用-平板计数法结合双重LAMP计数细菌的最低检 出率。
【具体实施方式】： W下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述： 实施例1 1大菱解弧菌和鱼肠道弧菌双重LAMP方法的建立 1. 1材料 dNTPs、BstDNA聚合酶（含10X缓冲液）、PCR级甜菜碱 1. 2方法 1.2. 1引物设计与合成 设计LAMP引物：根据GeneBank中已知V.scophthalmi的IuxR(GenBank:JN684209. 1) 和V.ichthyoenteri的ToxR基因（GenBank:KT265743)作为勒!序列，通过PrimerExplore V4在线设计软件设计四条特异性引物，对于V.scophthalmi，在FIP的Flc和F2之间添加 Eco